Alta efficienza, sito-specifica trasfezione di cellule aderenti con siRNA mediante matrici microelettrodi (MEA)

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere una trasfezione sito-specifica in cellule aderenti. Questo risultato si ottiene coltivando un monostrato di cellule su un array di microelettrodi. Come secondo passaggio, l'applicazione di un impulso elettrico a determinati elettrodi induce l'elettroporazione delle cellule bersaglio aderenti sulla superficie degli elettrodi.

Questo porta alla formazione di pori nella membrana cellulare che permettono l'ingresso di molecole esogene nella cellula. Le cellule bersaglio possono quindi essere analizzate per rilevare il fenotipo risultante mediante un saggio appropriato. La tecnica di trasfezione su scala microscopica qui descritta presenta diversi vantaggi chiave rispetto alle tecniche convenzionali di trasfezione, come l'elettroporazione su larga scala o la trasfezione chimica.

A, ci permette di ottenere un controllo spaziale eccellente sul processo di trasfezione stesso e ci aiuta a trasfettare singole cellule o gruppi di cellule con elevata efficienza, anche in linee cellulari difficili da trasfettare. B, si tratta di un approccio facilmente scalabile che ci consente di realizzare saggi molecolari ad alto rendimento. Uno dei principali vantaggi dell'uso di un'area microelettrica per la trasfezione sito-specifica è che consente la valutazione funzionale simultanea delle cellule bersaglio, come ad esempio elettrofisiologia quantitativa e modifiche morfologiche.

Per iniziare la procedura, sterilizzare l'MEA in un autoclave, quindi trasferire l'MEA autoclavato in una cappa a flusso laminare e posizionarlo in una piastra di Petri sterile standard in polistirene prima di seminare le cellule sull'MEA; sterilizzare la cappa a flusso laminare attivando la lampada UV per 20 minuti. Se l'MEA è sensibile alla luce UV, coprire la piastra di Petri contenente l'MEA con carta d'alluminio sterile mentre la cappa è sotto illuminazione UV. Successivamente, trattare la superficie dell'MEA con 10 microgrammi per millilitro di fibronectina per uno o due ore per le cellule HEL0.

Eseguire un lavaggio con acqua deionizzata e lasciare asciugare l'MEA all'aria nella cappa a flusso laminare. Successivamente, raccogliere le cellule da una linea cellulare in crescita di cellule mammifere aderenti utilizzando tripsina ETTA e sospenderle alla concentrazione di 100-200 cellule per microlitro in un millilitro di mezzo cellulare per la semina. Quindi, depositare una goccia di 20-30 microlitri di mezzo contenente le cellule sull'MEA.

Assicurarsi che sia sufficientemente grande da coprire tutti gli elettrodi sulla MEA. Successivamente, trasferire la piastra di Petri con la MEA in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Due-quattro ore.

Dopo aver seminato le cellule, trasferire la piastra di Petri con la MEA dall'incubatrice all'armadietto a flusso laminare. Successivamente, aggiungere delicatamente da 400 a 500 microlitri di mezzo preriscaldato a 37 gradi Celsius nel pozzetto della MEA; quindi verificare al microscopio che le cellule siano ancora attaccate e uniformemente distribuite sulla superficie della MEA. Successivamente, riposizionare la MEA nell'incubatrice. Otto-dodici ore dopo la semina delle cellule, effettuare uno-due lavaggi con PBS per rimuovere eventuali cellule morte.

In un esperimento tipico, le cellule sono solitamente pronte per la trasfezione da 24 a 48 ore dopo il seeding. Per mantenere una costanza nell'efficienza dell'elettroporazione, si raccomanda di attendere fino a quando la coltura è prossima alla confluenza prima di procedere con l'elettroporazione. Per ottenere una trasfezione sarna altamente efficiente, è necessario innanzitutto determinare i parametri ottimali di impulso di tensione per l'elettroporazione, specifici per una determinata MEA.

Di seguito viene descritta una serie di passaggi sperimentali che prevedono l'uso di ioduro di propidio per determinare i parametri ottimali di elettroporazione prima dell'elettroporazione stessa. Preparare una soluzione di 300-500 microlitri contenente 30 microgrammi per millilitro di PI in tampone per elettroporazione freddo su ghiaccio e 400 microlitri di soluzione di calcio AM 4 micromolare in PBS. Successivamente, trasferire la MEA dall'incubatore all'armadio a flusso laminare.

Rimuovere il terreno cellulare dalla MEA ed eseguire un lavaggio con PBS. Successivamente, aggiungere da 300 a 500 microlitri di tampone di elettroporazione freddo su ghiaccio con pi. Poi posizionare un distanziale di un millimetro di altezza nella MEA.

È estremamente importante assicurarsi che non entri in contatto con le cellule al centro della MEA. Successivamente, collegare la MEA all'interconnessione elettrica e selezionare gli elettrodi desiderati per l'elettroporazione. In seguito, applicare impulsi elettrici con l'ampiezza e la durata desiderate agli elettrodi target per la fase di elettroporazione.

Abbassare il catodo in acciaio rivestito con carta d'alluminio nel pozzetto MEA finché non entra in contatto con lo spessore di un millimetro. Immediatamente dopo, applicare impulsi elettrici agli elettrodi selezionati. Successivamente, ripetere il passaggio con un diverso insieme di elettrodi in base al disegno sperimentale.

Nel nostro esperimenti con cellule helo, abbiamo osservato che un singolo impulso di tensione di ampiezza compresa tra tre volt e nove volt e di durata compresa tra un millisecondo e 10 millisecondi, con un elettrodo di dimensioni pari a 100 micrometri, ha portato a un'elettroporazione riuscita con un minimo di morte cellulare. Immediatamente dopo l'applicazione degli impulsi di tensione, trasferire la MEA nell'incubatrice per cinque minuti.

Dopo un periodo di incubazione di cinque-dieci minuti, rimuovere delicatamente lo spaziatore dalla MEA. Successivamente rimuovere il 75% del buffer di elettroporazione dal pozzetto della MEA e sostituirlo con mezzo cellulare tiepido. Trasferire quindi la MEA nuovamente nell'incubatore.

Dopo un periodo di incubazione di due-quattro ore, sostituire il mezzo cellulare nel pozzetto della MEA con 300-500 microlitri di soluzione di calcio AM a quattro micromoli in PBS. Riposizionare la MEA nell'incubatore per altri 30 minuti dopo l'incubazione delle cellule con calcio AM. Sostituire il calcio AM nel pozzetto con PBS dopo un passaggio di lavaggio, quindi acquisire le immagini fluorescenti delle cellule utilizzando un microscopio ottico con filtri per pi.

L'assunzione di PI dovuta all'elettroporazione provoca una fluorescenza rossa delle cellule, mentre il calcio am induce una fluorescenza verde nelle cellule vive. La vitalità cellulare per ciascun elettrodo può essere stimata mediante questa equazione, e l'efficienza dell'elettroporazione per ciascun elettrodo può essere stimata mediante questa equazione. Una volta determinati i parametri ottimali di elettroporazione, questi possono essere utilizzati per il rilascio mirato di una molecola, e la procedura di elettroporazione per molecole di siRNA è identica a quella per pi.

Qui viene mostrata la somministrazione specifica in sito di ioduro di propidio in cellule helo su un elettrodo da 200 micrometri. Il saggio vitale basato sul calcio è stato eseguito due ore dopo l'elettroporazione. Le cellule vive sono indicate dalla fluorescenza verde, mentre la fluorescenza rossa dimostra l'assorbimento di pi da parte delle cellule sull'elettrodo.

Ecco l'immagine sovrapposta. Queste cellule sono state elettroporate e sono vive, mentre queste cellule sono morte. Questa figura mostra la transfezione di irna marcata con rumina su un elettrodo di diametro di 200 micrometri, e questa figura mostra la transfezione di cellule HeLa con irna marcata con Alexa 488 su un elettrodo di diametro di 100 micrometri.

Le frecce bianche indicano le cellule trasfettate con irna, mentre le frecce nere indicano le cellule morte. La tecnica qui dimostrata può essere estesa a diverse linee cellulari, incluse quelle primarie difficili da trasfettare, e per trasfettarle con molecole più grandi come plasmidi e proteine.