Un nuovo metodo per la Cultura e polarizzata stimolazione umani espianti mucosa intestinale

L'obiettivo generale del seguente esperimento è riprodurre la situazione in vivo per la stimolazione della mucosa intestinale umana. Questo risultato si ottiene incollando un cilindro cave sul lato apicale del tessuto, impedendo così al campione di entrare in contatto basolaterale con lo stimolo. Come secondo passaggio, viene applicato lo stimolo, consentendo l'analisi della risposta immunitaria indotta.

Successivamente, lo stimolo viene rimosso dal lato apicale del tessuto per mantenerlo vitale da 24 a 36 ore. I risultati ottenuti possono mostrare effetti differenziali di diversi ceppi probiotici in base ai dati di immunohistochimica, alla secrezione di citochine, all'analisi del profilo e così via. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la camera ASIC è che consente l'analisi di fino a 20 condizioni contemporaneamente.

Consente di estendere il tempo di coltura fino a 36 ore e fornisce materiale sufficiente per diverse analisi finali, come l'analisi D-N-A-R-N-A, l'immunohistochimica, la secrezione di citochine, ecc. Sebbene questo metodo possa offrire spunti nel campo dei probiotici, può essere impiegato anche per altre tecnologie e per studiare l'effetto di altri immunomodulatori come i farmaci biologici, i farmaci antinfiammatori e così via. Il tessuto della mucosa intestinale da soggetti sani o affetti da malattie infiammatorie croniche intestinali deve essere ottenuto durante un intervento chirurgico.

Dopo aver escisso il campione, trasferirlo rapidamente in laboratorio, mantenendolo freddo in HBSS con penicillina e streptomicina. Procedere quindi con il lavaggio del tessuto nel buffer ed eliminare qualsiasi materiale mesenterico. Successivamente, separare il layer della mucosa dalla sottomucosa utilizzando forbici e pinze sterili, mantenendo il tessuto nel buffer HBSS.

In una piastra di Petri, non è necessario mantenere completamente immerso il tessuto, ma toccare la superficie mucosale il meno possibile con la pinza. Successivamente, tagliare la mucosa in strisce larghe almeno un centimetro e lunghe il più possibile, utilizzando due bisturi in modo simile a quando si taglia del cibo. Dopo il taglio, lavare delicatamente e pulire la mucosa in HBSS privo di calcio e magnesio.

Infine, estendere le strisce di mucosa su una piastra di Petri con i lati apicali rivolti verso l'alto. Iniziare preparando del DMEM TIS fresco. Successivamente, riempire una piastra di Petri da 10 centimetri con circa 30 millilitri di F-B-S-N-A e immergere completamente un reticolo di ferro nella soluzione.

Lasciare la piastra aperta e posizionare i cilindri di plastica sulla piastra. Coprire. Ora aspirare tre microlitri di colla chirurgica in una pipetta e applicare con attenzione la colla su uno dei bordi di un cilindro di plastica, tenendolo fermo con la pinzetta. Successivamente, posizionare delicatamente il cilindro sul lato apicale della mucosa, il più vicino possibile al bordo di una delle strisce, mentre la colla si asciuga.

Distribuire da 850 a 1000 microlitri di mezzo nella pozzetta centrale della piastra per tessuti e appoggiare la griglia di ferro sui bordi della pozzetta centrale della piastra. Utilizzando due bisturi, rimuovere con cura l’eccesso di tessuto dai margini del cilindro. Sollevare ora delicatamente il cilindro con il tessuto ad esso attaccato e posizionare il lato basolaterale del tessuto sulla griglia di ferro al centro della piastra.

Successivamente, procedere con la stimolazione del tessuto. Applicare gli stimoli di interesse al centro del cilindro di plastica alla concentrazione desiderata. Non disturbare il cilindro né la superficie mucosa con la punta della pipetta e coprire uniformemente la superficie all'interno del cilindro.

Ora incubare il tessuto fino a tre ore. È anche possibile un'incubazione superiore a tre ore utilizzando un volume minore di soluzione di stimolo. Al termine dell'incubazione, rimuovere il stimolo dalla superficie apicale del tessuto, senza sostituirlo con mezzo fresco.

L'aggiunta di mezzo asfissierebbe il tessuto. Ora riempire il barattolo di ossigeno con una pressione di un'atmosfera di ossigeno al 100% per un tempo di coltura di 24 ore. Prestare sempre attenzione durante la manipolazione della bombola di ossigeno e assicurarsi di chiuderla correttamente dopo l'uso.

Dopo la coltura di stimolazione di 24 ore, utilizzare un bisturi per rimuovere con attenzione il cilindro dal tessuto, staccando delicatamente la colla. Successivamente, per saggi di IHC o immunofluorescenza, fissare il tessuto. Per analisi di espressione genica o proteica, invece, congelare rapidamente il tessuto in azoto liquido.

Successivamente, raccogliere il mezzo laterale basale per il profilo di secrezione delle citochine. Successivamente, trasferire il mezzo in un tubo da centrifuga e pellettizzare i detriti seguendo il protocollo descritto. La mucosa intestinale umana sana e quella affetta da MII sono state coltivate per almeno 24 ore, mantenendo il benessere dei tessuti.

Ciò è stato possibile solo se almeno l'85% del tempo di coltura è avvenuto in un ambiente ricco di ossigeno. La mucosa coltivata in modo convenzionale non presenta risultati altrettanto buoni. Il tessuto sano è stato quindi stimolato con salmonella invasiva pro-infiammatoria.

Dopo due ore dall'inoculazione, la distruzione dello strato superiore dell'epitelio era già visibile rispetto ai controlli. Dopo 24 ore, la degenerazione era diventata piuttosto estesa. Una discussione più approfondita sulle applicazioni sperimentali con risultati pubblicati è disponibile nel manoscritto scritto dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori che operano nel campo della gastroenterologia per lo studio dell'interazione tra ospite e microrganismi nel tratto gastrointestinale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come mantenere in coltura la mucosa intestinale umana e stimolarla topicamente. Non dimenticare che lavorare con campioni umani può essere estremamente pericoloso e le necessarie precauzioni devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.