Name: Alta efficienza, sito-specifica trasfezione di cellule aderenti con siRNA mediante matrici microelettrodi (MEA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Impara la trasfezione sito-specifica di cellule aderenti con siRNA mediante matrici microelettrodi. Questo metodo elettroporativo consente il controllo spaziale preciso e l'introduzione efficiente di molecole esogene nelle cellule target.

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1. MEA Preparazione <ol><li> MEA per l&#39;uso negli esperimenti di elettroporazione possono essere fabbricati usando la tecnica standard di fotolitografia come descritto in precedenza 18 o acquistati direttamente da fornitori di produttori MEA come i sistemi multicanale <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> e Alpha MED Scientific, Inc. <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">( http://www.MED64.com)</a> . Le MEA utilizzati nei nostri esperimenti sono stati realizzati in-house presso l&#39;impianto camera pulita in Arizona State University, che è gestito dal Centro per la Ricerca Elettronica dello Stato Solido (CSSER). I MEA utilizzati nei nostri esperimenti avuto 32 elettrodi indio ossido di stagno in un 8 del 4 array con dimensioni elettrodi diametro 50-200 micron all&#39;interno di un vetro 1 cm di diametro interno bene. Bene il vetro è stato incollato sul usando MEA polidimetilsilossano (PDMS). </li><li> Sterilizzare il MEA in autoclave prima cella seeding. Altri metodi di sterilizzazione come un ammollo in 70% etanolo, trattamento UV e trattamento con acqua calda come descritto altrove può anche essere utilizzato fintanto che non compromettere l&#39;integrità del MEA. </li><li> Trasferire il autoclavato MEA di una cappa a flusso laminare e metterla in un piatto polistirene standard sterile Petri. Prima della semina di cellule sulla MEA, sterilizzare la cappa a flusso laminare per accendere la luce UV per 20 min. Se la MEA è sensibile alla luce UV coprire la piastra Petri contenente la MEA con foglio di alluminio sterile mentre la cappa a flusso è sotto illuminazione UV. </li></ol> 2. Cellule semina sul MEA <ol><li> Cellule raccolto da una linea cellulare di esecuzione aderenti cellule di mammifero usando Tripsina / EDTA e alzarle una concentrazione di 100-200 cellule / microlitro in media ml 1 cella per placcatura. Nei nostri esperimenti abbiamo avuto successo nella coltura delle cellule NIH 3T3 fibroblasti linea, linea di cellule HeLa e primari neuroni corticali e ippocampali sulla MEA. </li><li&gt; Mettere a 20-30 ml di goccia media con celle del MEA. Trasferire la piastra di Petri con la MEA per l&#39;incubatore. È importante garantire che la dimensione della goccia cella è sufficiente a coprire tutti gli elettrodi sulla MEA. </li><li> 2 ore dopo la semina delle cellule trasferire la capsula di Petri con la MEA dall&#39;incubatore a cappa a flusso laminare e aggiungere delicatamente 400-500 microlitri di pre supporti riscaldati (37 ° C) al MEA bene. Controllare al microscopio per assicurare che le cellule siano ancora attaccato e distribuito uniformemente sulla superficie MEA. Trasferire il MEA per l&#39;incubatrice. Il periodo di attesa 2 ore prima dell&#39;aggiunta di supporto assicura tempo sufficiente per le cellule di aderire alla superficie MEA. Aggiunta del supporto delle cellule troppo presto dopo la semina le cellule possono lavare via le cellule. Se le cellule non aderiscono sulla MEA, la sua superficie può essere trattata con fattori di adesione cellulare quali aspolylysine, fibronectina e laminina per migliorare l&#39;adesione delle cellule. Nei nostri esperimenti sulle cellule HeLa che di solito trattare la superficie con MEA fibronectin (10 pg / ml) per 1-2 ore. </li><li> 8-12 ore dopo la semina delle cellule, eseguire 1-2 lavaggi con PBS per rimuovere le cellule morte. Medie cellulare può sostituire ogni 24-48 ore, se necessario. In un tipico esperimento, le cellule sono pronte per la trasfezione di solito 24-48 ore dopo la semina. Per mantenere la coerenza in termini di efficienza elettroporazione si consiglia di attendere fino a quando la cultura è almeno l&#39;80% confluenti prima di elettroporazione. </li></ol> 3. Specifici per un sito trasfezione di siRNA <ol><li> Preparare una soluzione di acido nucleico. Per la trasfezione siRNA, preparare una soluzione di 1-2 siRNA pM elettroporazione in tampone ghiacciato elettroporazione per ottenere un volume finale di 200-400 microlitri. In questo articolo il video che dimostrano la trasfezione di cellule HeLa con Alexa 488 coniugato strapazzate sequenza di siRNA. </li><li> Trasferire il MEA con le cellule dal termostato a cappa sterile a flusso laminare. Rimuovere il supporto delle cellule del MEA ed eseguire un lavaggio con PBS. Successivamente, aggiungere 200-400 microlitri della ice freddo 1 pM elettroporazione soluzione siRNA al pozzo. </li><li> Applicare anodici impulsi quadri elettrici agli elettrodi mirati (Fare riferimento al punto 4 per la determinazione dei parametri ottimali di impulso elettrico). Nei nostri esperimenti abbiamo utilizzato un Instruments pragmatiche 2414A generatore di forme d&#39;onda per generare impulsi elettrici e un sistema dual-inline-package (DIP) 16 clip passante di entrare in contatto con i rilievi dei titoli di MEA. Il generatore di forme d&#39;onda può essere connesso alla clip DIP demultiplexor tramite una scheda a circuito stampato per fornire selettività dei singoli elettrodi. Per l&#39;elettrodo di riferimento, posizionare un catodo di acciaio nei media cella. Riducendo l&#39;elettrodo di riferimento acciaio nei media è estremamente importante assicurare che non fa contatto con la superficie MEA. Al contatto, può causare danni alle cellule e il MEA. Si raccomanda di ridurre l&#39;elettrodo di riferimento a una posizione di 1 mm sopra le celle. Un distanziatore con un&#39;altezza di 1 mm può essere posizionato nel pozzo per assistere nel posizionamento del refrimento elettrodo. Un approccio alternativo utilizzando un elettrodo di riferimento esterno è utilizzare elettrodi adiacenti come catodo-anodo coppie. </li><li> Subito dopo l&#39;applicazione degli impulsi elettrici agli elettrodi mirati sulla MEA, trasferire il ritorno alla MEA l&#39;incubatrice. Dopo un periodo di incubazione di 5 minuti, delicatamente sostituire il 75% del tampone di elettroporazione con pre-riscaldato (37 ° C) supporti cellulari. Successivamente, l&#39;imaging fluorescente può essere fatto per confermare la consegna di siRNA fluorescenti etichettato alle cellule. </li></ol> 4. Elettroporazione dei parametri di ottimizzazione <ol><li> Per determinare i parametri ottimali di impulsi elettrici per esperimenti di design elettroporazione, elettroporazione per un intervallo di valori di ampiezza dell&#39;impulso, durata dell&#39;impulso, e il numero di impulsi. Nella nostra esperienza con cellule HeLa, abbiamo osservato che un singolo impulso di tensione di ampiezza da 3 V a 9 V, e la durata di 1 msec a 10 msec per una dimensione di 100 pm elettrodo portato a elettroporazione successo con mila morte delle cellule Nimal. È nostra raccomandazione che un parametro variabile a un tempo e altri sono mantenute costanti. Per quantificare l&#39;efficienza di elettroporazione per ciascuno dei parametri di impulso, usiamo ioduro di propidio (PI), un colorante impermeant cella macchie materiale nucleico, e la metodologia basata assay vivo, come descritto nelle fasi 4,2-4,5. </li><li> Stabilire una coltura cellulare sulla MEA seguendo le indicazioni riportate ai punti 1 e 2. </li><li> Prima di preparare una elettroporazione 300-500 microlitri di 30 ug / ml soluzione PI in tampone ghiacciato elettroporazione e 400 pl di 4 um calcien AM soluzione in PBS. </li><li> Trasferire la MEA dall&#39;incubatore alla cappa a flusso laminare. Rimuovere il supporto delle cellule del MEA ed eseguire un lavaggio con PBS. Successivamente, aggiungere 300-500 microlitri del tampone freddo elettroporazione ghiaccio con PI. </li><li> Applicare impulsi elettrici con ampiezza di pulsazione desiderata e la durata agli elettrodi mirati (Le attrezzature utilizzate nei nostri esperimenti per la generazione e l&#39;applicazione del eletimpulso tric al MEA è descritto nel passaggio 3.3). Per l&#39;elettrodo di riferimento o abbassare un elettrodo di acciaio nel buffer elettroporazione nel MEA pozzo o utilizzare l&#39;elettrodo vicino come riferimento. Selettivamente applicando impulsi di ampiezza variabile o durate di elettrodi diversi esperimenti multipli può essere eseguita sul dispositivo stesso. Per esempio, su un elettrodo MEA 32, 8 esperimenti possono essere eseguiti suddividendo i 32 elettrodi in 8 gruppi, ognuno composto da 4 elettrodi. Ciascuno degli 8 gruppi possono essere stimolato da un singolo impulso rettangolare di durata tensione 5 msec con ampiezze diverse in 3 V-6 gamma V in incrementi di 0,5 V e un gruppo può essere utilizzato come controllo. </li><li> Immediatamente dopo l&#39;applicazione di impulsi di tensione trasferire il MEA per l&#39;incubatore per 5 min. Successivamente, rimuovere delicatamente il 75% del tampone di elettroporazione dal MEA pozzo e sostituirlo con supporti cellulari caldi. Trasferire il MEA per l&#39;incubatrice. </li><li> Dopo un periodo di incubazione di 2-4 hrsostituzione del supporto di cella nella MEA bene con 300-500 ml di 4 mM calceina AM soluzione in PBS. Trasferire il MEA di incubatrice per altri 30 min. </li><li> Dopo l&#39;incubazione delle cellule con calceina AM, sostituire la calceina AM soluzione nel MEA bene con PBS dopo due lavaggi con PBS. Ottenere immagini fluorescenti di cellule utilizzando con un microscopio ottico con filtri per la PI (eccitazione / emissione - 535 nm/617 nm) e calceina AM (eccitazione / emissione - 490 nm/520 nm). L&#39;assorbimento di PI, a causa di elettroporazione, induce le cellule a fluorescenza rossa e la AM Calcein induce le cellule che sono vivi a fluorescenza verde. Tre possibili scenari che si possono osservare sono: 1) cellule elettroporate e vivo (si fluorescenza sia rosso e verde), 2) cellule vive, ma non elettroporate (sarà solo fluorescenza verde) e 3) le cellule morte a causa di elettroporazione (sarà solo fluorescenza rossa) . La vitalità cellulare è stata calcolata come percentuale del numero totale di cellule vive sull&#39;elettrodo e l&#39;eff elettroporazioneiciency è stata calcolata come percentuale del numero totale di cellule caricate con PI / siRNA. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi La figura 1 mostra il sito-specifica caricamento di cellule HeLa con PI. Si può osservare che le cellule solo sull&#39;elettrodo dimostrano un assorbimento di PI (Figura 1B). Un test dal vivo eseguita elettroporazione messaggio è stato utilizzato per valutare la vitalità delle cellule (Figura 1A). L&#39;efficienza elettroporazione e la vitalità cellulare per l&#39;esempio mostrato nella figura 1 sono 81,8% e 96,1% rispettivamente. Vitalità cellulare ed efficienza elettroporazione può essere ottenuto ottimizzando i parametri di impulso di elettroporazione. Sito-specifica trasfezione di cellule HeLa con siRNA fluorescente etichettato per un impulso di elettroporazione ottimizzato (8 V, 1 msec) è mostrato in Figura 2. L&#39;efficienza elettroporazione per il siRNA a 8 V, 1 msec è risultato essere 74,4 ± 16,0% evitalità cellulare è risultato essere 87,9 ± 8,4% (tutti i dati rappresentati come media ± deviazione standard, N = 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig1.jpg" /> Figura 1. Sito-specifica consegna di PI in cellule HeLa su un elettrodo 200 micron (6 V, 5 msec). A) Calcien saggio basato vivo eseguita due ore dopo l&#39;elettroporazione. Cellule vive sono indicati con fluorescenza verde. B) Red fluorescenza dimostra l&#39;assorbimento da parte delle cellule del PI sull&#39;elettrodo. C) Una immagine sovrapposta di A e B. Le frecce bianche indicano cellule che sono elettroporata e vivo. Le frecce nere indicano cellule che sono morti. Il cerchio bianco in A, B e C indica la sagoma dell&#39;elettrodo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig2.jpg" /> Figura 2. Trasfezione di cellule HeLa con scrambl fluorescente etichettatoLa sequenza di siRNA. A) Immagine di cellule HeLa su un elettrodo di 100 um trasfettate con Alexa 488 siRNA tag (8 V, 1 msec). B) Immagine di nuclei di cellule colorate con DAPI. Il cerchio bianco segna il bordo dell&#39;elettrodo.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo articolo il video che dimostrano l&#39;uso di MEA per il sito-specifica trasfezione di cellule HeLa con strapazzate sequenza di siRNA. Uno dei vantaggi di questa tecnologia è la sua applicabilità a diverse linee cellulari incluse linee cellulari primarie. Il nostro laboratorio ha già dimostrato l&#39;uso di questa tecnologia per il sito-specifica trasfezione di colture primarie neuronali dell&#39;ippocampo di ratto E18 dal giorno di vita e NIH-3T3 strapazzate con sequenze siRNA e GFP plasmide 18, 19.</sup...

<table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Cellulari media: Avanzata MEM L-Glutammina 200 mM Penicillina / streptomicina Siero fetale bovino </td><td> Gibco / Invitrogen Himedia Laboratori / VWR Lonza Group Ltd. Gibco / Invitrogen </td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td> Composizione cella media: 2% FBS, Pennstrep 2% L-glutammina e il 2% in Advance MEM </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 25-053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Alexa 488 e rodamina tagged strapazzate sequrienza siRNA </td><td> Qiagen, Inc. </td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td> Elettroporazione tampone </td><td> Biorad Laboratories </td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td> Generatore di forme d&#39;onda </td><td> Pragmatico </td><td> 2414A </td><td> Qualsiasi forma d&#39;onda / generatore di impulsi che può fornire gli impulsi desiderati possono essere utilizzati. </td></tr></table>

alta efficienza, sito-specifica trasfezione di cellule aderenti con sirna mediante matrici microelettrodi (mea)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

La scoperta della via di RNAi in eucarioti e il conseguente sviluppo di agenti RNAi, come siRNA e shRNA, hanno raggiunto un metodo efficace per mettere a tacere i geni specifici 1-8 per la genomica funzionale e terapie. Una sfida importante coinvolto in studi basati su RNAi è la consegna di agenti RNAi alle cellule bersaglio. Tradizionali non virali tecniche di parto, come l&#39;elettroporazione di massa e metodi di trasfezione chimici spesso non hanno il controllo spaziale necessaria su consegna e permettere l&#39;efficienza di trasfezione poveri 9-12. I recenti progressi nei metodi di trasfezione chimici come lipidi cationici, polimeri cationici e nanoparticelle hanno portato ad efficienze di trasfezione altamente avanzate 13. Tuttavia, queste tecniche ancora non riescono a offrire un controllo preciso dello spazio sulla consegna che possono beneficiare immensamente miniaturizzata tecnologie high-throughput, studi cella singola e le indagini di interazioni cellula-cellula. nt &quot;&gt; I recenti progressi tecnologici nella consegna del gene hanno permesso alta produttività trasfezione di cellule aderenti 14-23, la maggioranza dei quali utilizzano elettroporazione microscala. elettroporazione Microscale offre spazio-temporale preciso controllo di consegna (fino a singole cellule) ed è stato dimostrato per ottenere alte efficienze 19, 24-26. Inoltre, approcci basati elettroporazione non richiedono un lungo periodo di incubazione (tipicamente 4 ore) con complessi siRNA e DNA come necessario in metodi di trasfezione base chimica e causare l&#39;immissione diretta di siRNA nudo e DNA molecole nel citoplasma cellulare. Di conseguenza espressione genica può essere ottenuto fino a sei ore dopo la trasfezione 27. nostro laboratorio ha precedentemente dimostrato l&#39;utilizzo di matrici di microelettrodi (MEA) per sito-specifica trasfezione aderenti in colture cellulari di mammifero 17-19. Nell&#39;approccio basato MEA, la consegna del carico utile genetica avviene tramite localizzato micro-scala electroporatisu di cellule. Una applicazione di impulsi elettrici agli elettrodi selezionati genera locale campo elettrico che conduce alla elettroporazione di cellule presenti nella regione degli elettrodi stimolati. Il controllo indipendente delle micro-elettrodi fornisce controllo spaziale e temporale sopra trasfezione e permette anche esperimenti di trasfezione multipli basati da eseguire sulla stessa cultura aumentando la produttività e riducendo sperimentale cultura a cultura variabilità. Qui si descrive l&#39;apparato sperimentale e il protocollo per la trasfezione mirata di aderenti cellule HeLa con una fluorescente tag criptato siRNA sequenza usando elettroporazione. Lo stesso protocollo può essere utilizzato anche per la trasfezione di vettori plasmidici. Inoltre, il protocollo qui descritto può essere facilmente estesa ad una varietà di linee cellulari di mammifero con modifiche secondarie. Disponibilità commerciale degli accordi ambientali multilaterali con i modelli di elettrodi sia predefiniti e personalizzati rendono questa t accessibile tecnicala maggior parte dei laboratori di ricerca o con attrezzature di base di coltura cellulare.

L&#39;articolo descrive il protocollo per sito-specifica di transfezione criptato sequenza di siRNA in una coltura cellulare di mammifero aderente utilizzando una matrice di microelettrodi (MEA).

Alta efficienza, sito-specifica trasfezione di cellule aderenti con siRNA mediante matrici microelettrodi (MEA)

La scoperta della via dell'RNAi negli eucarioti e il successivo sviluppo di agenti RNAi, come siRNA e shRNA, hanno permesso di ottenere un metodo potente per...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere una trasfezione sito-specifica in cellule aderenti. Questo risultato si ottiene coltivando un monostrato di cellule su un array di microelettrodi. Come secondo passaggio, l'applicazione di un impulso elettrico a determinati elettrodi induce l'elettroporazione delle cellule bersaglio aderenti sulla superficie degli elettrodi.Questo porta alla formazione di pori nella membrana cellulare che permettono l'ingresso di molecole esogene nella cellula. Le cellule bersaglio possono quindi essere analizzate per rilevare il fenotipo risultante mediante un saggio appropriato. La tecnica di trasfezione su scala microscopica qui descritta presenta diversi vantaggi chiave rispetto alle tecniche convenzionali di trasfezione, come l'elettroporazione su larga scala o la trasfezione chimica.A, ci permette di ottenere un controllo spaziale eccellente sul processo di trasfezione stesso e ci aiuta a trasfettare singole cellule o gruppi di cellule con elevata efficienza, anche in linee cellulari difficili da trasfettare. B, si tratta di un approccio facilmente scalabile che ci consente di realizzare saggi molecolari ad alto rendimento. Uno dei principali vantaggi dell'uso di un'area microelettrica per la trasfezione sito-specifica è che consente la valutazione funzionale simultanea delle cellule bersaglio, come ad esempio elettrofisiologia quantitativa e modifiche morfologiche.Per iniziare la procedura, sterilizzare l'MEA in un autoclave, quindi trasferire l'MEA autoclavato in una cappa a flusso laminare e posizionarlo in una piastra di Petri sterile standard in polistirene prima di seminare le cellule sull'MEA; sterilizzare la cappa a flusso laminare attivando la lampada UV per 20 minuti. Se l'MEA è sensibile alla luce UV, coprire la piastra di Petri contenente l'MEA con carta d'alluminio sterile mentre la cappa è sotto illuminazione UV. Successivamente, trattare la superficie dell'MEA con 10 microgrammi per millilitro di fibronectina per uno o due ore per le cellule HEL0.Eseguire un lavaggio con acqua deionizzata e lasciare asciugare l'MEA all'aria nella cappa a flusso laminare. Successivamente, raccogliere le cellule da una linea cellulare in crescita di cellule mammifere aderenti utilizzando tripsina ETTA e sospenderle alla concentrazione di 100-200 cellule per microlitro in un millilitro di mezzo cellulare per la semina. Quindi, depositare una goccia di 20-30 microlitri di mezzo contenente le cellule sull'MEA.Assicurarsi che sia sufficientemente grande da coprire tutti gli elettrodi sulla MEA. Successivamente, trasferire la piastra di Petri con la MEA in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Due-quattro ore.Dopo aver seminato le cellule, trasferire la piastra di Petri con la MEA dall'incubatrice all'armadietto a flusso laminare. Successivamente, aggiungere delicatamente da 400 a 500 microlitri di mezzo preriscaldato a 37 gradi Celsius nel pozzetto della MEA; quindi verificare al microscopio che le cellule siano ancora attaccate e uniformemente distribuite sulla superficie della MEA. Successivamente, riposizionare la MEA nell'incubatrice. Otto-dodici ore dopo la semina delle cellule, effettuare uno-due lavaggi con PBS per rimuovere eventuali cellule morte.In un esperimento tipico, le cellule sono solitamente pronte per la trasfezione da 24 a 48 ore dopo il seeding. Per mantenere una costanza nell'efficienza dell'elettroporazione, si raccomanda di attendere fino a quando la coltura è prossima alla confluenza prima di procedere con l'elettroporazione. Per ottenere una trasfezione sarna altamente efficiente, è necessario innanzitutto determinare i parametri ottimali di impulso di tensione per l'elettroporazione, specifici per una determinata MEA.Di seguito viene descritta una serie di passaggi sperimentali che prevedono l'uso di ioduro di propidio per determinare i parametri ottimali di elettroporazione prima dell'elettroporazione stessa. Preparare una soluzione di 300-500 microlitri contenente 30 microgrammi per millilitro di PI in tampone per elettroporazione freddo su ghiaccio e 400 microlitri di soluzione di calcio AM 4 micromolare in PBS. Successivamente, trasferire la MEA dall'incubatore all'armadio a flusso laminare.Rimuovere il terreno cellulare dalla MEA ed eseguire un lavaggio con PBS. Successivamente, aggiungere da 300 a 500 microlitri di tampone di elettroporazione freddo su ghiaccio con pi. Poi posizionare un distanziale di un millimetro di altezza nella MEA.È estremamente importante assicurarsi che non entri in contatto con le cellule al centro della MEA. Successivamente, collegare la MEA all'interconnessione elettrica e selezionare gli elettrodi desiderati per l'elettroporazione. In seguito, applicare impulsi elettrici con l'ampiezza e la durata desiderate agli elettrodi target per la fase di elettroporazione.Abbassare il catodo in acciaio rivestito con carta d'alluminio nel pozzetto MEA finché non entra in contatto con lo spessore di un millimetro. Immediatamente dopo, applicare impulsi elettrici agli elettrodi selezionati. Successivamente, ripetere il passaggio con un diverso insieme di elettrodi in base al disegno sperimentale.Nel nostro esperimenti con cellule helo, abbiamo osservato che un singolo impulso di tensione di ampiezza compresa tra tre volt e nove volt e di durata compresa tra un millisecondo e 10 millisecondi, con un elettrodo di dimensioni pari a 100 micrometri, ha portato a un'elettroporazione riuscita con un minimo di morte cellulare. Immediatamente dopo l'applicazione degli impulsi di tensione, trasferire la MEA nell'incubatrice per cinque minuti.Dopo un periodo di incubazione di cinque-dieci minuti, rimuovere delicatamente lo spaziatore dalla MEA. Successivamente rimuovere il 75% del buffer di elettroporazione dal pozzetto della MEA e sostituirlo con mezzo cellulare tiepido. Trasferire quindi la MEA nuovamente nell'incubatore.Dopo un periodo di incubazione di due-quattro ore, sostituire il mezzo cellulare nel pozzetto della MEA con 300-500 microlitri di soluzione di calcio AM a quattro micromoli in PBS. Riposizionare la MEA nell'incubatore per altri 30 minuti dopo l'incubazione delle cellule con calcio AM. Sostituire il calcio AM nel pozzetto con PBS dopo un passaggio di lavaggio, quindi acquisire le immagini fluorescenti delle cellule utilizzando un microscopio ottico con filtri per pi.L'assunzione di PI dovuta all'elettroporazione provoca una fluorescenza rossa delle cellule, mentre il calcio am induce una fluorescenza verde nelle cellule vive. La vitalità cellulare per ciascun elettrodo può essere stimata mediante questa equazione, e l'efficienza dell'elettroporazione per ciascun elettrodo può essere stimata mediante questa equazione. Una volta determinati i parametri ottimali di elettroporazione, questi possono essere utilizzati per il rilascio mirato di una molecola, e la procedura di elettroporazione per molecole di siRNA è identica a quella per pi.Qui viene mostrata la somministrazione specifica in sito di ioduro di propidio in cellule helo su un elettrodo da 200 micrometri. Il saggio vitale basato sul calcio è stato eseguito due ore dopo l'elettroporazione. Le cellule vive sono indicate dalla fluorescenza verde, mentre la fluorescenza rossa dimostra l'assorbimento di pi da parte delle cellule sull'elettrodo.Ecco l'immagine sovrapposta. Queste cellule sono state elettroporate e sono vive, mentre queste cellule sono morte. Questa figura mostra la transfezione di irna marcata con rumina su un elettrodo di diametro di 200 micrometri, e questa figura mostra la transfezione di cellule HeLa con irna marcata con Alexa 488 su un elettrodo di diametro di 100 micrometri.Le frecce bianche indicano le cellule trasfettate con irna, mentre le frecce nere indicano le cellule morte. La tecnica qui dimostrata può essere estesa a diverse linee cellulari, incluse quelle primarie difficili da trasfettare, e per trasfettarle con molecole più grandi come plasmidi e proteine.

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Misurazione dell'attività elettrofisiologica delle reti neuronali utilizzando array di microelettrodi

Descriviamo un metodo per esperimenti di salvataggio della deplezione che preserva l'integrità cellulare e l'omeostasi delle proteine. L'adenofemazione consente analisi funzionali delle proteine all'interno di processi biologici che si basano su dinamiche basate sull'actina finemente sintonizzate, come la divisione cellulare mitotica e la miogenesi, a livello di singola cellula.

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Questo protocollo mira a dimostrare come combinare in vitro microelettrodi con dispositivi microfluidici per lo studio della trasmissione del potenziale d'azione in colture neuronali. Analisi dei dati, vale a dire l'individuazione e la caratterizzazione dei materiali di moltiplicazione di potenziali di azione, è eseguita utilizzando un nuovo avanzato, ma facile da usare e liberamente disponibile, strumento computazionale.

Microfluidica di interfacciamento con microelettrodi per studiare comunicazione neuronale e propagazione del segnale assonale

Questo protocollo descrive la trasflessazione di plasmide ad alto rendimento delle cellule dei mammiferi in una piastra di 384 pozzetto che utilizza la tecnologia di espulsione acustica delle goccioline. L'erogazione e il multiplexing del DNA, che richiedono molto tempo e richiedono errori, ma anche il reagente di trasfezione, sono basati su software ed eseguiti da un dispositivo nanodispenser. Le cellule vengono poi semiate in questi pozzi precompilati.

Plasmid di DNA ad alto throughput e trasfezione utilizzando la tecnologia di nanoedispensing acustico

Questo protocollo mira a descrivere una nuova metodologia per misurare la velocità di sparo cardiaca intrinseca utilizzando la registrazione di array di microelettrodi dell'intero tessuto del nodo senoatriale per identificare i difetti di pacemaking nei topi. Gli agenti farmacologici possono anche essere introdotti in questo metodo per studiare i loro effetti sul pacemaking intrinseco.

Registrazione di microelettrodi della velocità di attivazione dei nodi senoatriali per identificare i difetti intrinseci del pacemaking cardiaco nei topi

La combinazione di porzioni laser e array di microelettrodi (MEA) consente registrazioni simili a potenziali d'azione di cardiomiociti primari e derivati da cellule staminali coltivati. La forma d'onda fornisce una visione superiore della modalità d'azione dei composti di prova rispetto alle registrazioni standard. Collega patch-clamp e lettura MEA per ottimizzare ulteriormente la ricerca sulla sicurezza cardio in futuro.

Misurazioni simili al potenziale d'azione indotte dal laser di cardiomiociti su array di microelettrodi per una maggiore predittività della farmacologia di sicurezza

Impara la trasfezione sito-specifica di cellule aderenti con siRNA mediante matrici microelettrodi. Questo metodo elettroporativo consente il controllo spaziale preciso e l'introduzione efficiente di molecole esogene nelle cellule target.

Alta efficienza, sito-specifica trasfezione di cellule aderenti con siRNA mediante matrici microelettrodi (MEA)

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