Risonanza magnetica funzionale (fMRI) con Auditory Stimulation in uccelli canori

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un protocollo ottimizzato per la corretta visualizzazione della percezione e dell'elaborazione del suono nelle regioni uditive e di controllo del canto nel cervello degli uccelli canori. Mediante risonanza magnetica funzionale (fMRI), ciò si ottiene innanzitutto preparando stimoli uditivi di buona qualità, che possono essere inseriti in un paradigma sperimentale di tipo on-off per essere presentati all'uccello durante la scansione fMRI. Il secondo passaggio consiste nel preparare l'uccello per la scansione, anestetizzandolo inizialmente e quindi posizionandolo su un lettino adattato per animali, che viene successivamente inserito nel foro del tomografo a risonanza magnetica. Successivamente, è possibile acquisire immagini fMRI durante la stimolazione uditiva.

L'ultimo passaggio consiste nel pre-elaborare i dati di risonanza magnetica acquisiti, inclusa la normalizzazione delle immagini all'atlante del fringuello zebra. Infine, si utilizza un'analisi statistica basata sui voxel per consentire la visualizzazione dei risultati ottenuti e localizzare le attivazioni cerebrali indotte dagli stimoli uditivi. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi più comunemente utilizzati nella ricerca sui sunbird, come l'elettrofisiologia, l'istologia e le tecniche di mappatura molecolare, è che la risonanza magnetica funzionale è un metodo non invasivo in vivo, che permette di studiare lo stesso soggetto nel tempo e di analizzare l'intero cervello contemporaneamente, senza ipotesi preliminari sulla localizzazione dei substrati neurali coinvolti nel processo in esame.

Coloro che si approcciano per la prima volta a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà, poiché l'implementazione della risonanza magnetica funzionale nei volatili è molto diversa e decisamente più complessa rispetto all'uso dello stesso metodo in esseri umani o roditori. Ciò è dovuto non solo alle ridotte dimensioni del cervello di questi soggetti, ma anche alla presenza di numerose cavità aeree nel cranio, che inducono artefatti di suscettibilità; utilizzando una sequenza di eco di spin, meno sensibile a questi artefatti rispetto a una sequenza a gradiente, è possibile effettuare un'imaging funzionale dell'intero cervello del passeriforme con un'elevata specificità spaziale. L'apertura dello scanner rappresenta uno spazio ristretto che può distorcere gli stimoli uditivi.

Pertanto, per iniziare la preparazione di questo protocollo, registrare gli stimoli sonori mentre vengono riprodotti all'interno del tunnel del sistema di risonanza magnetica a sette T utilizzando un microfono a fibra ottica e verificare le distorsioni specifiche del sistema di risonanza magnetica utilizzato. Qui possiamo osservare le frequenze amplificate e attenuate, come mostrato dalle registrazioni di rumore bianco effettuate all'esterno dello scanner e nella posizione della testa dell'uccello all'interno del tunnel del magnete. Per compensare questo artificiale aumento, applicare una funzione equalizzatore a ogni singolo stimolo utilizzando un software di elaborazione audio come WaveLab, configurato come illustrato.

In questo protocollo, la funzione consiste in un kernel gaussiano con i parametri visualizzati sullo schermo. Qui, gli stimoli sonori devono essere composti da diversi motivi vocali individuali di un uccello specifico, alternati a periodi di silenzio; regolare la durata di questi periodi di silenzio in modo da mantenere identica la quantità totale di suono e silenzio in tutti gli stimoli. La lunghezza totale di ciascuno stimolo è di 16 secondi, corrispondente al tempo di acquisizione di due immagini fMRI.

Utilizzando un software di preparazione, normalizzare l'intensità di ogni brano in termini di radice media quadratica e applicare un filtro passa-alto a 400 hertz prima di integrarlo nello stimolo completo. L'esperimento può essere progettato mediante software di presentazione, utilizzando un disegno a blocchi di attivazione e disattivazione, alternando periodi di stimolazione uditiva a periodi di riposo. Ogni blocco deve durare 16 secondi, corrispondenti al tempo di acquisizione di due immagini, presentando ciascun tipo di stimolo 25 volte, il che porta all'acquisizione di 50 immagini per stimolo e per soggetto.

L'ordine di presentazione delle condizioni deve essere randomizzato all'interno e tra i soggetti. Impostare inoltre il paradigma sperimentale in modo che riceva i trigger dallo scanner. Ciò garantisce che, durante la scansione, a ogni ripetizione all'interno della sequenza FMRI, il software dello scanner invii un trigger al software di presentazione uditiva, il quale a sua volta registra il numero della scansione ed esegue il comando corrispondente.

Di seguito presentiamo un protocollo specificamente adattato all'uso di zebra finches adulti. Gli zebra finches devono essere allevati in voliere con un fotoperiodo di 12 ore di luce e 12 ore di buio e devono avere accesso a cibo e acqua ad libitum per tutta la durata dello studio. Il numero minimo di individui per esperimento è 15.

Questo numero tiene conto della sensibilità della risonanza magnetica funzionale in eco di spin e della variabilità biologica inter-individuale naturale dei fenomeni misurati nell'esperimento. Per prepararsi all'esperimento, innanzitutto collegare la maschera per il becco al dispositivo di controllo dei gas mediante tubi di plastica e installarla sul lettino della risonanza magnetica di un sistema MR da sette T. Aprire entrambe le bombole di ossigeno e azoto e accendere il dispositivo di controllo dei gas.

Accendere anche il sistema controllato con retroazione e il dispositivo di flusso d'aria calda. Successivamente, anestetizzare il fringuello zebra con il 3% di isoflurano in una miscela di ossigeno e azoto, introducendo il becco nella maschera e tenendo fermo il capo fino a quando l'uccello non è completamente anestetizzato. Ciò può essere verificato tirando delicatamente la zampa.

Quando l'uccello è completamente sedato, l'arto non verrà ritratto. Inoltre, gli occhi dell'uccello saranno chiusi. Introdurre una sonda per la temperatura cloacale per monitorare la temperatura corporea durante l'esperimento e posizionare un sensore pneumatico sotto l'addome per controllare la frequenza respiratoria.

Quindi posizionare una giacca per immobilizzare il corpo dell'uccello per tutta la durata dell'esperimento. Mantenere la frequenza respiratoria tra 40 e 100 respiri al minuto e mantenere costante la temperatura corporea a 40 gradi. Se la frequenza respiratoria è troppo bassa o troppo alta, regolare il livello di anestesia di conseguenza.

Se il problema persiste, l'esperimento deve essere interrotto e l'animale deve essere rimosso dall'apparato. Per favorire il recupero, posizionare altoparlanti dinamici non magnetici su entrambi i lati della testa del fringuello di zebra e collegarli all'amplificatore. Assicurarsi che i cavi degli altoparlanti siano diretti lontano dalla sonda di temperatura, poiché ciò potrebbe influenzare la lettura della temperatura.

Quando troppo vicino, posizionare la bobina RF superficiale sulla testa del fringuello zebra. Successivamente, posizionare il fringuello zebra al centro del magnete. Infine, ridurre il livello di anestesia a 1,5% di ISO fluorurato prima della scansione.

Per iniziare la scansione, determinare innanzitutto la posizione del cervello nel magnete. Acquisire un set di immagini preliminari a singola fetta con gradiente eco in piani sagittale, orizzontale e coronale, nonché immagini preliminari a multiple fette utilizzate successivamente per il posizionamento delle scansioni funzionali. Quindi ridurre il rumore dei gradienti aumentandone i tempi di rampa a 1000 microsecondi.

Successivamente, preparare un'acquisizione rapida con rilassamento potenziato, noto anche come sequenza fMRI pesata in T2 RARE. Quindi prescrivere 15 sezioni sagittali che coprono quasi l'intero cervello. Ora selezionare il protocollo uditivo nel software di presentazione per assicurarsi che il software di presentazione uditiva non perda alcun trigger proveniente dallo scanner.

Avviare prima il protocollo uditivo. Successivamente, una volta caricato completamente il protocollo, iniziare la sequenza FMRI. Ogni esperimento FMRI deve essere preceduto dall'acquisizione di 10 immagini fittizie per consentire al segnale di raggiungere uno stato stazionario prima di iniziare la stimolazione uditiva.

Al termine dell'acquisizione, azzerare. Riempire i dati fino a 64 per 64 per determinare la qualità dei dati ed esaminare preliminarmente i risultati. Utilizzando lo strumento funzionale.

Nel software ParaVision, calcolare la risposta bold differenziale tra tutti i blocchi di attivazione e il livello di base. Se non si osserva alcuna attivazione nelle aree uditive primarie, è probabile che l'uccello non abbia udito o elaborato gli stimoli uditivi a causa di problemi tecnici o del livello di anestesia. È necessario verificare l'allestimento e ripetere la misurazione.

Dopo l'acquisizione funzionale, eseguire una sequenza anatomica pesata in T2 3D rare nello stesso orientamento delle precedenti scansioni fMRI. Quindi riempire questi dati fino a 256 × 256 × 256.

Rimuovere infine il fringuello zebra dal lettino della risonanza magnetica e lasciarlo riprendere dallo stato anestetico in una gabbia sotto una lampada riscaldante. Normalmente, il risveglio del fringuello zebra dall'anestesia con ISO fluorinato richiede meno di cinque minuti. Dopo pochi minuti, l'uccello tenterà di alzarsi in piedi e, una volta completamente ripreso, si poserà su un ramo invece di restare seduto sul fondo della gabbia, pronta per l'avvio dell'elaborazione dei dati.

Per prima cosa, convertire i dati MR in formato analyze o nifty. Successivamente, prima di avviare l'elaborazione dei dati in SPM, è necessario adattare i dati FMRI dei passeriformi moltiplicando la dimensione del voxel per 10. Poiché il software di analisi FMRI è stato sviluppato per elaborare dati FMRI acquisiti su esseri umani, il metodo più semplice consiste nell'aumentare artificialmente la dimensione del voxel dei dati FMRI degli uccelli utilizzando il software MRI Crow.

Si noti che questa regolazione non influenza i dati stessi. Non viene applicato alcun ricampionamento né altre modifiche ai dati. Successivamente, i dati acquisiti vengono pre-elaborati.

Utilizzando l'SPM, in primo luogo si riallineano i dati fMRI e si coregistra il dataset anatomico 3D alla serie temporale fMRI. Successivamente si normalizzano i dati 3D e la serie temporale fMRI COREGISTRATA al cervello del fringuello zebra, secondo l'Atlante MRI.

Applicare la matrice di trasformazione al dataset FMRI e lisciare i dati con un kernel gaussiano di 0,5 millimetri. Successivamente, eseguire un’analisi statistica basata sui voxel in SPM8, prima a livello individuale degli uccelli, seguita da un’analisi a livello di gruppo. Infine, per visualizzare i risultati e localizzare le attivazioni funzionali, proiettare la mappa parametrica statistica sull’atlante del fringuello di zebra, ovvero l’atlante tridimensionale ad alta risoluzione del cervello del fringuello di zebra; le coordinate stereotassiche utilizzate nell’analisi descritta dei risultati FMRI del fringuello di zebra sono state progettate per questo esperimento presso il laboratorio di Bioimaging, il dataset dell’atlante MRI.

Le delimitazioni del cervello e quelle dei nuclei sono disponibili gratuitamente tramite il sito web mostrato qui. Qui viene mostrata una vista laterale di una rappresentazione tridimensionale dell'emisfero sinistro, con strutture delimitate dall'atlante proiettate sulla sua sezione midsagittale. Qui possiamo vedere un esempio di risposta BOLD fMRI nel campo L della regione uditiva primaria e nelle adiacenti regioni uditive secondarie, evocate da diversi stimoli uditivi rispetto alla condizione di riposo.

I valori di T sono codificati per colore in base alla scala mostrata nella figura, e vengono visualizzati solo i voxel in cui il test T si è rivelato significativo. Questo è un altro esempio di un esperimento di FMRI nei fringuelli zebra. Le immagini mostrano risposte selettive al canto del proprio uccello nella regione cerebrale area XMLD e HVC.

I numeri sotto le immagini indicano le coordinate in millimetri rispetto alla linea mediana. Il segno positivo indica che le sezioni e i risultati statistici provengono dall'emisfero destro. Il protocollo descritto in questo video può essere facilmente adattato per applicazioni in altri uccelli canori, come gli storni.

Questo è un esempio dei risultati di un esperimento di risonanza magnetica funzionale. In un merlo, la figura mostra le attivazioni indotte da stimoli uditivi rispetto al riposo nello stesso individuo attraverso le stagioni. L'implementazione e l'ottimizzazione della risonanza magnetica funzionale nei passeriformi apre nuove prospettive di ricerca nel campo dello studio degli uccelli canori.

È già stato dimostrato essere una tecnica preziosa per l'analisi sperimentale di complessi processi sensoriali, motori e cognitivi alla base della comunicazione vocale in questi modelli animali. Inoltre, grazie alla sua natura non invasiva e all'approccio su tutto il cervello, la risonanza magnetica funzionale (FMRI) può essere utilizzata come metodo complementare rispetto ai metodi locali e invasivi più comunemente impiegati. Il numero crescente di esperimenti di FMRI effettuati sui SUNBIRDS dimostra la sua applicabilità a domande di ricerca cognitiva; un ulteriore sforzo futuro dovrebbe essere compiuto per estendere ulteriormente gli esperimenti di risonanza magnetica al di là dell'elaborazione uditiva. Un processo che rimane attivo sotto anestesia consiste nell'utilizzo di soggetti svegli, abituati al protocollo di imaging.

Questo potrebbe offrire nuove possibilità di ricerca in cui gli uccelli possono partecipare attivamente a esperimenti di interazione elettromagnetica e in cui l'attenzione degli uccelli può essere controllata sperimentalmente.