Name: Tecnica chirurgica per la consegna del midollo spinale per le terapie: Dimostrazione di procedura a Gottinga nel maialino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Impara una tecnica chirurgica per la consegna sicura di terapie geniche e cellulari nel midollo spinale utilizzando un modello animale. Questo metodo migliora la precisione del targeting e la sicurezza per applicazioni cliniche.

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Ringraziamo la Divisione Emory University di personale Animal risorse per cure veterinarie. Fonti di finanziamento sono: ALS Association, Dipartimento della Difesa, e Neuralstem, Inc.

1. Animal uso Procedure dimostrato qui sono stati approvati dal Animal Care Emory University Istituzionale ed uso Committee (IACUC). Femmina maialino Gottinga peso circa 15-20 kg vengono utilizzati. 2. Anestesia Gli animali sono a digiuno di circa 12 ore prima dell&#39;intervento. Animale sedazione e induzione dell&#39;anestesia costituiti da un cocktail di ketamina intramuscolare (35 mg / kg), Acepromazine (1,1 mg / kg), e atropina (0,04 mg / kg). Gli animali vengono quindi intubato e mantenuto in ossigeno e 1-3% isoflurano anestesia generale. A questo punto, il dorso e la testa di ogni animale è rasata. Profondità di anestesia è monitorato dal personale veterinario. Assenza di riflessi interdigitali, della cornea e delle palpebre, così come la frequenza cardiaca e respiratoria, pulsossimetria, diretta / indiretta della pressione arteriosa, di fine espirazione di anidride carbonica misure, e il tono muscolare / risposta a stimoli nocivi vengono utilizzati per monitorare la profondità<html> di anestesia. 3. Posizionamento Gli animali vengono portati alla sala operatoria e collocato in una posizione prona su un telaio su misura progettata per imitare il posizionamento dei pazienti su un tavolo spinale Jackson chirurgico. Il telaio utilizza cinghie regolabili che sono posti sotto il busto e al bacino dell&#39;animale, permettendo l&#39;addome per appendere libera e, quindi, minimizzando pressione sull&#39;addome e sul petto e conseguente venoso epidurale (Figura 1). La struttura fornisce anche immobilizzazione esterna della colonna vertebrale per la procedura 1. Inoltre, gli animali vengono posti su una riscaldata ricircolo pad per mantenere la temperatura corporea e una vena marginale dell&#39;orecchio cateterizzato per somministrazione di fluidi e ogni somministrazione di farmaci necessaria durante la chirurgia. Infine, il campo chirurgico viene preparato con alcool e soluzione Chlorhexadine o Betadine e teli chirurgici vengono posizionati sul campo operatorio. le &quot;&gt; 4. Laminectomia L&#39;incisione cutanea circa 10-15 cm è eseguita e la muscolatura paravertebrale è sezionato al largo della colonna vertebrale bilateralmente. Successivamente, una dorsale multilivello laminectomia viene eseguita. I processi lamina e spinoso di tre sovrastante vertebre C3-C5 o L2-L4 segmenti vengono rimossi utilizzando rongeurs e un trapano chirurgico. 5. Il posizionamento del Derrick spinale Chiediamo Derrick spinale il dispositivo progettato per la fornitura di (genica e cellulare), le terapie in 2-5 midollo spinale. Discussione dettagliata sulla progettazione e l&#39;evoluzione di questo dispositivo può essere trovato su Riley et al., 2011 4. Per fissare il dispositivo al paziente, posti percutanee sono posti attraverso incisioni cutanee 1 centimetro sopra e sotto l&#39;incisione primaria e montato alla lamina sopra e sotto l&#39;incisione primaria. Successivamente, due divaricatori integrati sono collegati al four percutanee posti sopra e sotto il sito di incisione per esporre la zona della colonna vertebrale che ha subito laminectomia. 6. Apertura Dural Con l&#39;ausilio di un utensile Woodson dentale e una lama 11, un 2,5 centimetri incisione viene effettuata attraverso la dura, esponendo il midollo spinale. La dura madre viene riflessa dallo strato piale utilizzando sutura 4-0 Nurolon e fissata alla muscolatura paravertebrale profonda. Tortini chirurgici sono posti negli estremi rostrale e caudale dell&#39;apertura. Questi forniscono una barriera parziale flusso di fluido cerebrospinale e anche fornire un bersaglio sicuro per il chirurgo per posizionare ventose senza danneggiare il cavo. Negli esseri umani, sotto ingrandimento microscopio chirurgico, la superficie piale è sezionato a questo punto. A causa di limitazioni tecniche, questa procedura non è necessaria o fattibile negli animali. 7. Iniezioni midollo spinale e spostamento laterale del Derrick spinale per iniezione supplementares Immediatamente prima di iniezioni, un bolo di metilprednisolone (125 mg, IV) viene somministrato per prevenire midollo spinale gonfiore. A questo punto, il sistema ferroviario piattaforma è attaccato e le sponde laterali siano regolate in base alla lunghezza appropriata. La gondola è top-caricati sui 2 bar e l&#39;unità Z è montato sul giunto cardanico. Successivamente, la cannula caricato viene posto sul microdrive. Utilizzando il giunto universale sulla piattaforma microiniezione, gli angoli coronale e sagittale vengono regolate per garantire una traiettoria ortogonale alla superficie delle iniezioni spinali seguire il posizionamento della cannula. L&#39;ago è posizionato di conseguenza mediale alla zona dorsale voce principale (DREZ). Il DREZ è identificato con lente di ingrandimento 3.5X chirurgica e penetrato su una traiettoria ortogonale alla superficie del cavo in un punto &lt;1 mm medialmente. Negli esseri umani, un pre-operatorio MRI fornisce una linea di base o valutazionef dimensioni del midollo spinale per la pianificazione operativa. Inoltre, lo spessore del midollo spinale viene misurata per determinare la profondità del bersaglio del corno ventrale. La sospensione viene infusa a una profondità di 4 mm dal contatto piale. Una flangia di plastica Ultem serve come un tappo sulla superficie pia per evitare che l&#39;ago avanzare più profondo desiderato. Una volta che la punta dell&#39;ago sia posizionata verso il bersaglio, il manicotto metallico esterno rigido è tirato, lasciando il tubo flessibile esposto. Una volta completata l&#39;iniezione, l&#39;ago rimane in posizione ancora per 1 min per impedire il reflusso cella il tratto iniezione cannula. La cura è presa per evitare vascolarizzazione superficie leggera regolazione del microdrive o lateralità o rostro-caudale. Alcuni sanguinamento dai siti di penetrazione possono verificarsi. Quando il sanguinamento quali si incontra, polpette di micro sono posti sul sito della puntura sanguinamento e di aspirazione viene applicato a loro per favorire sangue dal Penetr cannulazione del sito e prevenire la formazione nel midollo. Ciò consente affidabile per il sangue di coagulare. Cauterizzazione viene evitata in quanto è la pressione diretta. Dopo la rimozione dell&#39;ago, l&#39;apparato stereotassico viene trasferito al sito bersaglio successivo lungo l&#39;asse rostro-caudale, separati da 2 o 4 mm o come necessarie per evitare vasi sanguigni visibili sulla superficie dorsale del midollo spinale. Questo processo viene ripetuto tante volte come proposto in un dato studio. 8. Floating Cannula Una cannula di infusione personalizzata di diametro ridotto è utilizzato per le iniezioni. La cannula è costituito da un ago da 30 gauge smussato della lunghezza fissa collegata ad un 30-gauge silastic tubo flessibile di lunghezza variabile. L&#39;estremità distale è dotato di una serratura Hamilton luer che è collegato a una pompa microiniettore. Il tubo prossimale silastic è ensheathed entro un 24-gauge cannula rigida esterna che posti sulla estremità prossimale della flangia ago di iniezione. Questa flangia entrambi i sedilila cannula esterna e serve come arresto di profondità per l&#39;ago da iniezione. Per ogni iniezione, il volume appropriato di una sospensione terapeutica è infuso con un utilizzando un pre-calibrato Minj-PD microiniettore pompa (Tritech Research, Inc., Los Angeles, CA) ad una velocità di 5 microlitri al minuto. 9. Chiusura Una volta che tutte le iniezioni sono state effettuate, il derrick spinale viene delicatamente rimosso e le incisioni vengono chiuse in quattro strati. La dura madre è chiusa con un 4,0 Nurolon punto, in maniera stagna. 0 sutura Vicryl viene usato per lo strato muscolare profondo. Fascia viene poi chiuso con 0 sutura Vicryl anche in maniera stagna. Il derma è infine chiuso con 2,0 Vicryl, con un punto in esecuzione. Chiusura della pelle viene completata usando un 3-0 sutura in nylon. 10. Recupero e gestione del dolore Gli animali vengono estubati e monitorati per 2 ore di seguito il recupero anestesia. Successivamente, gli animali vengono trasferiti individuale cetà e controllati almeno una volta al giorno per il consumo alimentare, la defecazione e la minzione. Per la gestione del dolore, un cerotto transdermico Fentanil (75 mcg) è cucito con punti metallici sul retro dei capi per i tre giorni di analgesia post-operatoria. Inoltre, Buprenorfina (0,05 mg / kg, BID, IM) può essere somministrato anche per un massimo di tre giorni dopo l&#39;intervento. 11. Risultati e Esiti Rappresentante Osservazioni cliniche e il comportamento vengono eseguite prima dell&#39;intervento chirurgico e poi registrato nei giorni da 1 a 7 e con frequenza settimanale finché endpoint in base al disegno dello studio. Dati comportamentali sono raccolte per valutare la morbilità neurologica come descritto in precedenza 6. Funzione sensoriale è valutata la presenza o assenza di una risposta al ritiro stimolo meccanico alle dita degli arti anteriori e posteriori. Funzione del motore segue il punteggio di Tarlov (Tabella 1): 0 - paralisi, nessun movimento, 1 - tono percettibili agli arti posteriori, m leggeraovement, 2 - Movimento degli arti posteriori, ma in grado di sedersi o stare in piedi, 3 - Capacità di stare in piedi e camminare, ma atassia e per brevi periodi, 4 - recupero completo, funzione motoria normale. Sicurezza della procedura è determinata dalla capacità di un animale per tornare preoperatoria basale. Deficit neurologici transitori dovrebbero risolvere in gran parte tra il post-operatorie giorni 1 e 7, con alcune variazioni a seconda delle razze animali e la procedura (il numero di iniezioni, tra gli altri parametri). Morbilità permanente è definito da duraturi deficit neurologici che non risolvono il tempo di animali raggiungono endpoint IACUC predefinito (Figura 2).

<ol><li>Usvald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dosing+regimen+and+reproducibility+of+intraspinal+grafting+of+human+spinal+stem+cells+in+immunosuppressed+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Analysis of dosing regimen and reproducibility of intraspinal grafting of human spinal stem cells in immunosuppressed minipigs.</a> Cell Transplant. 19, 1103-1122 (2010).</li>
<li>Riley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+spinal+cord+therapeutics+delivery%3A+stabilized+platform+and+microelectrode+recording+guidance+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Stereotact.+Funct.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Targeted spinal cord therapeutics delivery: stabilized platform and microelectrode recording guidance validation.</a> Stereotact. Funct. Neurosurg. 86, 67-74 (2008).</li>
<li>Federici, T., Riley, J., Park, J., Bain, M., Boulis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+safety+validation+of+a+stabilized+viral+vector+direct+injection+approach+to+the+cervical+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Preclinical safety validation of a stabilized viral vector direct injection approach to the cervical spinal cord.</a> Clin. Transl. Sci. 2, 165-167 (2009).</li>
<li>Riley, J. P., Raore, B., Taub, J. S., Federici, T., Boulis, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platform+and+Cannula+Design+Improvements+for+Spinal+Cord+Therapeutics+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Platform and Cannula Design Improvements for Spinal Cord Therapeutics Delivery.</a> Neurosurgery. 69, 147-154 (2011).</li>
<li>Riley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cervical+spinal+cord+therapeutics+delivery%3A+preclinical+safety+validation+of+a+stabilized+microinjection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Cervical spinal cord therapeutics delivery: preclinical safety validation of a stabilized microinjection platform.</a> Neurosurgery. 65, 754-761 (2009).</li>
<li>Raore, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cervical+multilevel+intraspinal+stem+cell+therapy%3A+assessment+of+surgical+risks+in+Gottingen+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs.</a> Spine. 36, 164-171 (2011).</li>
<li>Boulis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+stem+cell+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Translational stem cell therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nat. Rev. Neurol. , (2011).</li>
<li>Riley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspinal+Stem+Cell+Transplantation+in+ALS%3A+A+Phase+I+Safety+Trial%2C+Technical+Note+%26+Interim+Safety+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Intraspinal Stem Cell Transplantation in ALS: A Phase I Safety Trial, Technical Note & Interim Safety Outcomes.</a> Neurosurgery. 71 (2), 405-416 (2012).</li>
<li>Boulis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumbar+intraspinal+injection+of+neural+stem+cells+in+patients+with+ALS%3A+results+of+a+Phase+I+trial+in+12+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lumbar intraspinal injection of neural stem cells in patients with ALS: results of a Phase I trial in 12 patients.</a> Stem Cells. 30 (6), 1144-1151 (2012).</li>
</ol>

Dr. Boulis è l&#39;inventore di dispositivi che consentono di iniezione sicura e precisa del midollo spinale umano. Neuralstem, Inc. ha acquistato una licenza esclusiva per questa tecnologia. Dr. Boulis ricevuto la parte di un invento di questa tassa, e ha i diritti per i pagamenti di canoni per la distribuzione di questa tecnologia. Altri autori non hanno nulla da rivelare.

Nonostante l&#39;approvazione a procedere con la tecnica descritta nell&#39;uomo 7-9, domande critiche devono ancora essere risolta in modo che le terapie del midollo spinale per avere successo. Una comprensione rigorosa di tolleranza del midollo spinale a iniezione intraparenchimale è necessaria per consentire la pianificazione e l&#39;esecuzione di prove di sviluppo terapie per demielinizzante, degenerativa, traumatica e malattie del midollo spinale. Attualmente, non esiste una chiara comprensione ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome dell&#39;apparecchiatura </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Derrick spinale </td><td> Neuralstem, Inc. </td><td></td><td> Neuralstem, Inc. ha acquistato una licenza esclusiva per questa tecnologia </td></tr><tr><td> Minj-PD microiniettore pompa </td><td> Tritech Research, Inc. </td><td></td><td> Su misura per questa specifica applicazione </td></tr><tr><td> Floating Cannula </td><td> Neuralstem, Inc. </td><td></td><td> Progettato su misura per questa specifica applicazione </td></tr></tbody></table>

tecnica chirurgica per la consegna del midollo spinale per le terapie: dimostrazione di procedura a gottinga nel maialino

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

Questa è una descrizione compatta visiva di una combinazione di tecnica chirurgica e dispositivo per l&#39;erogazione di (genica e cellulare) terapie nel midollo spinale. Mentre la tecnica è dimostrato nell&#39;animale, la procedura è approvato dalla FDA e attualmente utilizzato per il trapianto di cellule staminali nel midollo spinale dei pazienti con SLA. Mentre la FDA ha riconosciuto prova di principio dati sull&#39;efficacia terapeutica in modelli di roditori fortemente caratterizzati, l&#39;uso di grandi animali è considerata critica per convalidare la combinazione di una procedura chirurgica, un dispositivo, e la sicurezza di una terapia finale per uso umano . Le dimensioni, anatomia, e la vulnerabilità generale della colonna vertebrale e del midollo spinale dei suini sono riconosciuti meglio modello umano. Inoltre, il processo chirurgico di esporre e manipolare il midollo spinale e chiusura della ferita nel maiale è praticamente identico a quello umano. Noi crediamo che il modello maiale sano rappresenta una criticacal primo passo nello studio della sicurezza procedurale.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Punteggio Tarlov </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Paralisi, nessun movimento </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Tono percepibili agli arti posteriori, leggero movimento </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Il movimento degli arti posteriori, ma incapace di stare seduto o </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Capacità di stare in piedi e camminare, ma atassica e per brevi periodi </td></tr><tr><td> 4 </td><td> La guarigione completa, f...

Breve descrizione visiva della tecnica chirurgica e il dispositivo utilizzato per la consegna di (genica e cellulare) terapie nel midollo spinale. La tecnica è illustrata l&#39;animale, ma è del tutto traslabile e attualmente utilizzate per applicazioni umane.

Tecnica chirurgica per la consegna del midollo spinale per le terapie: Dimostrazione di procedura a Gottinga nel maialino

Questa è una descrizione visiva compatta di una combinazione di tecnica chirurgica e dispositivo per la somministrazione di terapie (geniche e cellulari) nel midollo spinale...

L'obiettivo generale di questa procedura è consegnare in modo sicuro e indirizzare con precisione terapie biologiche verso specifici siti intraparenchimali di interesse all'interno del midollo spinale. Questo obiettivo viene raggiunto preparando innanzitutto l'animale per l'intervento chirurgico. Successivamente, si esegue la laminectomia e si assembla il derrick spinale.Quindi si apre la dura madre e si eseguono le iniezioni intraspinali. Infine, si chiudono la muscolatura, la fascia e la cute. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano esiti relativi alla sicurezza e al targeting attraverso la raccolta di dati comportamentali e di targeting.La tecnica illustrata nel presente manoscritto prevede l'uso di una piattaforma stabilizzante e di una cannula flessibile per il rilascio di un carico biologico nel midollo spinale. I vantaggi di questo approccio risiedono nella possibilità di garantire una somministrazione precisa, sostituendo le tecniche stereotassiche standard, difficili da applicare nel midollo spinale a causa della sua mobilità. Oltre alla precisione, la tecnica offre un margine di sicurezza, tale da consentire movimenti del paziente.In questo caso, un maiale n

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