Indagini su Alterazioni della funzione del circuito ippocampale seguito lieve trauma cranico

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di sondare i cambiamenti nella funzione di rete delle aree cerebrali interessate da un modello sperimentale di lesione cerebrale traumatica lieve Gli esperimenti iniziano somministrando una lesione a percussione fluida laterale a un topo, che imita sia la patologia che la sintomatologia della lesione cerebrale traumatica lieve umana. Come secondo passo, un comportamento dipendente dall'ippocampo, la risposta alla paura condizionata contestuale viene utilizzata per valutare il deterioramento cognitivo indotto da lesioni cerebrali. Successivamente, le registrazioni extracellulari e intracellulari insieme a coloranti sensibili al voltaggio vengono utilizzate per determinare i cambiamenti specifici a livello regionale nell'equilibrio sinaptico tra trasmissione sinaptica eccitatoria e inibitoria Nella regione di interesse, l'ippocampo, i risultati mostrano cambiamenti specifici della sottoregione nell'efficacia sinaptica netta nell'ippocampo in base alle differenze tra i topi di controllo e quelli con lesioni cerebrali nelle tre tecniche di registrazione descritte.

Il vantaggio principale di questo approccio è la capacità di discernere gli effetti sia dello stato patologico che dei potenziali agenti terapeutici su più scale fisiologiche, consentendo un quadro più coerente di questi deficit circuitali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulle lesioni cerebrali traumatiche, come ad esempio quali neuroni sono più suscettibili alle lesioni e quindi danno il maggior contributo alla disfunzione ippocampale dopo una lesione. Le implicazioni del nostro approccio si estendono al trattamento delle lesioni cerebrali traumatiche in quanto ci consente di delineare prima i meccanismi sottostanti e quindi sviluppare potenziali terapie per ripristinare una fisiologia dei droidi nelle aree danneggiate da lesioni cerebrali.

In questa procedura, anestetizzare il topo utilizzando una miscela di ketamina e xilazina somministrata per via intraperitoneale. Successivamente, eseguire una craniectomia C sull'area parietale destra utilizzando un dente con un diametro esterno di tre millimetri. Quindi fissare il mozzo dell'ago di blocco dell'esca sulla craniectomia C utilizzando cianoacrilato e acrilico dentale.

24 ore dopo anestetizzare il topo utilizzando isof fluoro per inalazione Una volta ripresa la respirazione normale, ma prima che il topo sia diventato sensibile alla stimolazione, erogare un impulso di 20 millisecondi di soluzione salina al cranio tramite il dispositivo per lesioni a percussione fluida. Rimuovere il mozzo immediatamente dopo l'infortunio. Successivamente rianestetizzare il topo utilizzando fluoro e suturare il cuoio capelluto.

Maneggiare il mouse per due giorni consecutivi prima dell'addestramento alla risposta alla paura condizionata. Il giorno dell'allenamento, posizionare il mouse nella camera di condizionamento per tre minuti prima di somministrare uno shock a pavimento da 1,5 minuti per due secondi. Quindi lasciare il mouse nella camera per altri 30 secondi prima di rimuoverlo.

Dopo un periodo di ritardo di 24 ore, riportare il topo nella camera di condizionamento per cinque minuti, quindi valutare il congelamento a intervalli di cinque secondi sette giorni dopo la lesione. Preparare un litro di liquido cerebrospinale artificiale e 250 millilitri di soluzione di taglio del saccarosio. Assicurarsi che tutti gli strumenti e le soluzioni utilizzati durante la preparazione della fetta di cervello siano ghiacciati con ghiaccio.

Anestetizzare il topo utilizzando il fluoro in modo rapido e delicato. Togliete il cervello dal topo e mettetelo nel saccarosio. Quindi, taglia il cervello.

Posiziona la superficie del cervello appena tagliata su una goccia di supercolla sul palco Vibram davanti a un blocco di agar. Tagliare fette coronali spesse 350 micron. Dovresti essere in grado di ottenere quattro o cinque fette con il circuito ippocampale intatto.

Dopodiché, incubare le fette per almeno un'ora a 37 gradi Celsius. Ora prepara da due a cinque mega ohm di elettrodi in vetro silicato bo. Utilizzando l'estrattore verticale, trasferire una fetta nella camera, quindi posizionare un elettrodo sul supporto dell'elettrodo per la registrazione del potenziale del campo extracellulare.

Posizionare l'elettrodo stimolante sopra il tratto assonale sulla fetta, come il percorso perente o i collaterali di Shafer. Quindi continuare ad abbassare l'elettrodo di registrazione nella fetta. Successivamente, erogare un singolo impulso elettrico per evocare il potenziale postsinaptico extracellulare del campo.

Continuare la stimolazione variando la profondità dell'elettrodo di registrazione tra gli stimoli quando si ottiene la risposta massima. Questa è un'indicazione che gli elettrodi sono allo stesso modo. L'analisi del livello Z consiste tipicamente in misurazioni, confrontando l'ampiezza della raffica di fibre sia in topi con lesioni cerebrali che in topi con finzione per valutare l'attivazione presinaptica, nonché confrontando la pendenza del F-E-P-S-P per valutare l'attivazione post-sinaptica per la registrazione del patch clamp di nuovo, trasferire una fetta nella camera e abbassare l'elettrodo di registrazione.

Avvicinarsi a una cella con una pressione positiva sull'elettrodo per assicurarsi che l'elettrodo di registrazione non si ostruisca mentre si muove verso il basso attraverso il tessuto. Quando l'elettrodo tocca delicatamente la cella, applicare una pressione negativa per creare una giga tenuta tra l'elettrodo e la membrana plasmatica. Successivamente, applicare brevi raffiche di pressione negativa per rompere la membrana plasmatica per ottenere la configurazione dell'intera cellula.

Elimina il transitorio di capacità utilizzando l'amplificatore e compensa la resistenza in serie per garantire misure accurate. Quindi quantificare e confrontare il tasso e le dimensioni delle correnti sinaptiche spontanee sia nei topi con lesioni cerebrali che nei controlli operati da sham. In questa fase, preparare il brodo di colorante mescolando un milligrammo di colorante tre onap DHQ in 50 microlitri di etanolo.

Erogare due aliquote da microlitro in tubi avvolti in carta stagnola e conservare a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Preparare la soluzione colorante funzionante ogni giorno in una diluizione da uno a 200 in A CSF. Quindi incubare una fetta sulla carta da filtro inumidita A CSF e colorare con 90 microlitri di colorante per 16 minuti.

Successivamente, sciacquarlo e posizionarlo nella camera di registrazione dell'interfaccia. Posizionare gli elettrodi di stimolazione e registrazione come descritto nel campo extracellulare. Potenziale registrazione.

Regolare l'intensità della stimolazione luminosa fino a quando la risposta non è centrata al centro della fotocamera. Le immagini di intervallo vengono in genere acquisite a una velocità compresa tra 500 e 1000 fotogrammi al secondo. Attivare l'otturatore per la stimolazione luminosa 200 millisecondi prima della stimolazione elettrica per consentire la stabilizzazione del rapido sbiancamento iniziale delle foto.

Pausa di 10 secondi tra le prove. Alternare le prove di acquisizione tra stimolazione elettrica e stimolazione non elettrica per consentire la successiva sottrazione del fondo di stimolazione non elettrica. Quindi registrare l'intensità della luce a riposo prima di aprire l'otturatore.

Ogni prova VSD può essere analizzata come un filmato delle letture della fluorescenza. Cioè, ogni prova è una matrice tridimensionale di dati con valori in dimensioni spaziali X e Y nel tempo. Registra da 10 a 12 prove VSD in ciascuna condizione di test e calcola la variazione di fluorescenza normalizzata pre-illuminazione intrapixel in base al manoscritto allegato.

Questa figura mostra un esempio di registrazione F-E-P-S-P nell'area CA uno. La prima deflessione verso il basso è l'artefatto dello stimolo, seguito dalla raffica di fibre presinaptiche, e poi dalla F-E-P-S-P. Ecco le curve di input-output che descrivono una diminuzione dell'efficacia sinaptica netta in CA 1 a seguito di lesione da percussione fluida.

Ed ecco le curve input-output che descrivono un aumento dell'efficacia sinaptica netta nel giro dentato dopo FPI. Ecco un esempio di corrente post-sinaptica eccitatoria spontanea da una cellula parametallica CA one. Ecco un esempio del treno del potenziale d'azione da una cellula parametallica CA one e un interneurone ca a picco rapido.

Questo è un interneurone inibitorio riempito di giallo di Lucifero ca one senza spine dendritiche, e qui c'è un neurone parametallico riempito di giallo di Lucifero con spine dendritiche. Queste figure mostrano una fetta di ippocampo coronale di topo. I pixel da giallo a rosso rappresentano l'attività eccitatoria nell'area circa 14 millisecondi dopo la stimolazione collaterale afferente dello shafer.

Il rosso indica una maggiore depolarizzazione, mentre il giallo indica una depolarizzazione minore ma comunque significativa. I pixel blu rappresentano i siti di attività inibitoria nell'area circa 1 56 millisecondi dopo la stessa stimolazione collaterale di Shafer afferente, mentre il blu più scuro indica una maggiore iperpolarizzazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come combinare più tecniche di registrazione ex vivo per affrontare una condizione patologica clinicamente rilevante che coinvolge una disfunzione del circuito.