Massa Citometria: Protocollo per l'ottimizzazione giornaliera e campioni di cellule in esecuzione su un citometro Messa CyTOF

L'obiettivo della revisione di questa procedura è dimostrare la corretta sintonizzazione giornaliera e l'analisi del campione su uno strumento CyTOF. Innanzitutto, la macchina viene assemblata e accesa. Successivamente, le impostazioni dello strumento sono ottimizzate per l'accordatura al segnale massimo.

La macchina è quindi pronta per l'esecuzione dei campioni. Nella fase finale, la macchina viene pulita e spenta. In definitiva, è possibile acquisire dati cellulari ottimali in base a specifici requisiti di tempo.

La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale. Le procedure quotidiane di configurazione, messa a punto e pulizia sono difficili da apprendere dal manuale. Poiché sono coinvolti più passaggi software simultanei.

È necessario acquisire esperienza per acquisire un'idea dei livelli di fondo e dell'intensità del segnale appropriati almeno 15 minuti prima di iniziare un esperimento. Aprire il programma software CyTOF e selezionare la configurazione dello strumento. Quindi, nella scheda della gabbia della scheda, fare clic sul pulsante di accensione del riscaldatore per consentire al mantello della camera di nebulizzazione di raggiungere i 200 gradi Celsius.

Sostituire la siringa nella pompa a siringa con una siringa nuova riempita con milli cubetti d'acqua. Quindi pulire il nebulizzatore risciacquando due volte con il 5% di cedro attraverso la porta di portata. Per rimuovere eventuali residui di Cedro, ripetere il risciacquo posteriore con acqua Milli Q.

Quindi, aprire la valvola del serbatoio del gas argon provocando l'accensione della spia Argonne sulla parte anteriore della macchina. Quindi collegare il nebulizzatore all'ingresso del gas di reintegro e collegare il nebulizzatore al tubo di introduzione del liquido. Inserire l'estremità del nebulizzatore nell'apertura bianca del mantello riscaldante sulla scheda del controller RFG della finestra di configurazione dello strumento.

Fai clic su Avvia plasma, quindi fai clic su OK. Al termine dell'avvio, fare nuovamente clic su OK nella finestra popup. Ora accendi la pompa a siringa.

Quando si ricarica la siringa, premere il pulsante di arresto anziché il pulsante di pausa per azzerare il contatore del volume Prima di calibrare il citometro di massa, assicurarsi che si sia riscaldato per 20 minuti. Una volta che la macchina si è stabilizzata, fare clic sul pulsante delle impostazioni di acquisizione per aprire la finestra delle impostazioni di acquisizione dati. Nella scheda analiti.

Fare clic sulla tavola periodica per aprire il pannello di selezione degli isotopi. Quindi selezionare gli isotopi nella soluzione di sintonizzazione DVS sciences elencata nel manuale e fare clic su Salva. Quindi, fai clic sul pulsante isotopi per lettura per aprire la finestra delle masse per lettura.

Selezionare il conteggio degli impulsi e ridimensionare l'asse y inserendo un nuovo numero e quindi premendo invio. Ora riempi una siringa verde da un millilitro con la soluzione di regolazione. Ruotare il selettore della porta del campione per caricare.

Iniettare 450 microlitri di soluzione di accordatura, quindi ruotare il selettore per iniettare. Attendi fino a quando gli isotopi della soluzione di sintonizzazione iniziano ad apparire come strisce in questo display. I segnali nel tempo di volo, da 9, 400 a 9, 800 regione, sono dovuti agli isotopi dello xeno nel gas argon.

Ora torna alle masse per finestra di lettura e fai clic sul pulsante verde di riproduzione. Ogni linea colorata rappresenta gli isotopi selezionati dalla scheda degli analiti. Quando i livelli di isotopi sono costanti, regolare la corrente di selezione corrente dal menu a discesa nella scheda dei parametri della finestra delle impostazioni di acquisizione dati.

Nella finestra iniziale immettere zero per la fine, quindi immettere 10. Per il valore del passo, immettere 0,5 e per il tempo di assestamento, immettere 200. Quindi fare clic su Salva.

Quindi fare clic di nuovo sulla finestra di messa per lettura e fare clic su Riproduci. Dopo aver annotato dove i segnali degli isotopi raggiungono il picco, vai alla scheda di configurazione del canale DAC della finestra di configurazione dello strumento. Scorri verso il basso fino a corrente e inserisci il valore di picco dell'isotopo.

Fare clic su Imposta valore corrente effettivo, quindi su Salva. Quindi, modifica il menu a discesa per reintegrare il gas. Immettere 0,55 nella finestra iniziale, 0,95 nella finestra finale, 0,05 nella finestra del valore del passo e 200 nella finestra del tempo di assestamento.

Fai clic su Salva. Dopo essere tornati alla finestra di lettura delle masse e aver fatto nuovamente clic su Riproduci, l'asse x visualizzerà ora la portata del gas di reintegro. Prendere nota dei valori in cui i segnali degli isotopi raggiungono il picco e osservare il rapido aumento del segnale GD 1 55 verso la fine.

Quindi torna alla scheda di configurazione del canale DAC. Scorri verso il basso fino a Makeup, gas e inserisci il nuovo valore di picco dell'isotopo. Fare clic su Imposta valore corrente effettivo.

Quindi fare nuovamente clic su Salva per registrare il rapporto tra l'isotopo desiderato e l'ossido. Innanzitutto, fare una seconda iniezione da 450 microlitri di soluzione di sintonizzazione. Quindi, nella scheda dei parametri, selezionare il tempo dal menu a discesa e immettere zero nella finestra iniziale, 10 nella finestra finale, uno nella finestra del valore del passo e 200 nella finestra di assestamento.

Dopo aver fatto clic su Riproduci nella finestra delle masse per lettura, utilizzare il cursore per leggere il valore più alto per TM 1 69 o TB 1 59 e anche il valore GD 1 55. Iniettare ora tre millilitri di acqua Milli Q attraverso il circuito del campione, seguiti da 500 microlitri di soluzione di lavaggio DVS. Nella scheda Calibrazione massa, fare clic su Esegui per monitorare l'avanzamento del lavaggio di pulizia fino a quando l'intensità delle striature inizia a diminuire.

Quindi seguire con tre millilitri di acqua milli cubo e monitorare fino a quando le strisce non sono scese ai livelli di fondo. Iniziare inserendo gli isotopi campione appena dimostrati per gli isotopi della soluzione di ottimizzazione, quindi fare clic su Salva. Quindi, aprire la finestra di acquisizione e modificare le impostazioni di acquisizione in base alle esigenze per il volume del campione.

Ad esempio, un campione da 450 microlitri riempirà il ciclo del campione e impiegherà 600 secondi per essere eseguito per consentire ritardi nell'acquisizione dei dati della cella. Impostare il ritardo di acquisizione su almeno 30 secondi e il ritardo di stabilità del rivelatore su almeno 20 secondi prima dell'esecuzione. Lavare i campioni cellulari almeno due volte con acqua milli cubo, quindi risospendere il campione a un massimo di 10-6 cellule per millilitro e filtrare la soluzione cellulare risultante attraverso un colino cellulare da 35 micrometri.

Per rimuovere eventuali aggregati. Immettere ora un nuovo nome file per l'esempio corrente. Si noti che tutti i file devono essere salvati sull'unità E.

Quindi impostare la valvola del circuito del campione su caricare, iniettare il campione, riportare la valvola del circuito del campione su iniettare, quindi fare clic su Esegui. Nella finestra di acquisizione. Le celle saranno rappresentate nella finestra dell'istantanea come raccolte orizzontali di segni in ciascun canale isotopico verticale e mostreranno la migliore risoluzione da 300 a 500 cellule al secondo, come dimostrato qui.

Al termine dell'acquisizione dei dati del campione, apparirà una finestra pop-up. Fare clic su OK per confermare il completamento del ciclo del campione, quindi iniettare almeno 500 microlitri di acqua MQ tra ciascun campione per ridurre al minimo il trascinamento del campione per pulire la macchina Dopo l'uso, iniettare 450 microlitri di soluzione di lavaggio nel circuito del campione. Monitorare il rilascio di metallo libero e quindi lavare il circuito del campione con tre millilitri di acqua milli Q, monitorando il lavaggio fino al raggiungimento dei livelli di striature di fondo.

Quindi, per spegnere la macchina, selezionare la scheda del controller RFG della finestra di configurazione dello strumento e fare clic su arresta plasma. Al termine della procedura, fare clic su OK nella finestra popup, consigliando la rimozione del nebulizzatore sotto la linguetta della gabbia della scheda. Spegnere il riscaldatore, chiudere la valvola sull'alimentazione dell'argonne, quindi tirare con cautela all'indietro il nebulizzatore per rimuoverlo dalla camera di nebulizzazione.

Quindi, svitare il tubo di introduzione del campione e metterlo da parte. Svitare il raccordo di introduzione del gas di reintegro finché non si allenta leggermente, quindi estrarre il nebulizzatore. Infine, utilizzando la stessa siringa e lo stesso tubo come dimostrato in precedenza, pulire entrambe le porte del nebulizzatore con il 5% di cedro e conservare il nebulizzatore coperto con il 5% di cedro fino al successivo utilizzo.

Un adeguato lavaggio del citometro di massa con acqua UE e soluzione di lavaggio DVS ridurrà i livelli di assorbimento del metallo nel tubo e in altre parti della macchina, contribuendo a ridurre qualsiasi fondo come si vede in questi grafici. L'accordatura impropria rappresentata dalla linea magenta ha aumentato significativamente la formazione di ossido a m più 16 rispetto al campione correttamente sintonizzato, come dimostrato dalla linea blu scuro. Ciò ha l'effetto di diminuire leggermente i segnali desiderati a m e di aumentare significativamente l'interferenza di fondo indesiderata a m più 16.

Un corretto lavaggio e un'adeguata diluizione dei campioni in acqua Milli Q garantiranno un fondo minimo e la massima risoluzione delle cellule, bilanciando al contempo la necessità di velocità. Analogamente ai dati di un esperimento rappresentativo mostrato qui in questo esperimento, le perle di polistirene contenenti abbondanza naturale lantanio 1 39 ODIUM one 40, TERBIUM 1 59, DIUM 1 69 e LUTETIUM 1 75 sono state eseguite in modalità di acquisizione cellulare. I dati sono stati analizzati utilizzando FlowJo e i detriti di eventuali perline rotte sono stati eliminati.

Il campione correttamente sintonizzato è stato determinato alla portata di 0,74 litri al minuto, come rappresentato dalla linea blu scuro. A questa portata sono state osservate intensità di segnale più elevate rispetto alle portate più basse, e questo campione correttamente sintonizzato ha un segnale più alto alle masse metalliche M e meno segnale alle masse di ossido m più 16 rispetto ai segnali sintonizzati in modo improprio. Un primo piano del segnale a M Mass LANTHANUM 1 39 e THULIUM 1 69 è mostrato qui.

Si noti che la portata del gas di reintegro influisce sull'intensità del segnale LANTANIO 1 39 più dell'intensità del segnale del tulio 1 69. Questi grafici mostrano il segnale a m più 16 masse di ossido 1 55 e 180 5 corrispondenti rispettivamente agli ossidi LANTANIO 1 39 più oh 16 e tulio 1 69 più oh 16. Si noti che la portata del gas di reintegro aumenta il segnale di massa 1 55 molto più del segnale di massa 180 5 poiché il lantanio 1 39 è più facilmente ossidabile del tulio 1 69.

Qui sono illustrate le intensità del segnale m e m più 16 in funzione della portata del gas di reintegro. Le icone piene rappresentano la massa M.Mentre le icone aperte rappresentano la massa M più 16, i colori delle linee corrispondono alla rispettiva massa M.Si noti che le intensità del segnale LANTANIO 1 39 e prezzo ODIO 1 41 sono fortemente influenzate dalla portata del gas di reintegro. Anche raggiungendo un punto in cui è presente più massa m più 16 ossido rispetto alla massa M.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come avviare il CyTOF sintonizzarlo correttamente, quindi eseguire i tuoi campioni e infine pulire e spegnere correttamente la macchina alla fine delle tue corse quotidiane.