Dissezione, Cultura, e analisi di

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare una coltura cellulare primaria di cellule retiniche di Xenopus. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo i tessuti circostanti per esporre la retina. Il secondo passaggio consiste nell'asportare il tessuto retinico.

Successivamente, il tessuto retinico viene dissociato in singole cellule. L'ultimo passaggio consiste nel seminare le cellule retiniche su una piastra UnCloned e aggiungere flu oh 4:00 AM per l'immagine del calcio. Infine, si utilizza la microscopia confocale per rilevare l'attività del calcio nella coltura di cellule retiniche.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia dello sviluppo, della neurobiologia e della biologia cellulare, come ad esempio il ruolo del calcio e dell'attività elettrica nello sviluppo della retina, nonché l'espressione genica a livello di singola cellula. In generale, chi si approccia per la prima volta a questa procedura potrebbe incontrare difficoltà, poiché sono necessari movimenti motori fini per eseguire dissezioni tempestive e precise. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, in quanto i passaggi della dissezione risultano complessi a causa dell'essenzialità di movimenti coordinati tra mano e occhio.

Per iniziare questa procedura all'interno della cappa, preparare ed etichettare quanto segue: una piastra di Petri di plastica da 60 millimetri contenente 10 millilitri di mezzo di coltura cellulare da utilizzare come piastra per dissezione. Facoltativamente, si possono aggiungere 10 milligrammi di collagenasi B alla piastra di dissezione per ottenere una concentrazione finale di 1,0 milligrammo per millilitro, al fine di facilitare la separazione degli strati tissutali durante la dissezione di embrioni allo stadio 25 o precedenti.

Inoltre, preparare una piastra da 35 millimetri contenente due millilitri di mezzo di coltura cellulare da utilizzare come piastra di coltura, un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri vuoto da utilizzare come tubo per la dissociazione dell’espianto e un tubo conico Falcon da 15 millilitri contenente 15 millilitri.

Mezzo di coltura cellulare. Quindi preparare 2 piastre di Petri di plastica da 35 millimetri contenenti due millilitri, CMF per la dissezione, una da utilizzare come piastra di dissociazione per l'espianto, l'altra come piastra di risciacquo per l'espianto fuori dalla cappa. Preparare due piastre di Petri di plastica da 60 millimetri contenenti 10 millilitri.

0,1 XMMR, uno da utilizzare come piastra di mantenimento e l'altro come piastra gemella, e un ulteriore piatto di Petri in plastica da 60 millimetri contenente 10 millilitri di 0,1 XMMR più 0,5 milligrammi per millilitro di MS 2 22. Successivamente, aggiungere 40 microlitri di tripsina al 5% in CMF alla piastra di dissociazione dell'espianto.

Mescolare con movimenti rotatori, quindi mettere da parte. Successivamente, procedere con la dissezione utilizzando una lente stereoscopica e due paia di pinzette fini. Eseguire un taglio sagittale mediano sulla faccia ventrale dell'embrione a partire dall'estremità posteriore, proseguendo attraverso la ghiandola cementatrice nella porzione anteriore dell'embrione.

Aprire con attenzione l'embrione allargando entrambi i lati del taglio. Questo fa sì che il lato dorsale dell'embrione sia rivolto verso la piastra di dissezione. Successivamente, aprire l'ectoderma ventrale per evidenziare l'endoderma e il mesoderma.

Successivamente, rimuovere l'endoderma e il mesoderma, il primo e più grande strato di questo tessuto. L'endoderma ha un aspetto molto soffice, con cellule grandi e poca organizzazione evidente. Dopo aver rimosso questo strato, diventeranno visibili i somiti e il Noor.

Per un migliore contrasto, trasferire l'embrione in una piastra di Petri di plastica da 60 millimetri contenente 10 millilitri di mezzo di coltura cellulare e 100 microlitri di soluzione all'1% di solfato di azzurro nile e incubare per due o tre minuti. Successivamente, trasferirlo nuovamente sulla piastra per dissezione. Questo procedimento colorerà l'ectoderma, i somiti e il Noor, facilitandone l'identificazione e l'orientamento.

Concentrandosi sulla porzione anteriore dell'embrione, rimuovere con cura il Noor e qualsiasi mesoderma residuo per esporre l'encefalo e le vescicole ottiche. Una volta completamente esposti l'encefalo e le vescicole ottiche, utilizzare la pinzetta per recidere il tubo neurale e l'ectoderma sottostante appena posteriormente al cervello. Ruotare questa porzione in modo che l'ectoderma si trovi in alto.

Procedere con cautela per evitare di danneggiare le vescicole ottiche sottostanti e rimuovere con attenzione l'ectoderma. Infine, separare le vescicole ottiche dal cervello utilizzando la pinzetta per dissezionare un embrione più vecchio dello stadio 25. In primo luogo, rimuovere la porzione ventrale dell'embrione con la pinzetta nella piastra di anestetizzazione.

Per un migliore contrasto, trasferire l'embrione in una piastra di Petri di plastica da 60 millimetri contenente 10 millilitri di 0.1 XMMR e 100 microlitri di solfato di Nile blue all'1% per due o tre minuti, al fine di colorare l'ectoderma. Successivamente trasferirlo sulla piastra per dissezioni. Quindi, tenendo con cura l'embrione in posizione, rimuovere la retina o la vescicola ottica che si trova direttamente al di sotto dell'ectoderma sovrastante.

Dopo aver dissezionato la vescicola ottica o la retina, trasferirla con attenzione nella piastra di risciacquo X usando una micropipetta P100 con punta resistente agli aerosol. Prestare attenzione a non farla toccare i limiti aria-liquido. Successivamente, lasciare l'espianto a riposo per 30 secondi.

Successivamente, trasferire 80 microlitri di tripsina 0,1% in CMF dalla piastra di dissociazione dell'espianto al tubo di dissociazione dell'espianto. Dopodiché, trasferire la retina o la vescicola ottica dalla piastra di lavaggio dell'espianto al tubo di dissociazione dell'espianto, evitando il trasferimento della soluzione di lavaggio dell'espianto.

Quindi lasciare che il tessuto si dissoci in provetta di dissociazione per un'ora a temperatura ambiente. Se durante l'esperimento si devono acquisire più immagini delle cellule, applicare una griglia sul lato inferiore della piastra di coltura utilizzando piccole gocce di colla cianoacrilica. Questo permetterà di acquisire immagini delle stesse cellule nelle medesime orientazioni in diversi momenti della procedura di semina delle cellule.

Prima, rimuovere lentamente 40 microlitri della soluzione dal tubo di dissociazione dell'espianto e scartarli. Quindi utilizzare la P 100 con una punta resistente agli aerosol per trasferire lentamente le cellule nella piastra di coltura. Quando si aspirano le cellule nella piastra, pipettare lentamente e mantenere le cellule in una piccola area al centro della piastra.

Questa figura mostra un esempio dell'attività del calcio in una singola cellula durante un'ora di acquisizione di immagini. Queste figure forniscono i risultati rappresentativi di esperimenti di imaging del calcio in cellule retiniche embrionali analizzate a diverse fasi di sviluppo. In breve, i risultati mostrano che il calcio è regolato nello sviluppo, con picchi di attività a scatto alla fase 35 in termini di correlazione dell'attività del calcio con cellule positive per una sonda specifica.

Negli esperimenti sui pesci, sebbene non ci fossero differenze statisticamente significative, si è osservata una tendenza per le cellule positive a un marcatore GABAergico a mostrare livelli più elevati di attività di picchi di calcio rispetto alle cellule positive a un marcatore glutammatergico o al gene PT F1 A.A, che codifica un fattore di trascrizione correlato alla promozione del fenotipo GABAergico. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa tre ore e trenta minuti per una piastra se eseguita correttamente. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come la coltura cellulare, l'ibridazione C due o le registrazioni elettrofisiologiche possono essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quali cellule esprimono specifici marcatori fenotipici o per analizzare le registrazioni elettrofisiologiche. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come dissezionare il tessuto retinico, dissociare il tessuto retinico e seminare le cellule retiniche.