₁ F _O ATPasi Vesicle Preparazione e tecnica per permettere Bloccare Registrazioni patch di membrane delle vescicole submitocondriali

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le vescicole F1 F zero APAs dal cervello di ratto per eseguire registrazioni di patch clamp. Ciò si ottiene rimuovendo prima il cervello da un ratto e omogeneizzandolo. Il secondo passo consiste nel distruggere le zone sinaptiche applicando pressione.

Successivamente, i sinaptosomi vengono stratificati sui gradienti delle fiale. Il passaggio finale consiste nell'incubare con digit toin e L per ottenere le vescicole finali per la registrazione del patch clamp. Un'importante funzione dei mitocondri è la produzione di TP per fosforilazione ossidativa.

L'enzima responsabile della produzione di TP è la A TP sintasi situata nella membrana interna mitocondriale. Per studiare in dettaglio la funzione della A TP sintasi, isoliamo speciali vescicole sub mitocondriali che chiamiamo SMV. Contengono l'enzima A TP sintasi in una configurazione dall'interno verso l'esterno.

Quindi registriamo questi SMV con un elettrodo patch clamp e determiniamo la perdita della loro membrana. Questo ci dice sull'efficienza della produzione di TP da parte dei mitocondri. A dimostrare questa procedura oggi sarà Sylvia Ti, una borsista post-dottorato nel mio laboratorio all'Università di Yale.

In questa procedura, dopo aver ottenuto la testa di un topo per decapitazione, si taglia la pelle per esporre il cranio, quindi si apre delicatamente il cranio tagliandolo con un paio di forbici o Rons. Successivamente, rimuovere il cervello, tritare il cervello senza il cervelletto infine in isolamento, tamponare, quindi trasferirlo in un omogeneizzatore di teflon di vetro da cinque millilitri omogeneizzare delicatamente il tessuto 10 volte, circa cinque minuti in totale. Successivamente, centrifugare il campione a 1.500 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga da banco.

Conservare il surnatante con mitocondri e sinaptosoma e scartare il pellet. Quindi centrifugare nuovamente a 16.000 volte, G per 10 minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga da banco. Successivamente, scartare il surnatante e risospendere il palato In 500 microlitri di tampone di isolamento interrompere il sinaptosoma con un recipiente di disgregazione cellulare applicando una pressione di 1, 200 PSI per 10 minuti, seguito da una rapida decompressione stratificare le zone di sinape interrotte sulle provette da centrifuga con due diverse concentrazioni di fial che formeranno due strati.

Posizionare quindi le provette in un rotore SW 50.1 e centrifugare a 126, 500 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. In un'ultra centrifuga, il palato è i mitocondri purificati. Lo strato tra le diverse densità di fial è il sinaptosoma ininterrotto.

Successivamente, lavare il pellet mediante centrifugazione in isolamento. Tamponare a 16.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga da banco. Ora Resus, sospende i mitocondri in 200 microlitri di tampone di isolamento, combinato con un volume uguale di 1% di dita toin.

Mettetelo sul ghiaccio per 15 minuti. Quindi, aggiungere altro isolamento, tamponare e centrifugare a 16.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Ripetere questa procedura due volte, quindi risospendere il palato in 200 microlitri di tampone di isolamento, e aggiungere due microlitri di 10% Lu bra, PX, mescolare e mettere in ghiaccio per 15 minuti.

Successivamente, stratificare la miscela in isolamento, tamponare nelle provette da centrifuga. Posizionare le provette in un rotore SSW 50.1 e centrifugarle a 182.000 volte G a quattro gradi Celsius per un'ora. Dopo un'ora.

Lavare la tavolozza finale centrifugandola in tampone di isolamento a 16.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Un tipico impianto di elettrofisiologia include un amplificatore, un computer PC dotato di un digi data 1, 440, un'interfaccia convertitore analogico-digitale in combinazione con P clamp, manipolatori software 10.0, un microscopio, un tavolo di isolamento dalle vibrazioni e una gabbia di Faraday. Per prima cosa, estrarre una pipetta da un tubo capillare in vetro silicato Boros in un micro estrattore per micropipette marrone fiammante.

La resistenza ottimale della pipetta deve essere compresa tra 80 e 100 mega ohm. Aggiungere le vescicole submitocondriali in una soluzione intracellulare fisiologica. Quindi riempire una pipetta patch clamp con la stessa soluzione.

Visualizzare le vescicole sotto contrasto di fase. Microscopia dopo che gli SMV sono stati patchati a temperatura ambiente. Registrare l'attività quando il potenziale di membrana viene mantenuto a una tensione compresa tra 100 millivolt negativi e 100 millivolt positivi per 10 secondi per ogni periodo.

I dati registrati vengono filtrati a cinque kilohertz utilizzando il circuito dell'amplificatore e analizzati con il software clamp fit 10.0. Questa figura mostra il blot di lisato preparato dal citosol e dai mitocondri. Il pannello superiore mostra un immuno blot che utilizza un anticorpo contro la proteina citosolica GA dh.

Il pannello inferiore mostra un blot che utilizza un anticorpo contro la proteina della membrana interna mitocondriale. Cox quattro Ecco due registrazioni rappresentative di patch clamp prima e dopo l'aggiunta di un millimolare a TP. Il potenziale di mantenimento è di 70 millivolt positivi. La linea tratteggiata rappresenta zero picoamp.

Ogni traccia viene registrata per 10 secondi e ci sono 10 secondi tra le tracce e mostrata. Di seguito sono riportate le tracce esemplificative delle variazioni di intensità della fluorescenza dell'indicatore A CMA nel tempo in presenza di SMV e in assenza e presenza di un TP. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i mitocondri, una vescicola sub mitocondriale contenente sintetizzatori F1 FO 80 TP. Inoltre, dovresti capire la forma di sigillatura resistente con un elettrodo sulla membrana della vescicola per analizzare l'attività del canale del complesso A TP Syntas.