L'effetto sinergico di luce visibile e Gentamicina su

L'obiettivo generale della seguente procedura è validare sperimentalmente il potenziamento dell'efficacia della gentamicina indotto dalla luce visibile su Pseudomona aerogen in soluzione. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando la coltura batterica sperimentale. Nel secondo passaggio, i batteri vengono illuminati in presenza o in assenza di trattamento antibiotico.

Infine, i campioni vengono raccolti dalla coltura nell'arco di un periodo di 24 ore e successivamente vengono quantificate le unità formanti colonie nella coltura cellulare a ciascun punto temporale. In definitiva, è possibile valutare l'effetto dell'illuminazione sulla suscettibilità batterica all'eliminazione mediante trattamento antibiotico. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia in vivo delle infezioni, poiché l'illuminazione aumenta l'efficacia del trattamento antibiotico.

La dimostrazione della procedura sarà effettuata da Anna Resnick, una studentessa magistrale del mio laboratorio. Iniziare coltivando la coltura batterica di interesse nel mezzo di crescita appropriato. Qui, il ceppo gram-negativo P. aeruginosa, PAO1, viene coltivato in brodo Luria a 37 gradi Celsius per diciotto ore.

Successivamente, centrifugare le cellule per cinque minuti a circa 3.145 ×g e a temperatura ambiente. Quindi rimuovere il sopranatante e risospendere i batteri in brodo Luria al 10%. Far ricrescere le cellule per altre due ore in brodo Luria a 37 gradi Celsius per consentire alla coltura di rientrare nella fase stazionaria. Dividere quindi la sospensione batterica in due gruppi, aggiungendo la gentamicina a uno dei due gruppi.

Ora posizionare ciascuna delle colture su agitatori magnetici e accenderli. Successivamente, suddividere un laser a onde continue nd YAG, oppure in alternativa un laser a impulsi Q-switched nd YAG, in due percorsi ottici per illuminare le colture non appena inizia l'illuminazione. Iniziare a prelevare campioni di 20 microlitri dai gruppi di controllo e da quelli trattati con antibiotico ogni circa due ore per 24 ore.

Il giorno successivo diluire in maniera seriale i campioni ottenuti. Ad esempio, per questo esperimento, i batteri sono stati diluiti otto volte di un fattore 10 in volumi di inoculo di 200 microlitri. Successivamente, piastrare la diluizione su brodo luria in piastre di agar e incubare i campioni tutta la notte a 37 gradi Celsius dalla mattina seguente.

Determinare il numero di unità formanti colonie o CFU per piastra per ogni trattamento, quindi calcolare la riduzione logaritmica delle CFU come illustrato qui. Si noti che y indica i valori delle unità formanti colonie a ciascun punto temporale esattamente al momento della misurazione. CFU indica l'unità formante colonie e C indica le CFU riscontrate nel campione di controllo al tempo iniziale.

Inoltre, le unità di UFC per millilitro corrispondono al numero di colonie moltiplicato per il fattore di diluizione, diviso per il volume di inoculo. Qui viene mostrata una rappresentazione schematica dell'allestimento basato su laser, in cui un laser a onda continua NDA o un laser Q-switched viene suddiviso in due percorsi mediante uno splitter ottico 50/50. Entrambi i campioni sono posizionati su un agitatore.

Questa immagine mostra il setup sperimentale in cui il laser viene suddiviso tra due provette per sottoporre entrambe le provette a condizioni identiche. Una coltura viene trattata con antibiotici e l'altra, di controllo, non viene trattata. I batteri vengono quindi esposti ai laser per 24 ore.

Questo grafico mostra l'illuminazione efficace sulla crescita di p aerogen con una luce laser a onda continua o con un laser a commutazione Q rispettivamente in presenza o assenza di trattamento antibiotico nei campioni di controllo, senza esposizione alla luce. Non si è verificata alcuna riduzione della vitalità cellulare, indipendentemente dal fatto che le colture ricevessero o meno antibiotici, suggerendo che i batteri sono resistenti alla gentamicina; inoltre, il trattamento con il laser da solo non ha influenzato la crescita cellulare. Tuttavia, nelle colture trattate sia con il laser che con l'antibiotico, la vitalità batterica è stata ridotta di diversi ordini di grandezza.

L'effetto più evidente è stato misurato dopo 24 ore, durante le quali la combinazione di un laser a onda continua o a commutazione Q ha ridotto la vitalità delle cellule batteriche di otto ordini di grandezza rispetto ai gruppi di controllo trattati solo con antibiotico o solo con luce. Questi dati suggeriscono una soluzione per il trattamento dei batteri resistenti agli antibiotici. Pertanto, i puntini in questa figura rappresentano i punti di diffusione della luce per facilitare la somministrazione simultanea di illuminazione laser diffusa e trattamento antibiotico attraverso un catetere inserito nel tessuto infettato dai batteri.

L'ultimo grafico dello spettro di assorbimento intorno a 532 nm dimostra chiaramente che sia il ceppo batterico p aerogen sia l'antibiotico gentamicina sono trasparenti a questa lunghezza d'onda, rendendo tale lunghezza d'onda una scelta valida per il trattamento combinato. La tecnica presentata ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia e della medicina per esplorare l'efficacia di questo approccio, anche nei confronti di biofilm e sistemi organici. Non dimenticare che lavorare con microrganismi pseudomona orgen può essere estremamente pericoloso, quindi durante l'esecuzione di questa procedura si dovrebbe sempre adottare un'adeguata tecnica asettica e utilizzare un ambiente e strumenti sterilizzati.