Name: Massa Citometria: Protocollo per lottimizzazione giornaliera e campioni di cellule in esecuzione su un citometro Messa CyTOF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Impara la messa a punto giornaliera del citometro di massa CyTOF per l'acquisizione ottimale dei dati cellulari. Questo protocollo dettagliato guida attraverso l'accensione, la taratura del segnale e le procedure di pulizia.

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Vorremmo ringraziare il Dott. Evan Newell e il Dr. Sean Bendall per il feedback. Vorremmo anche ringraziare DVS Sciences e il Dr. Sean Bendall per un campione delle Multi-lantanidi contenenti perline di polistirene. Siamo grati per il finanziamento dal NIH Grant 2 U19 AI057229.

Tutti i campioni di cellule per la CyTOF devono essere fissate e permeabilizzate. Questo consente una maggiore entrata del iridio contenente DNA intercalante, e impedisce anche lisi cellulare durante il lavaggio con acqua MilliQ e gradini risospensione immediatamente prima di iniettare nel citometro massa. 1. Start-up del citometro Messa <ol><li> Aprire il programma CyTOF software. Selezionare Impostazione dello strumento. Nella scheda Cage Card, andate nell&#39;angolo in basso a destra e fare clic su Riscaldatore &quot;ON&quot;. Accendere il riscaldatore almeno 15 minuti prima del tempo desiderato per dare il tempo sufficiente per il mantello della camera spray per raggiungere i 200 ° C. </li><li> Sostituire il bianco Norm-Ject siringa da 3 ml nella pompa siringa con una siringa piena d&#39;acqua fresca MilliQ. </li><li> Pulizia nebulizzatore. Backflush il nebulizzatore, utilizzando la siringa e il tubo per tirare 5% citranox 2-3 volte sia attraverso la porta più piccola introduzione liquido e più grande è la porta di introduzione di gas. Ripetere il risciacquo con acqua MilliQ to rimuovere citranox residuo. </li><li> Controllo per confermare che le luci sul pannello frontale del CyTOF sono accesi come in figura 1. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig1.jpg" /> Figura 1. Spie del pannello CyTOF prima della messa in servizio. <ol start="5"><li> Aprire la valvola del serbatoio di gas argon. Questo dovrebbe causare la luce &quot;ARGON&quot; sulla parte anteriore per accendere. </li><li> Collegare il nebulizzatore per il make-up di ingresso del gas. Svitare il make-up tubo connettore del gas e togliere la gomma nera o-ring e il bianco pezzo conico di plastica. Nota ampio &quot;nocche&quot; sul gambo porta di introduzione di gas del nebulizzatore. Posizionare il connettore sulla porta di introduzione di gas. Posizionare il nero o-ring sull&#39;estremità del porto gas e forzare l&#39;o-ring oltre la parte più larga dello stelo porta. Posizionare il pezzo bianco conico in plastica sulla parte superiore con l&#39;estremità più stretta ha sottolineato, e avvitarla al make-up tubo del gas. </li><li&gt; Collegare il nebulizzatore al tubo introduzione liquido. Inserire con cautela la tubazione piccola nell&#39;apertura all&#39;estremità del nebulizzatore. Ci saranno due fermate, simili nel sentire alle fermate su una micropipetta. Prima premere fino ad incontrare resistenza luce, la fine del tubo piccolo dovrebbe essere alla fine del tratto rettilineo del vetro. Secondo, premere di più per forzare la fine del tratto rettilineo del vetro ulteriormente nel raccordo e serrare la vite di fissaggio per sigillare. Inserire l&#39;estremità del nebulizzatore nell&#39;apertura bianco nel mantello riscaldante. </li><li> Nella scheda controller RFG della finestra di configurazione dello strumento, premere il tasto &quot;Avvio Plasma&quot;. Dal momento che il nebulizzatore è già inserito, premere il tasto &quot;OK&quot;. Il software si accende il refrigeratore, avviare il flusso di gas, e accendere un plasma. Il rilevatore di tensione salirà. Ci sarà una finestra pop-up che dice &quot;plasma sequenza di avvio è stato completato correttamente&quot; quando hai finito, premere il tasto &quot;OK&quot;. Nuove luci dovrebbe essere nel pannello frontale (figura 2 </strong<html> &gt;). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig2.jpg" /> Figura 2. Spie del pannello CyTOF dopo plasma acceso e start-up completato con successo. <ol start="9"><li> Accensione pompa a siringa. Nell&#39;angolo in alto a destra, premere il pulsante verde &quot;play&quot; per avviare la pompa a siringa e iniziare a liquido che scorre attraverso il tubo e schizzi fuori del nebulizzatore. Le impostazioni di default per siringhe sono 3 ml di acqua. Affinché campione da fluisce attraverso il loop del campione, la pompa a siringa deve essere periodicamente cambiato quando si esaurisce di acqua. Nella parte superiore dello schermo, vi è un contatore che indica quanto liquido è fluito dalla pompa a siringa. La pompa a siringa si arresta quando il contatore raggiunge &quot;3,000&quot; o lo stantuffo raggiunge la fine della siringa. Quando si riempie la siringa, è necessario premere &quot;stop&quot;, piuttosto che il pulsante blu &quot;pausa&quot; per azzerare il contatore. </li></ol>e &quot;&gt; 2. Taratura giornaliera della Messa citometro <ol><li> Il citometro massa avrà bisogno di circa 20 minuti per ottenere un caldo, plasma stabile prima della calibrazione. Lo scopo dei passi di sintonia è quello di massimizzare il segnale desiderato di Tm169 o Tb159 mantenendo &quot;Gd155&quot; (ossido; La139 + O16) segnale sotto il 3% del valore più elevato. Fare clic sul pulsante di acquisizione Impostazioni per aprire la finestra Impostazioni di acquisizione dati. Nella scheda analiti, fare clic sulla tabella periodica per aprire il pannello di selezione isotopo. Selezionare gli isotopi in sintonia soluzione DVS Sciences indicato nel manuale, quindi fare clic su &quot;salva&quot;. </li><li> Fare clic sul Isotopi Per Lettura pulsante per aprire la Massa () Per la finestra di lettura. Selezionare &quot;Impulsi Conte&quot;, e ridimensionare l&#39;asse y inserendo un nuovo numero e premendo il tasto &quot;enter&quot;. </li><li> Riempire una verde 1 ml Norm-Ject siringa con la soluzione messa a punto. Ruotare il selettore di porta di campionamento per &quot;caricare&quot;, iniettare 450 ml di soluzione messa a punto, quindi ruotare il selettore su &quot;iniettare&quot;. Nella scheda massa di calibrazione del Acquisit dati<html> ione finestra delle impostazioni, premere il tasto &quot;Esegui&quot; per monitorare quali sono le masse che scorre. Il lato sinistro della finestra è minore massa, mentre il lato destro è maggiore massa. Nota: ci sarà già segnali nella regione 9400-9800 TOF, a causa di isotopi xenon nel gas argon (Figura 3). Attendere fino a quando la soluzione messa a punto isotopi iniziano ad apparire come strisce in questa schermata (Figura 4). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig3.jpg" /> Figura 3. Messa scheda della finestra di calibrazione, mostrando livelli di fondo per vari isotopi dopo la soluzione di lavaggio e risciacquo con acqua. La regione intorno a TOF 9400-9800 corrisponde allo xeno isotopi del gas argon, e deve essere sempre presente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . 4 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Calibrazione finestra scheda di massa, mostrando strisce verticali per i vari isotopi in soluzione messa a punto DVS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <ol start="4"><li> Torna alle Massa () Per la lettura finestra e premere il tasto verde &quot;Play&quot; in alto a sinistra. Ogni isotopo selezionata al passo 2.1 è rappresentata da una linea di colore diverso. Il valore predefinito asse X è &quot;Time&quot;, in sec. Monitorare i livelli dei diversi isotopi fino a quando non sono stabili. </li><li> Regolazione della corrente. Nella scheda Parametri della Acquisizione Dati finestra Impostazioni, selezionare &quot;Current&quot; dal menu a discesa. Sia start = 0, finitura = 10, valore step = 0.5, tempo di assestamento = 200, e premere il tasto &quot;Salva&quot;. Fare clic su Indietro Messa (i) Per la finestra di lettura e avviare la riproduzione. L&#39;asse x è ora &quot;corrente&quot;. Nota in cui i segnali del picco isotopi (Figura 5), e r<html> ecord. Nella scheda DAC Setup Canali della finestra di configurazione dello strumento, scorrere verso il basso su &quot;Current&quot; e digitare il nuovo valore. Premere il tasto &quot;Imposta valore reale attuale&quot;, poi &quot;salva&quot;. </li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig5.jpg" /> Figura 5. Profilo di sintonizzazione corrente. <ol start="6"><li> Regolazione del gas di reintegro. Cambia menu a discesa di &quot;Make-up di gas.&quot; Sia start = 0.55, fine = 0,95, valore step = 0.05, tempo di assestamento = 200. Premere salvare. Tornare alla Massa () Per la finestra di lettura e avviare la riproduzione. L&#39;asse x è ora &quot;Make-up gas&quot; portata. Registrare in cui i segnali del picco isotopi. Osservare il rapido aumento del segnale &quot;Gd155&quot; verso la fine (Figura 6). Tornare alla configurazione DAC Canali scheda, scorrere fino a &quot;Make-up gas&quot;, e immettere il nuovo valore. Premere il tasto &quot;Imposta valore reale attuale&quot;, poi &quot;salva&quot;. </li></ol>igura 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Make-up profilo regolazione gas. <ol start="7"><li> Registrazione del rapporto desiderato isotopo ossido vs. Fare una seconda iniezione di 450 ml di soluzione di messa a punto. Nella scheda Parametri, selezionare &quot;Time&quot; dal menu a discesa, per non start = 0, end = 10, valore step = 1, tempo di assestamento = 200. Premere il tasto &quot;salva&quot;. Clicca su &quot;play&quot; a Massa () Per la lettura finestra. Dopo le linee di stabilizzazione (figura 7), usare il cursore per leggere il valore nelle caselle in alto a sinistra per Tm169 o Tb159 (valore maggiore) e anche il valore &quot;Gd155&quot; (&lt;3% del valore più elevato). Questi valori possono anche essere salvati in un file di messa a punto per riferimento futuro. </li></ol><img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig7.jpg" /> Figura 7. Misura di intensità di soluzione di ottimizzazione del segnale dopo l&#39;ottimizzazione del gas corrente e Make-up. <ol start="8"><li> Pulizia di samloop di PLE. Iniettare 3 ml di acqua MilliQ attraverso il loop del campione, seguita da 500 microlitri di soluzione di lavaggio DVS. Monitorare lo stato di avanzamento della pulizia premendo il tasto &quot;run&quot; nella scheda Calibrazione Messa. Lavare fino l&#39;intensità delle striature (Figura 4) inizia a diminuire, quindi seguire da 3 ml di acqua MilliQ e monitor fino a livelli di sfondo (Figura 3). </li></ol> 3. Esempi di lavoro <ol><li> Aprire la finestra di acquisizione. Impostazioni predefinite: fare analisi = On-The-Fly, segnale per l&#39;analisi = Doppio, calibrazione del doppio conteggio dei dati =. Riduzione del rumore è stato selezionato. Qualsiasi di questi può essere cambiato se desiderato. Immettere il nome del file. Tutti i file devono essere salvati nella :/ E / unità. </li><li> Impostazione dei ritardi di acquisizione. Ci sarà un leggero ritardo nella registrazione eventi cellulari di circa 30 secondi a causa della lunghezza del tubo tra il loop campione e il nebulizzatore. Pertanto, la somma totale di &quot;ritardo Acquisition&quot; e &quot;Detector stritardo capacità &quot;deve essere di almeno 30 secondi. stabilità ritardo rilevatore deve essere di almeno 20 secondi. </li><li> Impostazione tempo di raccolta dei dati. &quot;Il tempo di acquisizione&quot; è il numero di secondi che si desidera eseguire il vostro campione. Riempire l&#39;intero ciclo di 450 microlitri del campione richiede 600 secondi per il completamento. Si suggerisce che 50-100 sec essere aggiunto alla fine del tempo di funzionamento per minimizzare campione riporto. </li><li> Risospensione del campione. Per ridurre al minimo l&#39;accumulo di sali in macchina, si suggerisce che almeno due lavaggi in acqua MilliQ essere fatto al termine della colorazione cellulare, seguita da una risospensione finale in acqua MilliQ. Il volume di acqua MilliQ usato per risospendere il pellet cellulare varia a seconda del numero di celle e iniziato con il recupero delle cellule dopo la procedura di colorazione intera. Un buon punto di partenza è 10 6 (partenza) cellule / ml. Dopo la risospensione, filtrare attraverso un colino per eliminare cella aggregati. </li><li> Campione di partenza correre. Immettere un nuovo nome di file per il campione corrente.<html> Spegnere la valvola loop del campione per &quot;caricare&quot;, iniettare il campione, tornare a &quot;iniettare&quot;, poi clicca su &quot;Esegui&quot; nella finestra di acquisizione. </li><li> Registrazione di eventi cellulari. Le cellule saranno rappresentati nella finestra istantanea come le collezioni di marchi orizzontali in ogni verticale isotopo / marcatore canale (Figura 8). Mentre il citometro massa può registrare 1000 cellule / sec, una migliore risoluzione tra gli eventi cellulari di solito si ottiene a 300-500 cellule / sec. Ciò corrisponde ad una media di ~ 1 cellula / aggiornamento dello schermo. Si può richiedere fino a 30 secondi prima che il contatore di eventi cellula inizia a salire. Ciò è dovuto al &quot;On-the-fly&quot; trattamento dei dati, senza le informazioni sugli eventi della cella viene persa. </li></ol><img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig8.jpg" /> Figura 8. Finestra Acquisizione durante esempio eseguibile, mostrando righe orizzontali di punti corrispondenti agli elementi associati tre eventi cellulari distinti.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura. <ol start="7"><li> Qualità degli eventi cellulari. Nota uno sfondo striature in ciascun canale isotopo, così come il tasso di eventi cella. Il citometro massa riconosce un &quot;evento cella&quot; come un certo aumento del segnale di sopra del fondo, così il segnale di fondo in metallo libera o non legata anticorpi possono alterare l &#39;&quot;evento cella&quot; count. Inoltre, l&#39;esecuzione cellule ad una concentrazione troppo elevata può causare un aumento del numero di eventi doppietto. Sfondo può essere diminuito da lavaggi supplementari o diluizione della cella. Doppietti può essere minimizzata diluizione cellulare maggiore, a costo di tempo di esecuzione maggiore. </li><li> Finitura di acquisizione dati. Quando il tempo di acquisizione è stato raggiunto, la raccolta dei dati finirà. Ci sarà un po &#39;di ritardo prima di una finestra pop-up con un &quot;OK&quot; appare, ancora una volta, ciò è dovuto a &quot;On-the-Fly&quot;, l&#39;elaborazione dei dati. Acquisizione del campione può anche essere fermato Prematurely premendo il pulsante &quot;Stop&quot;. In questo caso, tutti gli eventi cellulari già registrati saranno contati e trasformati in file di output. </li><li> Iniezione di almeno 500 ml di acqua MilliQ tra ciascun campione minimizza il carryover campione. </li></ol> 4. Pulizia della macchina dopo l&#39;uso <ol><li> Soluzione di lavaggio. Dopo che il campione finale è gestito e il loop del campione lavato con acqua, iniettare 450 ml di soluzione di lavaggio nel loop del campione. Monitorare il rilascio di metallo libero nella scheda massa di calibrazione della finestra di acquisizione dei dati delle impostazioni come indicato al punto 2.8 (Figura 9). Quando il segnale di metallo libero comincia a diminuire, lavare con 3 ml di acqua MilliQ e monitorare fino livelli di fondo sono raggiunti. </li></ol><img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig9.jpg" /> Figura 9. Messa scheda della finestra di calibrazione, durante la post-ciclo di pulizia con la soluzione di lavaggio DVS. Le strisce verticali in regione TOF 9800-11000 sono anticorpi del marchio di isotopi viene rimossa dalla macchina. Le strisce verticali intorno TOF 11500 corrispondono ai due isotopi intercalatore Ir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . 5. Spegnimento della macchina <ol><li> Nella scheda controller RFG della finestra di configurazione dello strumento, selezionare &quot;Stop Plasma&quot;. Quando la procedura è completa, ci sarà una finestra pop-up che chiede di rimuovere il nebulizzatore. Premere il tasto &quot;OK&quot;. Nella scheda Cage Card, spegnere il riscaldatore. Chiudere la valvola sulla fornitura di argon. </li><li> Rimozione del nebulizzatore. Rimuovere il nebulizzatore dalla camera di spruzzo con attenzione tirando indietro. Svitare il tubo di introduzione del campione da 1,6 Step e mettere da parte. Svitare il make-up di introduzione di gas per allentare un po &#39;, quindi tirare fuori il nebulizzatore. Lasciando il raccordo avvitato insieme ridurrà le possibilità di losing il nero in gomma o-ring e nero pezzo conico di plastica. </li><li> Pulizia nebulizzatore. Backflush entrambe le porte del nebulizzatore con il 5% citranox utilizzando la siringa e il tubo come indicato al punto 1.3. Store, coperto, nel 5% citranox fino all&#39;utilizzo successivo. </li></ol>

<ol><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li>
<li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li>
<li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li>
<li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8%2B+T+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li>
</ol>

Gli autori lavorano entrambi presso il Centro di monitoraggio immunitario umano, un centro di assistenza presso la Stanford University che impone diritti degli utenti esclusivamente per coprire i costi di saggi, tra cui citometria di massa.

Per questi ultimi decenni, la citometria a flusso di fluorescenza è stato un metodo cavallo di lavoro per analizzare cellule singole, sia in termini di espressione di superficie e in saggi funzionali. Tuttavia, i problemi di sovrapposizione spettrale dei coloranti fluorescenti ha limitato il numero di marcatori simultanei. Mentre gli esperimenti che utilizzano più di 12 marcatori simultanei sono stati riportati, l&#39;importo della compensazione necessaria rende tecnicamente difficile. Invec...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> CyTOF TM massa citometro </td><td> DVS Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soluzione di lavaggio </td><td> DVS Sciences </td><td> 201071 </td><td> 0,05% di acido fluoridrico in acqua </td></tr><tr><td> Sintonizzazione soluzione </td><td> DVS Sciences </td><td> 201072 </td><td> 0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, acido nitrico traccia </td></tr><tr><td> Eu contenenti perline di polistirene </td><td> DVS Sciences </td><td> 201073 </td><td> Contiene naturale abbondanza isotopi Eu; perline in dotazione a circa 1 milioni / mL </td></tr><tr><td> Multi-contenenti lantanidi (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - polistirolo perle </td><td> DVS Sciences </td><td> Non ancora disponibile in commercio </td><td> Contiene naturale abbondanza isotopi di lantanidi quotate </td></tr><tr><td> Acido nitrico (concentrato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima traccia-metallo puro ICP-MS di qualità </td></tr><tr><td> Polistirene fondo rotondo tubo con cellule-filtro cap-5 ml </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> utilizzato per filtrare campioni di cellule prima dell&#39;iniezione </td></tr><tr><td> Norm-Ject tuberkulin siringa 1 ml </td><td> Henke Sass Lupo </td><td> 4010-200V0 </td><td> senza silicone, latex-free </td></tr><tr><td> Norm-Ject siringa 3 ml </td><td> Henke Sass Lupo </td><td> 4010.000V0 </td><td> senza silicone, latex-free </td></tr><tr><td> MilliQ acqua </td><td></td><td></td><td> 18 MW di acqua pura, non deve essere conservato in bottiglie di vetro o di plastica che sono stati lavati con detersivo commerciale (a causa della loro elevati livelli di bario presenti). </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> detergente acido </td></tr><tr><td> Gas argon </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99.999% Ultra-alta purezza </td></tr></tbody></table>

massa citometria: protocollo per l&#39;ottimizzazione giornaliera e campioni di cellule in esecuzione su un citometro messa cytof

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Negli ultimi anni, l&#39;analisi rapida di singole cellule è comunemente eseguita utilizzando citometria di flusso e anticorpi marcati in fluorescenza. Tuttavia, la questione della sovrapposizione spettrale delle emissioni di fluorofori ha limitato il numero di sonde simultanee. In contrasto, la nuova massa citometro CyTOF da DVS coppie Scienze un liquido a cella singola introduzione di un sistema ICP-MS. 1 Invece di fluorofori, polimeri chelanti contenenti isotopi metallici altamente arricchito sono accoppiati ad anticorpi o altre sonde specifiche. 2-5 A causa della purezza del metallo e la risoluzione di massa del citometro massa, non vi è alcuna &quot;sovrapposizione spettrale&quot; di isotopi vicini, e quindi senza necessità di matrici di compensazione. Inoltre, grazie all&#39;utilizzo di metalli lantanidi, non c&#39;è sfondo biologico e quindi non equivalente di autofluorescenza. Con una finestra massa estende massa atomica 103-203, teoricamente fino a 100 etichette possono essere distinti contemporaneamente. Attualmente, Più di 35 canali sono disponibili utilizzando i reagenti chelante disponibile da DVS Sciences, che consente la dissezione senza precedenti del profilo immunologico dei campioni. 6-7 Svantaggi citometria massa includono il requisito rigido per un isotopo metallico separato per sonda (non equivalente di dispersione in avanti o laterale), e il fatto che si tratta di una tecnica distruttiva (senza possibilità di recupero cernita). L&#39;attuale configurazione del citometro massa ha anche una velocità di trasmissione di cella solo ~ 25%, richiedendo così un numero di ingresso maggiore di cellule. Ottima performance giornaliera del citometro massa richiede diversi passaggi. L&#39;obiettivo fondamentale della ottimizzazione è quello di massimizzare l&#39;intensità di segnale misurata degli isotopi metallici desiderati (M), riducendo al minimo la formazione di ossidi (M 16) che diminuisce l&#39;intensità del segnale e M interferire con qualsiasi segnale desiderato a M 16. Il primo passo è di riscaldare la macchina in un caldo, stabile ICP plasma è stato stabilito. In secondo luogo, le impostazioni per la frequenza del gas corrente e il make-up di flusso deve essere ottimizzata su base giornaliera. Durante il prelievo, il massimo tasso di eventi cella è limitato dal rilevatore efficienza e velocità di elaborazione a 1000 cellule / secondo. Tuttavia, a seconda della qualità di esempio, un più lento tasso di eventi cella (300-500 cellule / secondo) è generalmente auspicabile consentire una migliore risoluzione tra eventi cellule e quindi massimizzare singlets intatte nel doppietti e detriti. Infine, adeguata pulizia della macchina alla fine della giornata aiuta a minimizzare il segnale di fondo per metallo libero.

Dopo il protocollo di cui sopra dovrebbe realizzare quattro cose. In primo luogo, consentendo un adeguato tempo di riscaldamento per il citometro massa produrrà un caldo, plasma stabile necessario per il segnale ottimale e minima formazione di ossido. Secondo, lavaggio adeguato del citometro massa con acqua e soluzione di lavaggio MilliQ DVS (Figura 9) contribuirà a ridurre i livelli di metallo assorbimento nella tubazione e altre parti della macchina, contribuendo a ridurre fondo durante l&#39;acquisiz...

I passi necessari per la sintonizzazione quotidiana e ottimizzazione delle prestazioni di un citometro massa CyTOF sono descritti. Commenti sulla preparazione del campione ottimale e portata sono discussi

Massa Citometria: Protocollo per l&#39;ottimizzazione giornaliera e campioni di cellule in esecuzione su un citometro Messa CyTOF

Negli ultimi anni, l'analisi rapida di singole cellule è stata comunemente eseguita mediante citometria a flusso e anticorpi marcati con fluorescenza. Tuttavia, il...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la corretta taratura giornaliera e l'analisi del campione su uno strumento CyTOF. Innanzitutto, lo strumento viene assemblato e acceso. Successivamente, le impostazioni dello strumento vengono ottimizzate per la taratura al segnale massimo.La macchina è quindi pronta per eseguire i campioni. Nell'ultimo passaggio, la macchina viene pulita e spenta. In definitiva, dati cellulari ottimali possono essere acquisiti in base a specifiche esigenze temporali.La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale. Le procedure quotidiane di configurazione, taratura e pulizia sono difficili da apprendere dal manuale, poiché comportano diversi passaggi software simultanei.È necessario acquisire esperienza per sviluppare una sensibilità riguardo ai livelli di fondo e alle intensità del segnale appropriati. Almeno 15 minuti prima di iniziare un esperimento, aprire il programma software CyTOF e selezionare la configurazione dello strumento. Successivamente, nella scheda del vano porta schede, fare clic sul pulsante di accensione del riscaldatore per permettere al mantello della camera di nebulizzazione di raggiungere i 200 gradi Celsius.Sostituire la siringa nella pompa per siringa con una siringa nuova riempita con acqua milli cube. Quindi pulire il nebulizzatore eseguendo un lavaggio inverso con Citron al 5% due volte attraverso ciascuna porta. Per rimuovere eventuali residui di Citron, ripetere il lavaggio inverso con acqua Milli Q.Successivamente, aprire la valvola della bombola di gas argon, facendo accendere la spia Argonne sulla parte anteriore della macchina. Quindi collegare il nebulizzatore all'ingresso del gas di compensazione e connettere il nebulizzatore al tubo di introduzione del liquido. Inserire l'estremità del nebulizzatore nell'apertura bianca nel mantello riscaldante nella scheda del controller RFG della finestra di configurazione dello strumento.Fare clic su avvia plasma, quindi fare clic su ok. Al termine dell'avvio, fare clic nuovamente su ok nella finestra popup. Ora accendere la pompa a siringa.Quando si ricarica la siringa, premere il pulsante di arresto invece del pulsante di pausa per reimpostare il contatore del volume. Prima di calibrare il citometro di massa, assicurarsi che sia stato acceso per almeno 20 minuti. Una volta che l'apparecchiatura ha raggiunto la stabilità, fare clic sul pulsante delle impostazioni di acquisizione per aprire la finestra delle impostazioni di acquisizione dati. Nella scheda analiti.Fare clic sulla tavola periodica per aprire il pannello di selezione degli isotopi. Quindi selezionare gli isotopi presenti nella soluzione di taratura DVS Sciences elencati nel manuale e fare clic su Salva. Successivamente, fare clic sul pulsante isotopi per lettura per aprire la finestra delle masse per lettura.Selezionare il numero di impulsi e ridimensionare l'asse y inserendo un nuovo numero e premendo invio. Riempire ora una siringa verde da un millilitro norm inject con la soluzione di taratura. Ruotare il selettore del portacampioni su load.Iniettare 450 microlitri di soluzione di taratura, quindi ruotare il selettore su inietta. Attendere finché gli isotopi della soluzione di taratura non iniziano a comparire come strisce in questo display. I segnali nel tempo di volo, nella regione da 9.400 a 9.800, sono dovuti agli isotopi dello xenon presente nel gas argon.Ora tornare alle masse per la finestra di lettura e fare clic sul pulsante verde di riproduzione. Ogni linea colorata rappresenta gli isotopi selezionati dalla scheda degli analiti. Quando i livelli degli isotopi sono stabili, regolare la corrente selezionando la corrente desiderata dal menu a tendina nella scheda dei parametri della finestra di impostazioni di acquisizione dati.Nella finestra iniziale, inserire zero per l'arrivo, inserire 10. Per il valore del passo, inserire 0,5 e per il tempo di stabilizzazione, inserire 200. Quindi fare clic su salva.Quindi fare clic nuovamente sulla finestra delle masse per lettura e premere riproduci. Dopo aver annotato i punti di picco dei segnali degli isotopi, passare alla scheda di configurazione del canale DAC della finestra di impostazione dello strumento. Scorrere verso il basso fino alla voce corrente e inserire il valore del picco dell'isotopo.Fare clic su "imposta valore corrente effettivo" e quindi salvare. Successivamente, modificare il menu a discesa per selezionare il gas di compensazione. Inserire 0,55 nella finestra di inizio, 0,95 nella finestra di fine, 0,05 nella finestra del valore di passo e 200 nella finestra del tempo di stabilizzazione.Fare clic su salva. Dopo essere tornati alla finestra delle masse per lettura e aver fatto nuovamente clic su riproduci, l'asse x mostrerà ora la portata del gas di supporto. Prendere nota dei valori in corrispondenza dei quali i segnali degli isotopi raggiungono il picco ed osservare l'aumento rapido del segnale GD 1 55 verso la fine.Quindi tornare alla scheda di configurazione del canale DAC. Scorrere verso il basso fino a "makeup", "gas", e inserire il nuovo valore del picco isotopico. Fare clic su "imposta valore attuale".Quindi fare nuovamente clic su salva per registrare il rapporto tra l'isotopo desiderato e l'ossido. Innanzitutto, effettuare un secondo iniezione di 450 microlitri di soluzione di taratura. Successivamente, nella scheda dei parametri, selezionare "tempo" dal menu a tendina e inserire zero nella finestra di inizio, 10 nella finesta di fine, 1 nel campo del valore del passo e 200 nella finestra di stabilizzazione.Dopo aver fatto clic su play nella finestra delle masse per lettura, utilizzare il cursore per leggere il valore più alto per TM 1 69 o TB 1 59, e anche il valore GD 1 55. Iniettare ora tre millilitri di acqua Milli Q attraverso il loop del campione, seguiti da 500 microlitri di soluzione lavaggio DVS. Nella scheda di calibrazione della massa, fare clic su esegui per monitorare l'andamento del lavaggio di pulizia finché l'intensità delle strisce non inizia a diminuire.Quindi aggiungere tre millilitri di acqua milliq e monitorare fino a quando le strisce si riducono a livelli di fondo. Iniziare inserendo gli isotopi del campione appena illustrati per gli isotopi della soluzione di taratura, quindi fare clic su salva. Successivamente, aprire la finestra di acquisizione e modificare le impostazioni di acquisizione secondo le esigenze del volume del campione.Ad esempio, un campione di 450 microlitri riempirà il loop di campionamento e richiederà 600 secondi per l'esecuzione, per consentire ritardi nell'acquisizione dei dati cellulari. Impostare il ritardo di acquisizione su almeno 30 secondi e il ritardo di stabilità del rilevatore su almeno 20 secondi prima dell'esecuzione. Lavare i campioni cellulari almeno due volte con acqua milli cube, quindi risospendere il campione a un massimo di 10 alla sesta cellule per millilitro e filtrare la soluzione cellulare risultante attraverso un filtro cellulare da 35 micrometri.Per rimuovere eventuali aggregati. Ora inserire un nuovo nome di file per il campione corrente. Si noti che tutti i file devono essere salvati nel disco E.Quindi commutare la valvola del loop campione su "load", iniettare il campione, riportare la valvola del loop campione su "inject" e fare clic su "run" nella finestra di acquisizione. Le cellule verranno rappresentate nella finestra di anteprima come serie orizzontali di segni in ciascun canale isotopico verticale e mostreranno la migliore risoluzione intorno a 300-500 cellule al secondo, come illustrato qui.Al termine dell'acquisizione dati del campione, apparirà una finestra pop-up. Fare clic su OK per confermare il completamento dell'analisi del campione, quindi iniettare almeno 500 microlitri di acqua MQ tra ogni campione per contribuire a minimizzare il carryover del campione e pulire lo strumento. Dopo l'uso, iniettare 450 microlitri di soluzione di lavaggio nel loop del campione. Monitorare il rilascio del metallo libero, quindi lavare il loop del campione con tre millilitri di acqua milli Q, monitorando il lavaggio fino al raggiungimento di livelli di fondo stabili.Quindi, per spegnere lo strumento, selezionare la scheda del controller RFG nella finestra di configurazione dello strumento e fare clic su "ferma plasma". Al termine della procedura, fare clic su "ok" nella finestra a comparsa, che raccomanda la rimozione del nebulizzatore sotto la scheda del vano alloggiamento. Spegnere il riscaldatore, chiudere la valvola della fornitura di argon e quindi estrarre con attenzione il nebulizzatore tirandolo all'indietro dalla camera di nebulizzazione.Successivamente, svitare il tubo di introduzione del campione e metterlo da parte. Svitare il collegamento di introduzione del gas di compensazione fino a quando non si allenta leggermente, quindi rimuovere il nebulizzatore. Infine, utilizzando la stessa siringa e lo stesso tubo mostrati in precedenza, pulire entrambi i fori del nebulizzatore con Citron al 5% e conservare il nebulizzatore coperto con Citron al 5% fino all'utilizzo successivo.Un adeguato lavaggio del citometro a massa con acqua UE e soluzione lavaggio DVS ridurrà i livelli di assorbimento metallico nei tubi e in altre parti della macchina, contribuendo a ridurre qualsiasi fondo, come mostrato in questi grafici. Una taratura non corretta, rappresentata dalla linea magenta, ha aumentato in modo significativo la formazione di ossidi a m più 16 rispetto al campione correttamente tarato, indicato dalla linea blu scuro. Questo comporta una leggera diminuzione dei segnali desiderati a m e un aumento significativo dell'interferenza di fondo indesiderata a m più 16.Un'adeguata lavaggio e un'appropriata diluizione dei campioni in acqua Milli Q garantiranno un fondo minimo e la massima risoluzione delle cellule, mantenendo un equilibrio con la necessità di velocità. Analogamente ai dati di un esperimento rappresentativo mostrati qui, in questo esperimento, perline di polistirene contenenti lantanio 139 ODIUM 140, TERBIO 159, DIUM 169 e LUTEZIO 175 naturali sono state analizzate in modalità di acquisizione cellulare. I dati sono stati analizzati utilizzando FlowJo ed eventuali detriti derivanti da perline rotte sono stati esclusi tramite gating.Il campione correttamente tarato è stato determinato alla portata di 0,74 litri al minuto, come rappresentato dalla linea blu scuro. A questa portata si sono osservate intensità del segnale superiori rispetto a quelle alle portate più basse, e si è visto che questo campione correttamente tarato presentava un segnale più intenso alle masse metalliche M e un segnale inferiore alle masse ossidiche m + 16 rispetto ai segnali non correttamente tarati. Qui viene mostrato un ingrandimento del segnale alle masse M LANTANIO 1 39 e TULIO 1 69.Si noti che la portata del gas di makeup influenza l'intensità del segnale del LANTANIO 139 più di quanto influenzi l'intensità del segnale del tulio 169. Questi grafici mostrano il segnale alle masse ossidiche m + 16, ovvero 155 e 180,5, corrispondenti rispettivamente agli ossidi di LANTANIO 139 + OH 16 e tulio 169 + OH 16. Si osservi che l'aumento della portata del gas di makeup incrementa il segnale della massa 155 molto più di quanto non faccia con il segnale della massa 180,5, poiché il lantanio 139 si ossida più facilmente rispetto al tulio 169.Le intensità del segnale di massa m e m più 16 in funzione della portata del gas di makeup sono rappresentate qui. Le icone piene rappresentano la massa M, mentre le icone aperte rappresentano la massa M più 16; i colori delle linee corrispondono alla rispettiva massa M. Si noti che le intensità del segnale di LANTANIO 139 e PRASEODIMIO 141 sono fortemente influenzate dalla portata del gas di makeup, arrivando persino a un punto in cui è presente più ossido di massa M più 16 rispetto alla massa M. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come avviare correttamente il CyTOF, tararlo opportunamente, eseguire i propri campioni e infine pulire e spegnere correttamente lo strumento al termine delle analisi giornaliere.

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