Name: Leffetto sinergico di luce visibile e Gentamicina su Pseudomonas aeruginosa Microrganismi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Scopri come la luce visibile potenzia l'efficacia della gentamicina contro Pseudomonas aeruginosa. Questo metodo combina fototerapia e antibiotici per ridurre la viabilità batterica di otto ordini di grandezza.

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1. Coltura batterica <ol><li> P. Gram-negativi aeruginosa ceppo PAO1 sono state coltivate in Luria Broth (LB) a 37 ° C per 18 hr. </li><li> La coltura di cellule è stato quindi centrifugato a 7500 rpm (giri al minuto) per 5 minuti e il surnatante è stato rimosso. </li><li> I batteri sono stati risospesi in 10% LB e ri-crescere per un altro 2 ore per permettere alla cultura di rientrare fase stazionaria. </li><li> La sospensione batterica è stata poi divisa in due gruppi: nel primo gruppo (2 tubi) sono stati aggiunti nessun antibiotico, nel secondo gruppo abbiamo aggiunto l&#39;antibiotico gentamicina (50 mcg / ml). </li></ol> 2. Determinazione delle unità formanti colonie (CFU) <ol><li> Per determinare la vitalità cellulare 20 campioni microlitri sono stati prelevati da l&#39;esperimento ogni 2 ore circa entro il termine di 24 ore. Diluizioni seriali dei campioni sono state fatte e placcato su piastre di LB agar ed incubata per una notte a 37 ° C. </li><li> Per ciascun trattamento, i CFU per ogni piattaformae stata determinata e stato effettuato un confronto tra i periodi di tempo e vari trattamenti. La riduzione login CFU è stato calcolato come descritto in Eq. (1): Entra riduzione = Logu-logC [CFU / ml] Dove U è il valore delle unità formanti colonie ad ogni tempo; CFU è l&#39;unità formanti colonie mentre le unità di CFU / ml pari a: CFU / ml = (numero di colonie x fattore di diluizione) / (volume inoculato) E C è la CFU individuata nel campione controllo in fase di avviamento. U notare che designa il formanti colonia Fattore all&#39;istante di misura. </li><li> Il fattore di diluizione è il numero di diluizioni mentre in ciascuna di esse la concentrazione dei batteri è stata ridotta di un fattore 10. Il volume inoculato era sempre 200 microlitri ed è relativo alla dimensione della nostra provetta. </li></ol> Quindi per riassumere il punto di vista di concentrazione, la gentamicina antibiotico era a concentrazione di 50 ug / ml. Per quanto riguarda i batteri, fino alla fine delil processo che abbiamo avuto complessivamente 8 diluizioni. Ogni diluizione era di un fattore 10 ed è stato fatto in tubi da 200 microlitri. Il punto di partenza era di 20 pl di campioni aggiunti nel tubo 200 microlitri (e quindi la concentrazione iniziale era 20/200C 0 = 0.1C0 con C 0 è la concentrazione iniziale in 20 pl di campioni) e la concentrazione finale è stato ridotto di 8 ordini di grandezza a causa delle diluizioni 8. 3. Illuminazione <ol><li> CW laser Nd: YAG (lunghezza d&#39;onda di 532 nm e potenza ottica media di 200 mW) è stata suddivisa in due percorsi ottici con ottica 50% / 50% divisore di fascio. Il diametro del raggio era di circa 10 mm. La durata di esposizione era di 24 ore. </li><li> Q-switched pulsato Nd: YAG laser (lunghezza d&#39;onda di 532 nm, potenza media di 300 mW e potenza ottica massima di 2,5 MW) è stato diviso in due percorsi ottici utilizzando 50% / 50% divisore di fascio. Il diametro dello spot è di 6 mm. La larghezza degli impulsi del laser Q-switched era 6 nsec e la frequenza di ripetizione era 15Hz. Glidensità di potenza media era di 106 mW / cm 2 e la densità di potenza di picco era 8,83 kW / mm 2. La durata di esposizione era di 24 ore. </li></ol> Si noti che la sospensione batterica agitata durante l&#39;irraggiamento e fu mantenuta in condizioni di coltura appropriati per una crescita batterica (in tutte le provette c&#39;era Luria Broth mezzo per permettere ai batteri di crescere).

<ol><li>Feuerstein, O., Persman, N., Weiss, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxic+Effect+of+Visible+Light+on+Porphyromonas+gingivalis+and+Fusobacterium+nucleatum%3A+An+In+Vitro+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Phototoxic Effect of Visible Light on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum: An In Vitro Study.</a> Photochemistry and Photobiology. 80, 412-415 (2004).</li>
<li>Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+470-nm+light+kills+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+%28MRSA%29+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Photomed.+Laser+Surg%22%5BJournal%5D)">Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro.</a> Photomed. Laser Surg. 27, 221-226 (2009).</li>
<li>Guffey, J. S., Wilborn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+bactericidal+effects+of+405-nm+and+470-nm%5BTitle%5D)+AND+%22Photomed.+Laser+Surg%22%5BJournal%5D)">In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm.</a> Photomed. Laser Surg. 24, 684-688 (2006).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Friedman, H., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+Staphylococcus+aureus+strains+to+broadband+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of Staphylococcus aureus strains to broadband visible light.</a> Photochem. Photobiol. 85, 255-260 (2008).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+Mechanism+for+visible+light+induced+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A possible Mechanism for visible light induced wound healing.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 40, 509-514 (2008).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Gedanken, A., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible+light-induced+killing+of+bacteria+as+a+function+of+wavelength%3A+Implication+for+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Visible light-induced killing of bacteria as a function of wavelength: Implication for wound healing.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 42, 467-472 (2010).</li>
<li>Feuerstein, O., Ginsburg, I., Dayan, E., Veler, D., Weiss, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Visible+Light+Phototoxicity+on+Porphyromonas+gingiwalis+and+Fusobacferium+nucleaturn%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Visible Light Phototoxicity on Porphyromonas gingiwalis and Fusobacferium nucleaturn.</a> Photochemistry and Photobiology. 81, 1186-1189 (2005).</li>
<li>Nussbaum, E. L., Lilge, L., Mazzulli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+630-%2C+660-%2C+810-%2C+and+905-nm+laser+irradiation+delivering+radiant+exposure+of+1-50+J%2Fcm2+on+three+species+of+bacteria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Laser+Med.+Surg%22%5BJournal%5D)">Effects of 630-, 660-, 810-, and 905-nm laser irradiation delivering radiant exposure of 1-50 J/cm2 on three species of bacteria in vitro.</a> J. Clin. Laser Med. Surg. 20, 325-333 (2002).</li>
<li>Dadras, S., Mohajerani, E., Eftekhar, F., Hosseini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+Photoresponses+of+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+to+514%2C+532%2C+and+633+nm+Low+Level+Lasers+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Different Photoresponses of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa to 514, 532, and 633 nm Low Level Lasers In Vitro.</a> Current Microbiology. 53, 282-286 (2006).</li>
<li>Stover, C. K., Pham, X. Q., Erwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1%2C+an+opportunistic+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen.</a> Nature. 406, 952-964 (2000).</li>
<li>Hamblin, M. R., Demidova, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+low+level+light+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+SPIE%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of low level light therapy.</a> Proc. SPIE. 6140, 1-12 (2006).</li>
<li>Krespi, Y. P., Stoodley, P., Hall-Stoodley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+disruption+of+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Laser disruption of biofilm.</a> Laryngoscope. 118, 1168-1173 (2008).</li>
<li>Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Zalevsky, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+laser+light+enhancement+of+susceptibility+of+bacteria+to+gentamycin+antibiotic%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct laser light enhancement of susceptibility of bacteria to gentamycin antibiotic.</a> Opt. Commun. 284, 5501-5507 (2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La fototerapia è stata un campo di ricerca multidisciplinare avanzata negli ultimi anni emergono come un approccio promettente per il trattamento di numerose malattie. In questo contesto l&#39;uso della luce nella gamma visibile è stata ampiamente studiata. Per esempio, si è scoperto che le ferite infette possono essere guariti più efficacemente esponendoli a luce intensa per scopi di sterilizzazione. Il meccanismo di azione di questo approccio è stato dimostrato di essere attraverso l&#39;induzione di radicali dell&#39...

<table><tbody><tr><td>Brodo Lauria</td><td>Difco</td><td>241420</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>231710</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;effetto sinergico di luce visibile e gentamicina su<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; microrganismi

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Recentemente ci sono state diverse pubblicazioni sul effetto battericida della luce visibile, la maggior parte di loro sostenendo che parte blu dello spettro (400 nm-500 nm) è responsabile per l&#39;uccisione di vari agenti patogeni 1-5. L&#39;effetto fototossica di luce blu è stato suggerito di essere il risultato di specie reattive dell&#39;ossigeno luce-indotti (ROS) di formazione per fotosensibilizzanti batteriche endogene che per lo più assorbono la luce nella regione blu 4,6,7. Ci sono anche segnalazioni di effetti biocidi del rosso e del vicino infrarosso 8 così come la luce verde 9. Nel presente studio, abbiamo sviluppato un metodo che ci ha permesso di caratterizzare l&#39;effetto di verde ad alta potenza (lunghezza d&#39;onda di 532 nm) Q-switched luce continua (CW) e ad impulsi (QS) su Pseudomonas aeruginosa. Con questo metodo abbiamo anche studiato l&#39;effetto di luce verde in combinazione con il trattamento antibiotico (gentamicina) sulla vitalità dei batteri. P. aeruginosa è acCOMUNI noscomial patogeno opportunista che causa varie malattie. Il ceppo è abbastanza resistente a diversi antibiotici e contiene molti predetto AcrB / Mex-tipo RND multidrug sistemi di efflusso 10. Il metodo utilizzato fase stazionaria batteri Gram-negativi a vita libera (P. aeruginosa ceppo PAO1), coltivate in Luria Broth (LB) medio esposto a Q-switched e / o CW laser con e senza l&#39;aggiunta del gentamicina antibiotico. La vitalità cellulare è stata determinata in punti temporali diversi. I risultati ottenuti hanno mostrato che il trattamento laser da solo non ha ridotto la vitalità cellulare rispetto al controllo non trattato e che il trattamento gentamicina sola solo portato a una riduzione 0,5 log nella conta vitale per P. aeruginosa. Il laser combinato e trattamento gentamicina, tuttavia, hanno comportato un effetto sinergico e la vitalità di P. aeruginosa è stato ridotto di 8 log di. Il metodo proposto può essere ulteriormente attuaretato attraverso lo sviluppo di catetere come dispositivo in grado di iniettare una soluzione di antibiotico nell&#39;organo infetto mentre simultaneamente illuminando la zona con luce.

La configurazione basata laser viene presentata schematicamente nella figura 1. La prima condizione sperimentale utilizzato un CW laser Nd: YAG avente lunghezza d&#39;onda di 532 nm (la seconda armonica della Nd: YAG) e della potenza ottica media di 200 mW. Questo fascio è stato diviso in due percorsi ottici utilizzando ottica 50% / 50% divisore di fascio tale che ciascun fascio scissione aveva potenza di 100 mW. Il diametro del raggio era di circa 10 mm e quindi la densità di potenza era di circa 100 m...

Mostriamo che un dispositivo biomedicale sviluppato comporta il trattamento laser basato visibile continua o pulsata che è combinato con il trattamento antibiotico (gentamicina), determina una statisticamente significativo effetto sinergico che porta a una riduzione della vitalità<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; PAO1, da 8 diario di rispetto alla sola terapia antibiotica.

L&#39;effetto sinergico di luce visibile e Gentamicina su<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Microrganismi

Recentemente sono state pubblicate diverse ricerche sull'effetto battericida della luce visibile, la maggior parte delle quali sostiene che la parte blu dello spettro (400 nm-500...

L'obiettivo generale della seguente procedura è validare sperimentalmente il potenziamento dell'efficacia della gentamicina indotto dalla luce visibile su Pseudomona aerogen in soluzione. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando la coltura batterica sperimentale. Nel secondo passaggio, i batteri vengono illuminati in presenza o in assenza di trattamento antibiotico.Infine, i campioni vengono raccolti dalla coltura nell'arco di un periodo di 24 ore e successivamente vengono quantificate le unità formanti colonie nella coltura cellulare a ciascun punto temporale. In definitiva, è possibile valutare l'effetto dell'illuminazione sulla suscettibilità batterica all'eliminazione mediante trattamento antibiotico. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia in vivo delle infezioni, poiché l'illuminazione aumenta l'efficacia del trattamento antibiotico.La dimostrazione della procedura sarà effettuata da Anna Resnick, una studentessa magistrale del mio laboratorio. Iniziare coltivando la coltura batterica di interesse nel mezzo di crescita appropriato. Qui, il ceppo gram-negativo P. aeruginosa, PAO1, viene coltivato in brodo Luria a 37 gradi Celsius per diciotto ore.Successivamente, centrifugare le cellule per cinque minuti a circa 3.145 ×g e a temperatura ambiente. Quindi rimuovere il sopranatante e risospendere i batteri in brodo Luria al 10%. Far ricrescere le cellule per altre due ore in brodo Luria a 37 gradi Celsius per consentire alla coltura di rientrare nella fase stazionaria. Dividere quindi la sospensione batterica in due gruppi, aggiungendo la gentamicina a uno dei due gruppi.Ora posizionare ciascuna delle colture su agitatori magnetici e accenderli. Successivamente, suddividere un laser a onde continue nd YAG, oppure in alternativa un laser a impulsi Q-switched nd YAG, in due percorsi ottici per illuminare le colture non appena inizia l'illuminazione. Iniziare a prelevare campioni di 20 microlitri dai gruppi di controllo e da quelli trattati con antibiotico ogni circa due ore per 24 ore.Il giorno successivo diluire in maniera seriale i campioni ottenuti. Ad esempio, per questo esperimento, i batteri sono stati diluiti otto volte di un fattore 10 in volumi di inoculo di 200 microlitri. Successivamente, piastrare la diluizione su brodo luria in piastre di agar e incubare i campioni tutta la notte a 37 gradi Celsius dalla mattina seguente.Determinare il numero di unità formanti colonie o CFU per piastra per ogni trattamento, quindi calcolare la riduzione logaritmica delle CFU come illustrato qui. Si noti che y indica i valori delle unità formanti colonie a ciascun punto temporale esattamente al momento della misurazione. CFU indica l'unità formante colonie e C indica le CFU riscontrate nel campione di controllo al tempo iniziale.Inoltre, le unità di UFC per millilitro corrispondono al numero di colonie moltiplicato per il fattore di diluizione, diviso per il volume di inoculo. Qui viene mostrata una rappresentazione schematica dell'allestimento basato su laser, in cui un laser a onda continua NDA o un laser Q-switched viene suddiviso in due percorsi mediante uno splitter ottico 50/50. Entrambi i campioni sono posizionati su un agitatore.Questa immagine mostra il setup sperimentale in cui il laser viene suddiviso tra due provette per sottoporre entrambe le provette a condizioni identiche. Una coltura viene trattata con antibiotici e l'altra, di controllo, non viene trattata. I batteri vengono quindi esposti ai laser per 24 ore.Questo grafico mostra l'illuminazione efficace sulla crescita di p aerogen con una luce laser a onda continua o con un laser a commutazione Q rispettivamente in presenza o assenza di trattamento antibiotico nei campioni di controllo, senza esposizione alla luce. Non si è verificata alcuna riduzione della vitalità cellulare, indipendentemente dal fatto che le colture ricevessero o meno antibiotici, suggerendo che i batteri sono resistenti alla gentamicina; inoltre, il trattamento con il laser da solo non ha influenzato la crescita cellulare. Tuttavia, nelle colture trattate sia con il laser che con l'antibiotico, la vitalità batterica è stata ridotta di diversi ordini di grandezza.L'effetto più evidente è stato misurato dopo 24 ore, durante le quali la combinazione di un laser a onda continua o a commutazione Q ha ridotto la vitalità delle cellule batteriche di otto ordini di grandezza rispetto ai gruppi di controllo trattati solo con antibiotico o solo con luce. Questi dati suggeriscono una soluzione per il trattamento dei batteri resistenti agli antibiotici. Pertanto, i puntini in questa figura rappresentano i punti di diffusione della luce per facilitare la somministrazione simultanea di illuminazione laser diffusa e trattamento antibiotico attraverso un catetere inserito nel tessuto infettato dai batteri.L'ultimo grafico dello spettro di assorbimento intorno a 532 nm dimostra chiaramente che sia il ceppo batterico p aerogen sia l'antibiotico gentamicina sono trasparenti a questa lunghezza d'onda, rendendo tale lunghezza d'onda una scelta valida per il trattamento combinato. La tecnica presentata ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia e della medicina per esplorare l'efficacia di questo approccio, anche nei confronti di biofilm e sistemi organici. Non dimenticare che lavorare con microrganismi pseudomona orgen può essere estremamente pericoloso, quindi durante l'esecuzione di questa procedura si dovrebbe sempre adottare un'adeguata tecnica asettica e utilizzare un ambiente e strumenti sterilizzati.

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