Name: In elettroporazione ovo di miRNA-based plasmidi nel tubo neurale sviluppo e valutazione di fenotipi da Injection DiI in Open-book Preparazioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Scopri l'elettroporazione in ovo di plasmidi a base di miRNA per studiare la guida degli assoni commissurali nel tubo neurale del pollo. Questo metodo consente il silenziamento genico specifico per tipo cellulare e tracciabile.

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Il lavoro nel laboratorio di ES è supportato dal Fondo nazionale svizzero della scienza. Vorremmo ringraziare il Dr. Beat Kunz per l&#39;assistenza con le riprese.

<ol><li>Chédotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo semplice, vettoriale artificiale strategia miRNA può essere utilizzato per l&#39;espressione del gene endogeno knockdown nel tubo neurale pollo. Questi strumenti funzionali offrono silenziamento genico multipla, il controllo temporale del tipo cellulare e specificità, per facilitare la spiegazione dei complessi percorsi di sviluppo. In particolare, abbiamo dimostrato l&#39;utilità di questi plasmidi nell&#39;orientamento dell&#39;assone commissurali, poiché i plasmidi possono essere utilizzati per atterramento ge...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 0,5 millimetri capillari di vetro </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Vetro ago estrattore </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Elettroporatore </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard silicone elastomero </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Tungsteno filo, 0,075 millimetri </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Perni insetti, 0,20 millimetri </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> Perni insetti, 0,10 millimetri </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> Primavera forbici </td><td> Scienza Belle Perols </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 forcipe </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Dumont N ° 55 pinze </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Veloce DiI </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> Microscopi a fluorescenza </td><td> Olimpo </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

in elettroporazione ovo di mirna-based plasmidi nel tubo neurale sviluppo e valutazione di fenotipi da injection dii in open-book preparazioni

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Commissurali DI1 neuroni sono stati ampiamente studiati per chiarire i meccanismi alla base di orientamento degli assoni durante 1,2 sviluppo. Questi neuroni sono situati nel midollo spinale dorsale e inviare loro assoni lungo traiettorie stereotipati. Assoni commissurali inizialmente proiettare ventralmente verso e poi in tutto il fondello. Dopo aver attraversato la linea mediana, questi assoni compiere una brusca virata rostrale e progetto longitudinalmente verso il cervello. Ciascuna di queste fasi è regolata dalle attività coordinate di spunti di orientamento attrattive e repulsive. La corretta interpretazione di questi segnali è fondamentale per la guida degli assoni lungo il loro percorso delimitata. Pertanto, il contributo fisiologica di una particolare molecola di guida assonale commissurali è idealmente esaminati nel contesto dell&#39;embrione vivente. Pertanto, knockdown gene in vivo devono essere controllati con precisione per distinguere attentamente attività di orientamento assone di geni che possono svolgere moltepliciruoli durante lo sviluppo. Qui, si descrive un metodo per l&#39;espressione del gene knockdown nel tubo neurale pollo in una cella di tipo-specifico, modo tracciabile. Usiamo nuovi vettori plasmidici 3 harboring cellule tipo-specifici promotori / enhancer che guidano l&#39;espressione di una proteina marker fluorescente, seguito direttamente dal miR30-RNAi trascrizione 4 (situato all&#39;interno del 3&#39;-UTR del cDNA che codifica la proteina fluorescente) ( la figura 1). Quando elettroporati nel tubo neurale in via di sviluppo, questi vettori suscitare sottoregolazione efficace di espressione genica e di esprimere proteine ​​marker luminosi fluorescenti per attivare l&#39;analisi diretta delle cellule vivendo knockdown 3. Mescolando diversi vettori RNAi prima elettroporazione permette knockdown simultanea di due o più geni indipendenti in regioni del midollo spinale. Questo consente complesse interazioni cellulari e molecolari da esaminare durante lo sviluppo, in un modo che è veloce, sattua, preciso ed economico. In combinazione con DiI tracciamento delle traiettorie assoni commissurali in open-book preparati 5, questo metodo è un utile strumento per studi in vivo dei meccanismi cellulari e molecolari della crescita degli assoni commissurali e di orientamento. In linea di principio, qualsiasi promotore / enhancer potrebbe essere utilizzato, rendendo potenzialmente la tecnica più ampiamente applicabile per studi in vivo della funzione del gene durante lo sviluppo 6. Questo video mostra prima come gestire e uova finestra, l&#39;iniezione di plasmidi di DNA nel tubo neurale e la procedura di elettroporazione. Per studiare la guida commissurali dell&#39;assone, il midollo spinale viene rimosso dall&#39;embrione come un libro aperto di preparazione, fissato, e iniettato con DiI per consentire percorsi assoni da tracciare. Il midollo spinale è montata tra coprioggetto e visualizzati usando la microscopia confocale.

Un metodo di espressione genica nel tubo neurale può essere downregulated in una cella di tipo-specifico, tracciabile modo descritto. Noi dimostrare come<em&gt; In ovo</emElettroporazione&gt; di microRNA basati plasmidi che suscitano spatiotemporally controllato interferenza RNA può essere usato per studiare commissurali guida assonale nel tubo sviluppo neurale.

In elettroporazione ovo di miRNA-based plasmidi nel tubo neurale sviluppo e valutazione di fenotipi da Injection DiI in Open-book Preparazioni

I neuroni commissurali dI1 sono stati ampiamente studiati per chiarire i meccanismi alla base della guida assonale durante lo sviluppo1,2. Questi neuroni sono...

Lo scopo di questa procedura è valutare i difetti di guida degli assoni nel tubo neurale del pollo dopo la riduzione dell'espressione genica in modo tracciabile e specifico per tipo cellulare. Questo viene ottenuto preparando uova di pollo fecondate per l'elettroporazione in ovo, creando una finestra nel guscio. Il secondo passaggio consiste nell'iniettare elettroporando costrutti di DNA che codificano per microRNA all'interno del tubo neurale.Successivamente, i midolli spinali eletroporati vengono dissecati e fissati in preparazioni a libro aperto in montaggio piano. L'ultimo passaggio consiste nell'iniettare un colorante fluorescente per visualizzare le proiezioni assonali. Infine, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per mostrare sia le cellule soggette a silenziamento genico sia per valutare gli effetti successivi sulla guida degli assoni commissurali.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è il silenziamento specifico per tipo cellulare dei geni. Per preparare i plasmidi, seguire il protocollo scritto per le istruzioni. Incubare le uova a 38,5 gradi Celsius e circa il 45% di umidità fino a quando non viene raggiunta la fase di sviluppo

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Questo video viene illustrato come visualizzare i percorsi assonale di gruppi geneticamente definita di neuroni nel midollo spinale embrionale pulcino...

Decifrare Percorsi assonale di gruppi geneticamente definito di neuroni nel tubo neurale Chick Utilizzando In ovo Elettroporazione

Elettroporazione in utero è un metodo prezioso per trasfezione delle cellule progenitrici neuronali in vivo. A seconda del posizionamento degli elettrodi e la timepoint sviluppo di elettroporazione, alcuni sottoinsiemi di cellule corticali può essere mirati. Cellule bersaglio può quindi essere analizzato in vivo o in vitro per gli effetti di alterazione genetica.

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

Elettroporazione in utero permette per la consegna rapida in un gene-spazialmente e temporalmente modo controllato nello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC). Qui descriviamo altamente adattabile a protocollo di elettroporazione utero che possono essere usati per fornire costruisce espressione in più domini embrionale del SNC, tra cui il diencefalo telencefalo, e della retina.

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

In Elettroporazione vitro del labbro inferiore Rombico di embrioni di topo Midgestation

Per valutare la funzione e la regolazione dei geni durante lo sviluppo dei neuroni dopaminergici mesencefalo, si descrive un metodo che...

In elettroporazione ovo nel mesencefalo Chick per lo Studio la funzione dei geni nello sviluppo dopaminergici Neuron

Controllare l'espansione delle cellule staminali somatiche è un freno notevole loro studio e l'uso in terapia. Qui si descrive un sistema per controllare temporalmente neurale espansione delle cellule staminali durante lo sviluppo e adulta, che può essere utilizzato per aumentare il numero di neuroni generati nel cervello di topo.

Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione o Viral iniezione stereotassica

Espressione ectopica è una tecnica per chiarire il ruolo microRNA nello sviluppo del cervello. Tuttavia, il targeting aree specifiche utilizzando in elettroporazione ovo è impegnativo. Qui vi mostriamo un modo efficiente alle regioni mesencefalo ventrale e dorsale in modo selettivo l'elettroporazione.

In Expression Ovo di MicroRNA in Ventrale Chick Mesencefalo

Vi presentiamo transgenesi transitori e silenziamento genico in Ciona intestinalis, un gruppo sorella chordate di vertebrati, utilizzando tecniche di microiniezione e elettroporazione. Tali metodi facilitano genomica funzionale in questo semplice invertebrato che dispone di caratteristiche rudimentali di vertebrati, tra cui notocorda e epiteli sensoriali della testa, e molti ortologhi di malattie associate geni umani.

Embrione microiniezione e elettroporazione in chordate<em&gt; Intestinalis Ciona</em

Abbiamo sviluppato un nuovo approccio di perdita di funzione che prevede l'introduzione e l'integrazione genomica di sequenze di micro-RNA artificiali in embrioni di pulcino utilizzando l'elettroporazione in ovo e il sistema di trasposoni Tol2. Questa tecnica fornisce una metodologia di knockdown genico robusta e stabile per gli studi sulla funzione genica durante lo sviluppo.

Approccio alla perdita di funzione nella retina embrionale del pulcino utilizzando l'espressione transgenica mediata dal trasposone Tol2 di microRNA artificiali

In questo protocollo, descriviamo come iniettare lentivirus nella cavità amniotica del topo a E7.5, portando a una trasduzione uniforme dell'intera piastra neurale, con effetti dannosi minimi sulla sopravvivenza o sullo sviluppo embrionale.

Targeting della placca neurale murina mediante nano-iniezione in utero (NEPTUNE) al giorno embrionale 7.5

Scopri l'elettroporazione in ovo di plasmidi a base di miRNA per studiare la guida degli assoni commissurali nel tubo neurale del pollo. Questo metodo consente il silenziamento genico specifico per tipo cellulare e tracciabile.

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