L'insetto Galleria mellonella Come un modello di infezione potente per Indagare Patogenesi batterica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di infettare le larve di insetto Galleria melanoma con batteri patogeni. Per fare ciò, le larve di insetti vengono liberate allo stadio di crescita appropriato e viene preparata una soluzione batterica. La larva ha poi infettato i batteri mediante iniezione intra emofilica o forzata La mortalità larvale viene quindi monitorata per un periodo di 48 ore.

L'analisi dei dati risultanti descrive la virulenza batterica in un modello di infezione di insetti. Gli insetti presentano il vantaggio di avere un sistema avanzato di difese antimicrobiche e, in particolare, possiedono un sistema immunitario innato complesso, quindi evitate i problemi di costo ed etici che si possono incontrare quando si utilizzano modelli di mammiferi. Gli insetti forniscono un ottimo modello alternativo per l'infezione dei mammiferi.

Lavoriamo con le larve della falena della cera maggiore Gme, che sono relativamente grandi e possono essere utilizzate per studi di infezione condotti tra 15 e oltre 37 gradi. Per imitare l'ambiente dei mammiferi, Carina NI dimostrerà la procedura di allevamento ed Elizabeth GME e Christophe Beon dimostreranno i protocolli di infezione. L'intero ciclo dall'uovo all'ultimo nelle larve stellate dura circa cinque settimane.

A 25 gradi Celsius, sono necessarie una o due settimane in più per ottenere farfalle adulte. Le farfalle maschi misurano da 10 a 15 millimetri. La falena maschio adulto è beige con deboli macchie chiare e scure.

Le farfalle femmine misurano circa 20 millimetri. Le femmine sono più scure dei maschi con un colore da marrone a grigio posto almeno 100 puy o farfalle di melanoma genetico adulto appena fuse. In una gabbia di rete metallica da cinque litri appendere nella gabbia due confezioni di carta a quattro strati per la deposizione delle uova.

Dopo due giorni, la femmina adulta depone le uova sul bordo tra le carte due volte a settimana. Metti le confezioni di carta per uova in nuove scatole di plastica per l'allevamento con griglie per far circolare l'aria. Le scatole dovrebbero contenere polline e cera d'api come fonte di cibo.

Le uova si schiudono in circa tre giorni e le piccole larve iniziano a svilupparsi nutrendosi di cera e polline per fornire un rapporto appropriato di cibo per lava. Separa regolarmente le larve in nuove scatole e rifornisci il cibo ogni due giorni. Le larve vengono allevate durante le sei fasi dello stadio delle larve.

Ogni stadio è caratterizzato dallo slittamento della capsula cranica delle larve. Quando le larve hanno raggiunto l'ultimo stadio prima della pazione, hanno smesso di nutrirsi e hanno iniziato a costruire un bozzolo di seta leggera nei loro bozzoli protettivi. Le larve riposeranno e si trasformeranno in pube. Cera.

I vermi rimangono nella fase di cacca per una o due settimane per emergere in falene adulte. Le falene adulte non bevono né mangiano. L'accoppiamento avviene e il ciclo di vita dei vermi della cera ricomincia.

Per standardizzare il test patologico, prelevare le larve durante l'ultimo stadio larvale. Durante questa fase, smettono di nutrirsi, si spostano sul coperchio della cassetta di allevamento e iniziano a produrre seta. Questa fase dura circa cinque giorni, dopodiché le larve iniziano a ridursi.

Il bozzolo diventa più denso e le larve si accumulano. In qualsiasi momento durante la fase larvale, rimuovi il bozzolo di seta nascente. Seleziona le larve di stella per ultime, che sono lunghe da due a tre centimetri e pesano da 180 a 250 milligrammi, 24 ore prima dell'infezione e mettile in una scatola vuota per farle morire di fame.

Le sospensioni di Priscilla, batteri o spore sono preparate come descritto nel documento di accompagnamento a concentrazioni finali, che vanno da 10 alle quattro unità formanti colonie per millilitro a 10 alle otto unità formanti colonie per millilitro. Ogni lava riceverà 10 microlitri di sospensione alla concentrazione desiderata Per preparare il cry one C tossina cultura B, il ceppo CI 4 0 7 trasformato con il plasmide PHTF 31 C, che trasporta il gene che codifica cry one C in 100 millilitri, terreno HCT con 10 milligrammi per millilitro, eritromicina e 30 gradi Celsius per 72 ore. Ciò consentirà la piena tossina di sporulazione, la produzione di cristalli e la liberazione nello stato di coltura.

Per purificare i cristalli dalla coltura batterica, preparare un gradiente di saccarosio in una provetta da 40 millilitri. Per prima cosa, aggiungi 17 millilitri di saccarosio al 79%. Quindi sovrapporre con cura 17 millilitri di saccarosio al 72% sopra il saccarosio al 79%.

Infine, sovrapporre da cinque a sei millilitri della coltura sporulata concentrata 10 X e chiudere la provetta, centrifugare la provetta per 14 ore a 20.000 volte G a quattro gradi Celsius per separare i cristalli dalle spore. I cristalli di tossina si depositeranno all'interfaccia del gradiente mentre le spore dense raggiungeranno il fondo del tubo. Utilizzare una pipetta per raccogliere i cristalli e quindi centrifugare 20.000 volte.

G.Dopo la centrifuga, sospendere la tavolozza di cristalli in 25 millilitri di acqua fredda e sterile per lavarla centrifugare a 8.000 volte G.Questo passaggio viene ripetuto tre volte per rimuovere tutto il saccarosio che si attacca ai cristalli. Dopo l'isolamento dei cristalli, risospendere i cristalli in cinque millilitri di acqua sterile e osservare al microscopio. Per valutare la purezza, valutare la concentrazione di proteine tossiche mediante la classica colorazione Bradford su soluzione cristallina presolubilizzata in idrossido di sodio da 50 millimolari.

La tossina può essere conservata a meno 20 gradi Celsius prima dell'uso. Successivamente, agli insetti verrà iniettata la soluzione batterica. Per ogni condizione, riempire una siringa ipodermica da un millilitro per condizione con 300 microlitri di acqua o la soluzione batterica per l'infezione di 20-25 larve.

Rimuovere le bolle picchiettando delicatamente la siringa. Quindi collegare un ago da 0,45 x 12 millimetri alla siringa. Posizionare la siringa in una pompa a siringa automatizzata con velocità impostata a un microlitro al secondo e impostare un volume di 10 microlitri.

Eseguire un'iniezione in bianco di 10 microlitri in una provetta vuota per controllare il volume iniettato. Posizionare manualmente l'insetto tra il pollice e l'indice. Quindi inserire l'ago fissato nell'iniettore nella pelle lavica o nella cuticola alla base dell'ultimo prolo e iniettare 10 microlitri di soluzione batterica.

Rimuovere con cautela l'insetto dall'ago. Metti l'insetto infetto in una capsula di Petri di cinque centimetri. Cinque larve per piatto, infettare almeno 20 larve per ogni condizione sperimentale, posizionare i piatti a 37 gradi Celsius in un'incubatrice.

Gli insetti possono anche essere infettati per via orale, come dimostrato in questa sezione del video, in un tubo fendor da due millilitri. Mescolare 0,2 microgrammi per microlitro di tossina criogenica con una sospensione di spore o cellule vegetative per ottenere concentrazioni finali che vanno da tre volte 10, il tre a uno per 10, il riempitivo sei per 10 microlitri, una siringa da un litro dotata di un ago ipodermico da 30 gauge da 25 millimetri con 300 microlitri del grido batterico. Una soluzione di tossina C per l'infezione di 20-25 larve.

Rimuovere le bolle dalla siringa, posizionare manualmente l'insetto in modo che la sua bocca entri nell'ago fissato nell'iniettore e alimentarlo forzatamente con 10 microlitri di soluzione batterica. Utilizzando la pompa a siringa automatizzata dopo l'iniezione orale, la soluzione si diffonderà nell'intestino dell'insetto. In questo esempio, vengono introdotti 10 microlitri di soluzione di colorante blu.

Si noti che il colorante riempie rapidamente il lume intestinale delle larve di insetto Dopo che l'insetto ha ingerito la soluzione, metterla in una piccola capsula di Petri di cinque centimetri, infettare almeno 20 larve per ogni condizione sperimentale, posizionare cinque larve in ogni piatto Dopo l'alimentazione forzata o gli esperimenti di iniezione. Conservare le larve nella capsula di Petri senza cibo a 25 gradi Celsius o 37 gradi Celsius, controllare regolarmente la mortalità larvale. Nell'arco di un periodo di 48 ore, le larve morte vanno dal marrone al nero e sono mobili sconosciute.

Al termine degli esperimenti, liberare tutto il debito larvale e vivere a meno 20 gradi Celsius per 24 ore in una sacca autoclavabile, quindi autoclavarle per uccidere tutti i batteri. Analizza i dati di mortalità utilizzando il software log prob bit o software simili. Questo programma verifica la linearità delle curve di mortalità delle dosi e fornisce dosi letali.

L'iniezione intra emofilica di LD 50 di batteri in g Melan si è dimostrata molto utile per l'identificazione di molti fattori di virulenza che si occupano del danno tissutale e della resistenza ai fattori immunitari innati di diversi patogeni umani per determinare il ruolo della potenziale parete cellulare batterica Peptidasi C-W-P-F-M nella mortalità degli insetti di virulenza, dopo varie dosi di ceppi wild type e mutanti di batteri BOUs, è stato valutato come mostrato qui. La mortalità degli insetti era dose-dipendente, ma diminuiva significativamente quando le larve ricevevano i batteri con CWP fm mutante. Pertanto, questa peptidasi della parete cellulare svolge un ruolo cruciale durante la grave virulenza della priscilla nei confronti delle larve di insetti per dimostrare l'effetto sinergico delle spore di bether sull'attività insetticida della tossina criogenica c i cristalli di cryo one c sono stati aggiunti alle spore del ceppo wild type di bether e somministrati a Galleria.

I melanoma bey senza cristalli sono stati usati come controllo. Dopo 48 ore a 25 gradi Celsius è stata valutata la mortalità delle larve come mostrato in questo grafico, il tasso di mortalità a seguito dell'ingestione di una miscela di tossina di spore è significativamente aumentato rispetto al tasso di mortalità a seguito di una tossina criogenica C o dell'ingestione di spore da sola. Ciò dimostra un effetto sinergico, le spore o i batteri vegetativi sull'attività insetticida della tossina criogenica C.

Il ruolo del cryo one C nel melanoma Galleria è quello di aiutare i batteri che passano attraverso la matrice para atrofica, una struttura ricca di chitina e muco che protegge l'intestino degli insetti dal contatto diretto con cibo e agenti patogeni. L'uso di insetti, soprattutto nella fase di livello, come modelli di infezione per diversi agenti patogeni, sta diventando sempre più comune. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire le infezioni dell'eme e del cavo orale e chiamiamo mortalità degli insetti nel gallio melan.

Questi metodi possono essere facilmente applicati ad altri sistemi modello come le specie bombex, ma e spotter poiché questi genomi sono stati sequenziati, quindi gli ospiti possono essere spenti con metodi a RNA o altre manipolazioni genetiche.