In elettroporazione ovo di miRNA-based plasmidi nel tubo neurale sviluppo e valutazione di fenotipi da Injection DiI in Open-book Preparazioni

Lo scopo di questa procedura è valutare i difetti di guida degli assoni nel tubo neurale del pollo dopo la riduzione dell'espressione genica in modo tracciabile e specifico per tipo cellulare. Questo viene ottenuto preparando uova di pollo fecondate per l'elettroporazione in ovo, creando una finestra nel guscio. Il secondo passaggio consiste nell'iniettare elettroporando costrutti di DNA che codificano per microRNA all'interno del tubo neurale.

Successivamente, i midolli spinali eletroporati vengono dissecati e fissati in preparazioni a libro aperto in montaggio piano. L'ultimo passaggio consiste nell'iniettare un colorante fluorescente per visualizzare le proiezioni assonali. Infine, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per mostrare sia le cellule soggette a silenziamento genico sia per valutare gli effetti successivi sulla guida degli assoni commissurali.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è il silenziamento specifico per tipo cellulare dei geni. Per preparare i plasmidi, seguire il protocollo scritto per le istruzioni. Incubare le uova a 38,5 gradi Celsius e circa il 45% di umidità fino a quando non viene raggiunta la fase di sviluppo desiderata. Per studiare la guida dell'assone dei neuroni commissurali, incubare gli embrioni per circa tre giorni fino a quando non raggiungono lo stadio di Hamburger e Hamilton da 17 a 18.

Una volta raggiunto lo stadio di sviluppo desiderato e prima che la proteina di interesse si accumuli nell'embrione, rimuovere le uova dall'incubatrice e posizionarle in modo stabile in posizione orizzontale per 20 minuti, in modo da far riposizionare l'embrione sulla parte superiore del tuorlo. Dopo che gli embrioni si sono riposizionati sulla sommità del tuorlo, estrarre le uova dall'incubatrice e pulirle con etanolo al 70%. Successivamente, posizionare un nastro lungo l'asse maggiore dell'uovo e utilizzare un bisturi per praticare un piccolo foro all'estremità più larga dell'uovo e un altro all'angolo della zona da aprire.

Quindi inserire una siringa munita di un ago da 18 gauge nel foro all'estremità arrotondata dell'uovo con un angolo di 45 gradi ed aspirare circa tre millilitri di albume, avendo cura di non danneggiare il tuorlo. Utilizzare forbici piccole tenute in posizione orizzontale per tagliare una finestra nell'uovo senza danneggiare l'embrione. Quindi sigillare la finestra utilizzando il nastro adesivo.

Infine, utilizzare un pennello per applicare della cera di paraffina fusa per sigillare il foro all'estremità arrotondata dell'uovo e sigillare eventuali crepe nell'uovo nello stesso modo. Quindi reinserire l'uovo nell'incubatrice. Ripetere il procedimento con tutte le uova da elettroporare.

Rimuovere il nastro da uno dei tuorli con finestra e stadiare l'embrione secondo Hamburger e Hamilton. Quindi utilizzare la pinzetta per sollevare le membrane extraembrionali dalla metà cordale dell'embrione nella regione in cui si trovano le principali vene vitelline destra e sinistra. Entrare delicatamente nel tronco, lacerare o tagliare le membrane con forbici a molla e spostarle verso la coda.

Ora utilizzare una leggera aspirazione per caricare la miscela di DNA da elettroporare in una microcapillare di vetro con tubo applicato. Inserire la microcapillare nel canale centrale del tubo neurale appena al di sopra degli arti posteriori e iniettare la soluzione di DNA controllando il volume di iniezione mediante aspirazione orale. Il colorante blu dovrebbe diffondersi dalla punta della coda fino al ventricolo del cervello in via di sviluppo.

Aggiungere alcune gocce di PBS sterile sulla parte superiore dell'embrione e posizionare gli elettrodi paralleli all'asse antero-posteriore dell'embrione senza toccare l'embrione o i vasi sanguigni. Successivamente, mantenere gli elettrodi fermi ed eseguire l'elettroporazione. Al termine dell'elettroporazione, rimuovere gli elettrodi e risciacquare rapidamente con acqua sterile per eliminare le proteine denaturate dall'albume dell'uovo.

Infine, aggiungere una piccola quantità di PBS sterile sull'embrione e quindi sigillare nuovamente l'uovo con del nastro adesivo. Come in precedenza, un'adeguata sigillatura è fondamentale per evitare la disidratazione dell'embrione. Successivamente, riposizionare l'embrione nell'incubatrice fino al raggiungimento dello stadio di sviluppo desiderato.

Una volta che l'embrione raggiunge lo stadio 25-26 di Hamburger Hamilton, utilizzare una pinzetta per rimuovere l'embrione dall'uovo e posizionarlo in una piastra di Petri rivestita con sil guard elastomer. Usare la pinzetta per rimuovere le membrane extraembrionali e disporre l'embrione con il lato dorsale rivolto verso il basso. A questo punto, utilizzare perni per insetti da 0,2 millimetri per distendere delicatamente l'embrione e fissarlo attraverso il collo e la coda.

Quindi fissare gli arti dell'embrione, inserendo i perni con un angolo tale da non interferire con la successiva dissezione. Illuminare la piastra contenente l'embrione dal basso in modo da poter percepire la densità dei tessuti. Utilizzare forbici a molla per aprire la cavità addominale e una leggera raschiatura con pinze per rimuovere il cuore e gli organi interni.

Quando tutti gli organi sono stati completamente rimossi, risulteranno visibili le vertebre segmentate e il midollo spinale. Successivamente, ruotare l'embrione di 180 gradi e utilizzare forbici a molla per praticare un piccolo taglio attraverso le vertebre sovrastanti il midollo spinale a livello del collo. Quindi effettuare due brevi incisioni longitudinali attraverso le vertebre su entrambi i lati del midollo spinale, dal collo fino alla coda.

Utilizzare una pinzetta per sollevare le vertebre a battente lontano dal midollo spinale, quindi staccare le vertebre in un'unica striscia verso la coda. Successivamente, allungare delicatamente l'embrione e ripuntarlo attraverso la coda e gli arti. Identificare ora le meningi del midollo spinale, che dovrebbero apparire come una linea scura e densa di tessuto tra il tubo neurale e i gangli delle radici dorsali; quindi utilizzare un ago sterile o un microbisturi fine per tagliare longitudinalmente le meningi lungo ciascun lato del midollo, dal collo fino alla coda.

Le meningi dovrebbero staccarsi facilmente dal midollo spinale grazie all'allungamento dell'embrione fissato con puntine. Infine, recidere il midollo spinale al livello dell'abbozzo dell'ala e caudalmente rispetto all'abbozzo dell'arto. Quindi utilizzare la pinzetta per sollevare il midollo spinale con un movimento rostrale-caudale, assicurandosi che rimanga immerso nel PBS First.

Stendere il midollo spinale isolato su una spatola e trasferirlo in una nuova piastra rivestita con Sylgard contenente paraformaldeide al 4% in PBS. Quindi fissare con cura il midollo spinale in senso rostrale, caudale, mediale e laterale utilizzando puntine da insetto di 0,1 millimetri per ottenere una preparazione in montaggio piatto, e incubare il paraformaldeide per 30 minuti fino a un'ora. Prestare attenzione a non sovrafissare.

Poiché ciò aumenterebbe il rumore di fondo e ridurrebbe l'efficienza della diffusione del diodo. Quindi versare con attenzione il paraformaldeide e sostituirlo con PBS. Dopo aver preparato cinque milligrammi per millilitro di fast di in etanolo, staccare la punta di una micropipetta di vetro a piccolo diametro collegata a un tubo di plastica ed aspirare la soluzione nella pipetta iet.

Inserire l'ago riempito in una piastra contenente PBS e verificare che il colorante non fuoriesca dall'ago. In caso affermativo, il diametro è troppo ampio e si deve preparare un nuovo ago. Assicurarsi che il preparato a libro aperto sia illuminato dal basso e localizzare la striscia longitudinale più densa, situata approssimativamente a un quinto della larghezza del semilibro rispetto al margine laterale; i corpi cellulari dei neuroni comessurali si trovano appena dorsalmente a questa linea scura.

Inserire la punta della micropipetta di vetro nel tessuto e, mentre si ritira l'ago, spruzzare una piccola quantità di D eye utilizzando una pipetta a bocca; ripetere rapidamente la procedura ogni 0,5 millimetri lungo tutta la lunghezza del preparato a libro aperto. Al termine delle iniezioni, utilizzare una pipetta di trasferimento per aspirare e scartare qualsiasi eccesso di di; in caso contrario, si otterrà un fondo elevato.

Ripetere la procedura per tutti i preparati a libro aperto. Quindi collocare la piastra contenente i preparati iniettati a quattro gradi Celsius per circa tre giorni, in modo da permettere al colorante di diffondersi lungo gli assoni. Trascorso questo tempo, montare i preparati seguendo le istruzioni riportate nel protocollo scritto.

Sezioni trasversali e preparati a libro aperto sono stati ottenuti da embrioni di pollo allo stadio 25-26 di Hamburger Hamilton, che erano stati eletroporati allo stadio 18 di Hamburger Hamilton. Come mostrato qui in sezione trasversale, il promotore della beta-actina induce un'espressione ubiquitaria. La freccia indica la direzione dorso-ventrale.

Questa immagine mostra un esempio di modelli di espressione delle proteine fluorescenti ottenuti dopo l'elettroporazione dei vettori plasmidici. Qui l'espressione ubiquitaria proveniente dal promotore della beta-actina è visibile in una preparazione a libro aperto. La freccia indica la direzione cordale rostrale.

Questa immagine mostra una sezione trasversale dopo elettroporazione con un costrutto contenente un enhancer di math one. Questo determina l'espressione nei neuroni di di one. Qui l'espressione proveniente dal costrutto con l'enhancer di math one è visibile in una preparazione a libro aperto.

Questa sezione trasversale mostra l'espressione proveniente dall'amplificatore di hawk A uno dopo l'elettroporazione bilaterale del costrutto. L'amplificatore di hawk A uno induce espressione specificamente nella piastra ventrale. Questa preparazione a libro aperto mostra il modello di espressione del costrutto di hawks a uno nella piastra ventrale.

Questa immagine mostra un'immagine in campo chiaro dell'applicazione dei siti di iniezione di Dai. In una preparazione a libro aperto, Dai è stato iniettato in un modello puntiforme vicino al margine laterale del libro aperto. Sul lato eletrorivelato, questa immagine mostra la visualizzazione dell'espressione di GFP nella stessa preparazione, e qui viene visualizzato Dai.

Dopo tre giorni di diffusione, i commissuri lungo le traiettorie dovrebbero essere visibili mediante microscopia a fluorescenza. Le traiettorie assonali normali cresceranno verso la lamina del pavimento, attraverseranno la lamina del pavimento, quindi piegheranno e continueranno a crescere, come mostrato qui.

Fenotipi anomali derivanti dall'abbattimento genico, come quello mostrato qui, possono essere confrontati con la traiettoria archetipica. Nell'esempio, alcuni assoni si arrestano nella piastra ventrale o compiono decisioni di svolta errate sul lato controlaterale. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante essere accurati e pazienti in tutte le fasi di iniezione e dissezione fini.

Queste richiedono un po' di pratica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come iniettare plasmidi RNAi per studiare la funzione genica durante lo sviluppo del tubo neurale in maniera specifica per tipo cellulare.