Indagini su Alterazioni della funzione del circuito ippocampale seguito lieve trauma cranico

L'obiettivo generale del seguente esperimento è indagare i cambiamenti nella funzione delle reti delle aree cerebrali interessate da un modello sperimentale di trauma cranico lieve. Gli esperimenti iniziano somministrando a un topo una lesione da percussione fluidica laterale, che riproduce sia la patologia sia la sintomatologia del trauma cranico lieve umano. Come secondo passaggio, si utilizza un comportamento dipendente dall'ippocampo, la risposta condizionata al timore contestuale, per valutare il deficit cognitivo indotto dalla lesione cerebrale. Successivamente, registrazioni extracellulari e intracellulari, insieme a coloranti sensibili al voltaggio, vengono impiegate per determinare i cambiamenti specifici per regione nell'equilibrio sinaptico tra trasmissione sinaptica eccitatoria e inibitoria. Nella regione di interesse, l'ippocampo, i risultati mostrano cambiamenti specifici per sottoregione nell'efficacia sinaptica netta nell'ippocampo, basati sulle differenze tra i topi di controllo e quelli con lesione cerebrale, osservate mediante le tre tecniche di registrazione descritte.

Il principale vantaggio di questo approccio è la capacità di distinguere gli effetti sia dello stato patologico sia dei potenziali trattamenti terapeutici su molteplici scale fisiologiche, consentendo una visione più coerente dei deficit di questo circuito. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo al trauma cranico, ad esempio identificando specificamente quali neuroni sono più suscettibili al danno e quindi apportano il contributo maggiore alla disfunzione ippocampale dopo la lesione. Le implicazioni del nostro approccio si estendono al trattamento del trauma cranico, poiché ci permettono di delineare innanzitutto i meccanismi sottostanti e successivamente di sviluppare potenziali terapie per ripristinare una fisiologia normale nelle aree danneggiate dal trauma cerebrale.

In questo procedimento, anestetizzare il topo utilizzando una miscela di chetamina e xilazina somministrata per via intraperitoneale. Successivamente, eseguire una craniectomia C sull'area parietale destra utilizzando un trapano con diametro esterno di tre millimetri. Quindi fissare il connettore dell'ago sul sito della craniectomia C utilizzando cianoacrilato e acrilico dentale.

24 ore dopo anestetizzare il topo utilizzando isoflurano mediante inalazione. Una volta ripresa la normale respirazione, ma prima che il topo diventi sensibile alla stimolazione, somministrare un impulso di 20 millisecondi di soluzione salina al cranio tramite il dispositivo per lesione da percussione fluidica. Rimuovere immediatamente il connettore dopo la lesione. Successivamente, re-anestetizzare il topo utilizzando isoflurano e suturare il cuoio capelluto.

Manipolare il topo per due giorni consecutivi prima dell'addestramento alla risposta condizionata alla paura. Nel giorno dell'addestramento, posizionare il topo nella camera di condizionamento per tre minuti prima di somministrare una scossa elettrica al pavimento di 1,5 mA per due secondi. Successivamente, lasciare il topo nella camera per ulteriori 30 secondi prima di rimuoverlo.

Dopo un periodo di attesa di 24 ore, riportare il topo nella camera di condizionamento per cinque minuti, quindi valutare il congelamento a intervalli di cinque secondi sette giorni dopo la lesione. Preparare un litro di liquido cerebrospinale artificiale e 250 millilitri di soluzione criogenica di saccarosio. Assicurarsi che tutti gli strumenti e le soluzioni utilizzati durante la preparazione delle fette cerebrali siano ghiacciati con ghiaccio.

Anestetizzare il topo utilizzando isoflurano in modo rapido e delicato. Rimuovere il cervello dal topo e posizionarlo nella soluzione di saccarosio. Successivamente, sagomare il cervello.

Posizionare la superficie appena tagliata del cervello su una goccia di colla istantanea sulla piattaforma del Vibram, davanti a un blocco di agar. Tagliare sezioni coronali spesse 350 micron. Si dovrebbero ottenere quattro o cinque sezioni con il circuito ippocampale intatto.

Dopo di ciò, incubare le sezioni per almeno un'ora a 37 gradi Celsius. Preparare ora alcune elettrodi in vetro borosilicato da due a cinque megaohm. Utilizzando il tiratore verticale, trasferire una sezione nella camera, quindi posizionare un elettrodo sul supporto dell'elettrodo per la registrazione del potenziale di campo extracellulare.

Posizionare l'elettrodo stimolante al di sopra del tratto assonale nella sezione, come il perent path o i collaterali di Shafer. Successivamente, continuare ad abbassare l'elettrodo di registrazione nella sezione. Quindi, applicare un singolo impulso elettrico per evocare il potenziale postsinaptico extracellulare di campo.

Continuare la stimolazione variando la profondità dell'elettrodo di registrazione tra uno stimolo e l'altro quando si raggiunge la risposta massimale. Questo indica che gli elettrodi si trovano allo stesso livello. L'analisi del livello Z consiste tipicamente in misurazioni che confrontano l'ampiezza del volley delle fibre sia nei topi con lesione cerebrale sia in quelli sottoposti a intervento fittizio (sham) per valutare l'attivazione pre-sinaptica, oltre a confrontare la pendenza del F-E-P-S-P per valutare l'attivazione post-sinaptica. Per la registrazione con patch clamp, trasferire nuovamente una sezione nella camera e abbassare l'elettrodo di registrazione.

Avvicinarsi a una cellula con pressione positiva sull'elettrodo per assicurare che l'elettrodo di registrazione non si ostruisca mentre si sposta attraverso il tessuto. Quando l'elettrodo tocca delicatamente la cellula, applicare pressione negativa al fine di creare un sigillo giga tra l'elettrodo e la membrana plasmatica. Successivamente, applicare brevi impulsi di pressione negativa per rompere la membrana plasmatica e ottenere la configurazione in intera cellula.

Eliminare il transitorio di capacità utilizzando l'amplificatore e compensare la resistenza in serie per garantire misurazioni accurate. Quindi quantificare e confrontare la velocità e l'ampiezza delle correnti sinaptiche spontanee sia nei topi con lesione cerebrale sia nei controlli sottoposti a intervento fittizio. In questo passaggio, preparare la soluzione madre del colorante mescolando un milligrammo di dye three onap DHQ in 50 microlitri di etanolo.

Distribuire aliquote di due microlitri in provette avvolte nella pellicola di alluminio e conservare a meno 20 gradi Celsius. Preparare giornalmente la soluzione di colorante working in diluizione 1:200 in A CSF. Quindi incubare una sezione su carta filtrante inumidita con A CSF e colorare con 90 microlitri di colorante per 16 minuti.

Dopo di ciò, risciacquarlo e posizionarlo nella camera di registrazione dell'interfaccia. Posizionare gli elettrodi di stimolazione e di registrazione come descritto nel campo extracellulare. Registrazione del potenziale.

Regolare l'intensità della stimolazione luminosa fino a quando la risposta è centrata nel mezzo della telecamera. Le immagini di profondità sono tipicamente acquisite a una frequenza compresa tra 500 e 1000 fotogrammi al secondo. Attivare l'otturatore per la stimolazione luminosa 200 millisecondi prima della stimolazione elettrica per permettere al rapido sbiancamento fotoindotto di stabilizzarsi.

Pausa di 10 secondi tra un tentativo e l'altro. Alterna i tentativi di acquisizione tra stimolazione elettrica e stimolazione non elettrica per consentire successivamente la sottrazione del fondo relativo alla stimolazione non elettrica. Quindi registra l'intensità luminosa di riposo prima di aprire l'otturatore.

Ogni prova con VSD può essere analizzata come un filmato di letture di fluorescenza. Ogni prova corrisponde cioè a una matrice tridimensionale di dati con valori nelle dimensioni spaziali X e Y nel tempo. Registrare da 10 a 12 prove con VSD per ciascuna condizione sperimentale e calcolare la variazione di fluorescenza normalizzata rispetto all'illuminazione pre-stimolo per ciascun pixel, come descritto nel manoscritto allegato.

Questa figura mostra un esempio di registrazione F-E-P-S-P nell'area CA1. La prima deflessione discendente è l'artefatto dello stimolo, seguito dal volo di fibre presinaptiche e poi dal F-E-P-S-P. Qui sono riportate le curve input-output che illustrano una riduzione dell'efficacia sinaptica netta in CA1 dopo una lesione da percussione fluida.

Ecco le curve input-output che mostrano un aumento dell'efficacia sinaptica netta nel giro dentato dopo la FPI. Qui è riportato un esempio di corrente postsinaptica eccitatoria spontanea da una cellula parametale del CA1. Ecco un esempio di scarica di potenziali d'azione da una cellula parametale del CA1 e da un interneurone del CA1 a spiking rapido.

Questo è un interneurone inibitorio del CA1 riempito con giallo di Lucifer privo di spine dendritiche, mentre questo è un neurone paramediano del CA1 riempito con giallo di Lucifer con spine dendritiche. Queste immagini mostrano una sezione coronale dell'ippocampo di topo. I pixel dal giallo al rosso rappresentano l'attività eccitatoria nell'area CA1, 14 millisecondi dopo la stimolazione collaterale afferente di Schaffer.

Il rosso indica una maggiore depolarizzazione, mentre il giallo indica una depolarizzazione minore ma comunque significativa. I pixel blu rappresentano i siti di attività inibitoria nell'area CA1 a 56 millisecondi dopo la stessa stimolazione collaterale afferente di Schaffer, mentre il blu più scuro indica una maggiore iperpolarizzazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come combinare diverse tecniche di registrazione ex vivo per affrontare una condizione patologica clinicamente rilevante che coinvolge un malfunzionamento del circuito.