Procedure chirurgiche per un modello di Rat parziale trapianto di fegato con la ricostruzione arteriosa epatica

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un trapianto epatico ortotopico parziale in ratti come modello sperimentale riproducibile per la ricerca sui trapianti. Questo viene realizzato innanzitutto rimuovendo il fegato dal ratto donatore. Il secondo passaggio consiste nella preparazione del fegato trapiantabile ex vivo, inclusa una resezione epatica del 50%.

Successivamente, il fegato nativo del ratto ricevente viene escisso. L'ultimo passaggio consiste nell'impianto dell'innesto epatico parziale nel ratto ricevente. Infine, vengono misurati i livelli sierici di alanina aminotransferasi per valutare il danno epatocellulare all'innesto epatico dopo il trapianto.

Generalmente, le persone alle prime armi con questa procedura incontrano difficoltà a causa della complessità dell'intervento, che richiede competenze microchirurgiche avanzate. Per iniziare la procedura, posizionare il ratto donatore anestetizzato su un tappetino riscaldante dopo aver verificato mediante pizzicamento del dito del piede che l'animale è completamente anestetizzato, quindi fissare gli arti superiori utilizzando il sistema di retrazione con fissatore magnetico. Rasare il pelo su tutta l'area addominale del ratto e sterilizzare la cute corrispondente con una soluzione di iodopovidone.

Aprire l'addome mediante incisione mediana con estensioni bilaterali. Posizionare una siringa da cinque millilitri sotto la schiena del ratto in modo che la vena cava sopraepatica venga sollevata in avanti utilizzando una pinzetta a morsetto di tipo mosquito e tirare la struttura verso la testa; applicare quindi i retrattori sottocostali per aprire il campo operatorio. A causa della necessità di manipolare frequentemente i retrattori e la siringa da cinque millilitri durante l'intervento, non si utilizzano campi chirurgici intorno all'incisione. Lavorando sotto un microscopio chirurgico con un ingrandimento di 16x, dissezionare il legamento falce e il legamento triangolare sinistro a forma di otto, dividere la vena frenica sinistra e retrarre verso l'alto i lobi mediano e laterale sinistro con un batuffolo di garza umida.

Utilizzando pinze bimancate, coagulare e dividere i vasi paraesofagei tra il lobo laterale sinistro e quello anteriore. Spostare gli intestini all'esterno dell'addome, portandoli sul lato sinistro del ratto, e coprirli con una garza umida. Con una garza umida, ritrarre il lobo laterale destro verso l'alto.

Isolare la vena cava infrarenale dal tessuto retroperitoneale e legare la vena surrenale destra, che verrà sezionata successivamente appena prima del prelievo del trapianto per inserire uno stent nel dotto biliare; in primo luogo, legare il dotto biliare al livello della biforcazione dell'arteria gastroduodenale. Praticare una piccola incisione nella parete anteriore del dotto biliare a monte del punto legato, quindi, tenendo la parete anteriore dell'incisione con una pinzetta microchirurgica dritta nella mano sinistra, utilizzare una pinzetta microchirurgica curva nella mano destra per inserire uno stent nel dotto. Fissarlo con un filo di seta sei zero.

Mantenere uno dei capi tagliati del filo sul dotto biliare a una lunghezza di quattro millimetri, in modo che il filo possa essere trattenuto durante l'anastomosi successiva. Liberare la vena porta dalle vene portale e splenica legandole e sezionandole; legare e dividere l'arteria gastroduodenale. Quindi isolare l'arteria epatica comune dalla testa del pancreas fino alla sua radice.

Ruotare il fegato verso destra con bastoncini di cotone e dissezionare il legamento intorno alla parte posteriore del fegato e all'esofago al termine delle preparazioni. Per l'escissione del fegato. Rimuovere i retrattori, la pinza emostatica per il processo xifoideo e la siringa da cinque millilitri posizionata sotto la parte posteriore del ratto.

Riposizionare l'intestino nella cavità addominale. Iniettare 500 IU di eparina sodica in due millilitri di soluzione salina fisiologica attraverso la vena peniena. Circa tre minuti dopo, sostituire la siringa da cinque millilitri, le pinzette da insetto e il retra­tore, quindi legare l'arteria epatica comune in prossimità della sua radice.

Mantenere uno dei capi tagliati del filo legato per l'arteria epatica comune. A lungo dopo aver clampato la vena cava infraepatica. Vicino alla vena renale destra con una pinza emostatica di piccole dimensioni.

Clampare la vena porta con una pinza monouso per microvasi al di sotto del moncone della vena splenica. Incidere la parete anteriore della vena porta ed inserire un catetere di calibro 18 nella vena porta. Perfundere il fegato in situ con 60 millilitri di soluzione fredda di chetoglutarato di istidina e triptofano.

A una pressione idrostatica di 20 centimetri, l'acqua taglia immediatamente il diaframma, la vena cava intratoracica e la parete anteriore della vena cava infraepatica, permettendo così al soluto di perfusione di essere risciacquato fuori dal fegato. Clampare la vena cava infraepatica con una pinza per microvasi appena al di sotto del fegato. Asportare il fegato dissezionando la vena cava infraepatica.

La vena porta, il diaframma, i legamenti residui, la vena surrenale destra e l'arteria epatica comune. Posizionare il fegato escisso in una soluzione fredda di HTK all'interno di un bicchiere metallico inserito in una scatola di plastica piena di ghiaccio tritato org. Le procedure per il trapianto epatico vengono eseguite nel bicchiere metallico riempito con soluzione di HTK ghiacciata per l'applicazione di un manicotto alla vena porta: clampare il tronco venoso portale con un clamp DeBakey bulldog e posizionare il clamp in posizione di collegamento sopra il bicchiere.

Fare passare la vena porta attraverso il manicotto e clampare nuovamente la vena al insieme all'estensione del manicotto nella posizione delle 12, rivoltare la parete della vena porta sul manicotto in modo da posizionare il moncone della vena splenica all'esterno del manicotto nella posizione delle sette e fissare la vena porta con un filo di seta sei zero per inserire uno stent nell'arteria epatica. Fissare il fegato clampando entrambi i margini del diaframma con pinze ed estendere l'arteria epatica comune tenendo il filo legato con la pinza bulldog DeBakey e con forbici microchirurgiche dritte. Praticare una piccola incisione nella parete anteriore dell'arteria epatica comune con la mano sinistra.

Tenere la parete anteriore dell'incisione con una pinzetta microchirurgica dritta e, con la mano destra, inserire un stent nell'arteria epatica comune. Utilizzando una pinzetta microchirurgica curva, fissare lo stent con un filo di seta sei-zero e mantenere uno dei capi tagliati del filo lungo quattro millimetri. Lavare il fegato attraverso il catetere arterioso con cinque millilitri di soluzione HTK fredda per la resezione epatica al 50%.

Prima fissare il lobo della coordinata posteriore con una pinzetta emostatica per mantenerlo in posizione. Quindi legarlo con un filo di seta 4-0 ed escindere il lobo.

Il lobo corato anteriore viene rimosso nello stesso modo. Successivamente, ruotare la scatola di plastica di 90 gradi. Stringere il bordo destro del diaframma e la porzione sinistra del lobo mediano.

Eseguire una piccola incisione al margine superiore del confine tra le porzioni bilaterali del lobo mediale, quindi rimuovere la porzione sinistra dopo la legatura. Dopo la legatura del peduncolo con un filo di seta 4-0, rimuovere il lobo laterale sinistro e cauterizzare attentamente la superficie epatica resecata con pinze bipolari. La massa epatica è ora ridotta di circa il 50% per la plastica della vena cava sopraepatica.

Prima, fissare la posizione del fegato bloccando entrambi i margini del diaframma con una pinza emostatica. Quindi, rimuovere la parte corrispondente del diaframma per sagomare la parete anteriore della vena cava sopraepatica. Applicare 2 suture in polipropilene 7-0 dall'esterno all'interno ai due angoli come suture di trazione per l'anastomosi successiva.

In seguito, rimuovere la parete posteriore della vena cava sopraepatica. Conservare il graft epatico a quattro gradi Celsius in soluzione HTK in un bagno di acqua fredda. Preparare il ricevente per l'intervento chirurgico in modo analogo a quanto fatto per il donatore e aprire l'addome mediante incisione mediana.

Posizionare un tampone umido di garza sulla parte destra del duodeno e sull'intestino intero. Per ottenere un campo operatorio attorno alla vena cava sottoepatica, inserire i lobi laterale sinistro e mediale nella cavità sottodiaframmatica sinistra e retrarre il lobo laterale destro verso l'alto con un tampone di garza umido.

Isolare la vena cava infrarenale dal tessuto retroperitoneale legato e dividere la vena surrenale destra con garze umide e bastoncini di cotone. Ruotare il fegato verso sinistra e dissezionare il legamento intorno alla parte posteriore del fegato. Tagliare il dotto biliare appena al di sotto del ramo proveniente dal lobo caudato.

Mantenere uno dei capi tagliati del filo legato per il dotto biliare lungo quattro millimetri; legare e dividere l'arteria gastroduodenale e l'arteria epatica propria a una distanza di tre millimetri dal punto di biforcazione dall'arteria epatica comune, in modo da ottenere una struttura arteriosa ampia all'estremità dell'arteria epatica comune. Clampare la vena cava infraepatica con una pinza metallica per microvasi appena al di sopra della vena renale destra e la vena porta al livello della sua biforcazione nell'ilo epatico mediante una pinza emostatica di piccole dimensioni; clampare la vena cava sopraepatica insieme al diaframma con una pinza vascolare periferica e fissare la pinza in un blocco di argilla oleosa. Ridurre l'anestesia con isoflurano allo 0,4 percento in volume. Asportare il fegato nativo del ricevente dissezionando la vena cava sopraepatica al confine tra la vena cava sopraepatica e il fegato.

La vena porta appena sopra la punta della pinzetta per zanzare e la vena cava infraepatica leggermente al di sotto del punto medio tra il fegato e la vena renale destra. Posizionare l'innesto epatico in sede ortotopica. La ricostruzione dei vasi rappresenta la parte più difficile e importante di questa procedura.

Deve essere eseguito con molta attenzione ma rapidamente per l'anastomosi della vena cava sopraepatica mediante sutura continua. Posizionare la sutura di trazione sulla vena cava sopraepatica del ricevente dall'interno verso l'esterno utilizzando il polipropilene sette zero allegato all'angolo destro del trapianto, quindi annodare nel medesimo modo. Posizionare la seconda sutura di trazione all'angolo sinistro.

Questa sarà la prima puntura di una sutura continua. Per allargare l'anastomosi, afferrare e mantenere i punti utilizzando pinze DeBakey a ganascia a entrambi gli angoli, esercitando una trazione delicata in direzione superolaterale. Successivamente, perforare il punto all'angolo sinistro attraverso la parete del lato del graft, dall'esterno verso l'interno, vicino al nodo esterno, e suturare la fila posteriore della vena cava satia in modo intraluminale con sette-otto punti fino all'angolo destro.

Effettuare con attenzione i primi punti in modo che i lumi interni si trovino l'uno di fronte all'altro nell'angolo corretto. Far passare il polipropilene sette zero attraverso il vaso dal lato dell'innesto verso l'esterno. Suturare la fila anteriore dall'esterno verso sinistra con circa 10 punti.

Sciacquare l'interno con soluzione di Ringer lattato. Per rimuovere le bolle d'aria, eseguire l'ultima sutura vicino alla sutura di ritenzione e quindi annodarle insieme. Per la ricostruzione della vena porta, clampare la vena porta mediante un clamp per microvasi e fissare la pinza emostatica nel materiale argilloso. Successivamente, incidere la parete anteriore della vena porta appena al di sotto della ganascia della pinza emostatica.

Lavare l'interno della vena porta del ricevente e il manicotto con soluzione di Ringer lattato. Inserire il manicotto nella vena porta e fissarlo con un filo di seta di calibro sei zero disposto in senso circonferenziale. Infine, ripristinare la perfusione epatica.

Rimuovere la siringa da cinque millilitri dalla parte posteriore del ratto e aumentare la concentrazione di isoflurano allo 0,8 percento in volume per la ricostruzione epatica mediante tecnica con stent. In primo luogo, afferrare il filo dell'arteria epatica propria con pinzette emostatiche di piccole dimensioni e fissarlo nell'argilla. Quindi, clampare l'arteria epatica comune del ricevente.

Praticare una piccola incisione nella biforcazione della struttura a Y all'estremità dell'arteria epatica comune per creare un'apertura a forma di imbuto. Tenere lo stent posizionato nell'arteria epatica comune del trapianto con una pinzetta microchirurgica curva. Inserire lo stent nell'arteria epatica comune del ricevente e fissarlo con un filo di seta sei zero, legando un'estremità di questo filo insieme al filo di quattro millimetri presente sull'arteria epatica comune del trapianto, in modo che le due arterie epatiche comuni si avvicinino riducendo la tensione nel sito anastomotico.

In seguito, rilasciare il morsetto per l'anastomosi della vena cava infraepatica mediante sutura continua in modo analogo a quanto fatto per la vena cava sopraepatica, ma utilizzando punti più numerosi e con bocconi più fini. Dopo la rimozione del morsetto, aumentare la concentrazione dell'anestetico al 1,0 percento in volume per la ricostruzione del dotto biliare. Trattenere il filo del dotto biliare del ricevente con una pinza emostatica fine e fissarlo nell'argilla.

Eseguire una piccola incisione nel dotto biliare al livello appropriato in modo che il dotto biliare ricostruito non risulti troppo lungo. Inserire lo stent e fissarlo con un filo di seta sei zero. Annodare questo filo insieme al filo presente sul dotto del trapianto.

Ora tutte le procedure di ricostruzione sono terminate. Chiudere l'incisione addominale con punti di sutura in Vicryl 4-0 a filo continuo in strati. Immediatamente dopo l'intervento, trattare il ratto ricevente con un'iniezione sottocutanea di sodio sféro e buprenorfina in un totale di 1,5 millilitri di soluzione salina fisiologica.

Lasciare che il ratto si riprenda per 60 minuti in una gabbia appositamente adibita a unità di terapia intensiva, con aria calda e fornitura di ossigeno, prima di riportarlo in una gabbia normale. Tutti i ratti riceventi sono sopravvissuti fino all'eutanasia programmata per il prelievo di sangue a 1, 3, 24 e 168 ore dopo la riperfusione portale. I campioni di siero sono stati analizzati per determinare i livelli di alanina aminotransferasi, che riflettono il grado di danno epatocellulare nei trapianti di fegato dopo il trapianto.

Come mostrato in questo grafico, i livelli di LT hanno raggiunto un picco a 24 ore per poi diminuire entro i limiti normali a 168 ore. Al termine di questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire il trapianto epatico parziale in ratti come modello sperimentale riproducibile per la ricerca sui trapianti.