Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

La comunicazione classica tra elementi pre e postsinaptici coinvolge un potenziale d'azione che arriva al terminale presinaptico, il quale, aumentando il calcio, induce il rilascio di glutammato che attiva i recettori postsinaptici. Tuttavia, l'osservazione che gli astrociti entrano in contatto stretto con la sinapsi ed esprimono recettori per neurotrasmettitori ha modificato questa visione, portando al concetto di sinapsi tripartita. La trasmissione glutammatergica in corso attiverà quindi anche l'astrocita, innescando un aumento del calcio intracellulare.

Il rilascio di trasmettitori gliali, che possono quindi legarsi a recettori extrasinaptici o sinaptici, modula le attività pre e postsinaptiche. Inoltre, gli astrociti esprimono il principale sistema di riassorbimento per il glutammato rilasciato a livello sinaptico. In aggiunta, rimuovono il potassio rilasciato durante la generazione del potenziale d'azione e l'attivazione postsinaptica successiva, attraverso i loro canali del potassio presenti ai terminali pre e postsinaptici.

Questo potassio viene quindi trasportato all'interno della cellula verso zone con livelli extracellulari di potassio più bassi, dove viene rilasciato o diffonde, attraverso le giunzioni comunicanti, negli astrociti adiacenti. Pertanto, controllando la concentrazione extracellulare di sostanze neuroattive e rilasciando neurotrasmettitori, gli astrociti svolgono un ruolo importante nel determinare l'intensità dell'attività sinaptica. Il mio laboratorio indaga il ruolo delle interazioni neuro-gliali nella fisiopatologia cerebrale.

Abbiamo quindi ampiamente utilizzato e perfezionato questa tecnica per svelare il ruolo degli astrociti nella trasmissione sinaptica da momento a momento. In effetti, questa tecnica è potente perché consente di monitorare in tempo reale e simultaneamente le risposte elettrofisiologiche dinamiche dei neuroni. E oggi, mentre Osteocytes Evap clinic, Ash e Jeremy Siebel, membri del laboratorio, vi mostreranno come eseguire questa tecnica e vi spiegheranno come essa ci aiuti a comprendere, passo dopo passo, il dialogo intimo tra neuroni e astrociti.

Ho studiato l'impatto delle reti astrogliali sui neuroni, sulla trasmissione sinaptica e sulla plasticità effettuando registrazioni doppie dell'attività neuronale e dell'occorrenza del trasporto di potassio e glutammato da parte degli astrociti, e ho scoperto che la rete astrogliale facilita la rimozione extracellulare di potassio e glutammato durante l'attività neurale. Ho indagato le proprietà intrinseche e la plasticità dell'occorrenza astrogliale in relazione alla neurofisiologia. Durante la registrazione dell'attività evocata da astrociti e neuroni, sono riuscito a identificare che la risposta degli astrociti all'attivazione neuronale avviene principalmente tramite correnti di potassio.

Questa corrente possiede una propria plasticità elettrofisiologica, che non regola l'accettabilità neuronale e la plasticità. In altre parole, il conteggio alla rovescia degli astrociti, quello molto eccitato. Neuros. Presenteremo qui un metodo importante per indagare simultaneamente l'attività urinale e astrogliale in fette ippocampali acute effettuando registrazioni doppie delle correnti di membrana astrocitiche e dei potenziali di risposta urinali evocati dalla stimolazione delle fibre presinaptiche.

Inoltre, effettueremo registrazioni accoppiate di singoli neuroni e astrociti adiacenti per studiare le risposte gliciniche ASTO durante l'attività neuronale. Abbiamo scelto l'ippocampo perché questa regione presenta una marcata compartimentazione anatomica e funzionale ed è ben caratterizzata in termini di circuiti neuronali, nonché di attività e plasticità sinaptica. Iniziare gli esperimenti preparando fette cerebrali dell'ippocampo; per questa prima fase, preparare del ghiaccio chiamato ossigenato.

Fluido cerebrospinale artificiale, anestetizzare profondamente i topi e rimuovere rapidamente la testa, trasferendola nel fluido CSF. Aprire il cranio con tre incisioni, separando ora i due emisferi. Infine, trasferirli nel fluido CSF ossigenato.

Lasciarlo intrecciare uniformemente per circa cinque minuti. Ora iniziare con un emisfero. La dissezione dell'ippocampo inizia rimuovendo il mesencefalo.

La dissezione dettagliata dell'ippocampo è ora illustrata in questa figura. Posizionare innanzitutto l'emisfero separato sulla sua superficie corticale per accedere al mesencefalo. Con l'aiuto di due spatole, rimuovere il mesencefalo.

Ora l'ippocampo sarà visibile come indicato dalle linee tratteggiate. Dissezionare l'ippocampo con un cucchiaio a partire dal fia, che appare come una struttura larga. Inserire un cucchiaio al di sotto dell'ippocampo e, con l'aiuto di un secondo cucchiaio, staccare la corteccia adiacente all'ippocampo.

Trasferire l'ippocampo in una piccola piastra per colture con liquido CSF ossigenato e procedere con l'emisfero secondario. Posizionare entrambi gli ippocampi su un piccolo blocco di AGA con il lato alveolare rivolto verso l'alto. Ora aspirare il liquido CSF. Incollare l'ippocampo sul dispositivo della camera di sezionamento.

Trasferire l’ippocampo nella camera di sezionamento e tagliare sezioni di 300 o 400 micrometri. Raccogliere le sezioni in una camera di conservazione ossigenata e lasciarle riposare almeno un’ora prima della registrazione, a temperatura ambiente, per effettuare registrazioni globali di singoli astrociti. Trasferire la sezione di ippocampo su un coverslip rivestito con polilisina.

Asciugare l'eccesso di ACSF per consentire l'adesione della fetta di ippocampo alla copertura rivestita di poli e quindi aggiungere nuovamente ACSF sopra la fetta. Trasferire la fetta nella camera di registrazione, che viene costantemente perfusa con ACSF ossigenato a una velocità di perfusione di uno-due millilitri al minuto. Per identificare gli astrociti, si possono utilizzare topi che esprimono EGFP sotto il promotore specifico per astroglii GFAP per le registrazioni in patch-clamp.

Riempire una pipetta di vetro con una resistenza di quattro-sei megaohm con soluzione intracellulare fredda filtrata utilizzando una soluzione intracellulare contenente rodda dron; in questo modo è possibile visualizzare in rosso l'astrocita patchata in verde. Si osservano gli astrociti adiacenti che esprimono EGFP. Sotto il promotore GFAP, gli astrociti possono essere identificati per le loro piccole dimensioni del soma, di circa 10 micrometri, e per il ramificarsi del loro processo principale, che comprende di solito da tre a quattro rami.

Una siringa collegata tramite un tubicino alla pipetta consente l'applicazione di una pressione positiva durante la discesa nel tessuto. Nella finestra di comando, attivare un impulso di prova di 10 millivolt e regolare la corrente di mantenimento. Quindi, con l'aiuto del micromanipolatore, spostare la pipetta all'interno del tessuto avvicinandosi alla cellula. Quando si raggiunge la superficie cellulare, procedere ulteriormente finché non si osserva un'ammaccatura, visibile come una deviazione della luce, che indica una leggera deformazione della superficie cellulare.

A causa dell'applicazione di pressione positiva, la membrana cellulare degli astrociti si sigillerà strettamente sull'apertura della punta della pipetta di vetro, fenomeno osservabile attraverso un aumento della resistenza quando viene raggiunto un sigillo giga. Eseguire la compensazione della capacità passando alla configurazione wholesale mediante l'applicazione delicata di pressione negativa, osservando nel contempo le parti di prova nella finestra di comando. L'ingresso all'interno della cellula sarà visibile attraverso il flusso di corrente attraverso la membrana.

L'applicazione di una serie di passi di voltaggio iperpolarizzanti e depolarizzanti permette la caratterizzazione delle proprietà della membrana cellulare che gli astrociti normalmente mostrano. Questi ultimi mostrano soltanto risposte di corrente passive. L'iniezione di corrente in modalità clamp di corrente non genera potenziali d'azione, ulteriore conferma del fatto che si è effettivamente ottenuta la registrazione da un astrocita. L'aggiunta di un tracciante come lo zolfo o la domina B alla pipetta per il patch consente la visualizzazione dell'astrocita registrato.

Inoltre, la diffusione passiva del tracciante durante 20 minuti in modalità clamp di corrente permette di visualizzare gli astrociti adiacenti connessi tramite giunzioni comunicanti per effettuare registrazioni doppie della trasmissione eccitatoria neuronale e delle correnti astrocitiche successivamente elicitate. Prima blocchiamo la trasmissione inibitoria con precor toin per prevenire l'iperexcitabilità, che si verifica in assenza di trasmissione GABAergica. Recidiamo le connessioni mediate dai collaterali assiali tra CS tre e C uno con un piccolo bisturi ad iride.

Posizioniamo quindi un elettrodo di stimolazione del campo CSF, un elettrodo di registrazione del campo e l'elettrodo per il patch clamp astrocitario. Nella sezione di ippocampo, scegliamo un astrocita e posizioniamo l'elettrodo di campo a 5, 200 micrometri di distanza da esso per assicurarci che effettivamente l'astrocita integri l'attività registrata; la stimolazione dei collaterali di Shafer con l'elettrodo di campo evoca un potenziale elettrico eccitatorio. Questo potenziale elettrico è costituito dalla parete della fibra, che riflette il numero di assoni stimolati, e dalla successiva depolarizzazione postsinaptica, al fine di effettuare registrazioni doppie dei potenziali neuronali in ingresso e delle risposte della corrente totale della cellula astrogliale.

Posizionare innanzitutto l'elettrodo di registrazione extracellulare a circa 50 micrometri di distanza dall'astrocita scelto. Successivamente, spostare l'elettrodo per il patch-clamp sul soma astrocitario ed eseguire il patch-clamp; la cellula scelta viene verificata in base alle sue proprietà passive della membrana, che confermano che si tratta effettivamente di un astrocita. Stimolando ora i Shaer Cs, è possibile registrare simultaneamente l'attività neuronale e una corrente astrocitaria successiva, caratterizzata da una risposta prolungata fino a 50 picocoulomb, dovuta alla connettività della rete e al fatto che un singolo astrocita entra in contatto con le sinapsi di fino a 100 neuroni.

Queste cellule integrano l'attività di un elevato numero di sinapsi contemporaneamente attivate per eseguire registrazioni duali in configurazione whole cell di singoli neuroni e di astrociti adiacenti, abbassando due elettrodi a patch nella stratum area della sezione di ippocampo. Identificare nella regione C un neurone di interesse e, alla stessa profondità, a circa 20-60 micrometri di distanza, un astrocita; quindi posizionare entrambe le pipette a circa 10 micrometri sopra ciascuna cellula applicando una pressione positiva. La pipetta di registrazione astrocitaria deve essere posizionata il più vicino possibile all'astrocita bersaglio per evitare ulteriori movimenti meccanici.

Prima di tutto, ottenere il sigillo gga sul neurone. Procedere quindi con il patching dell'astrocita, che di solito si sigilla più lentamente rispetto ai neuroni. Per riassumere i passaggi importanti da eseguire per le registrazioni duali in modalità whole-cell, abbassare innanzitutto i due pipetti di registrazione all'interno della sezione.

Avvicinarsi al soma dell'astrocita, quindi eseguire il sigillo gga sul neurone e completare eseguendo il sigillo gga sull'astrocita. I neuroni presentano solitamente una resistenza della membrana molto più elevata rispetto agli astrociti, che per i neuroni piramidali è compresa tra 200 e 500 megaohm. Con entrambe le cellule ora in modalità voltage clamp T e in iperpolarizzazione, la membrana attiva correnti transitorie di sodio nel neurone e risposte passive di potassio nell'astrocita. Mostriamo qui che l'induzione di potenziali postsinaptici eccitatori rapidi mediante stimolazione dei collaterali shaa evoca una successiva risposta corrente di lunga durata.

Nell'astrocita adiacente, l'inibizione dei recettori ionotropici del glutammato con acido remico rivela che la maggior parte della corrente astroglicina è dovuta all'attivazione postsinaptica eccitatoria. La risposta residua di B AIC è costituita dal rapido transitorio di trasporto del glutammato sensibile al TBOA e da una piccola corrente persistente, probabilmente dovuta al rilascio presinaptico di potassio durante il potenziale d'azione. La corrente ascitica monitora in modo molto affidabile l'attività postsinaptica poiché entrambe aumentano linearmente all'aumentare dell'attività presinaptica.

Inoltre, le correnti astrocitiche mostrano, come le risposte neuronali, una facilitazione a coppia di impulsi. Una stimolazione singola moderata delle collaterali condivise induce una corrente astrocitaria evocata sinapticamente relativamente grande rispetto alla piccola depolarizzazione evocata registrata nella stessa cellula in modalità clamp di corrente. Ciò è dovuto alla bassa resistenza della membrana degli astrociti.

La registrazione della dinamica del potenziale di membrana TTO glicolipidico evocata sinapticamente costituisce una misura diretta dei livelli locali di potassio extracellulare; effettuando registrazioni accoppiate di un neurone e di un astrocita adiacente, non abbiamo osservato risposte di corrente negli astrociti mentre il neurone generava potenziali d'azione, indicando che non erano accoppiati elettricamente. I potenziali postsinaptici eccitatori evocati nella regione CS tre inducono anche risposte di corrente negli astrociti. Inoltre, una stimolazione singola potenziava fortemente la risposta neuronale nella regione CS tre, mentre aumentava solo moderatamente la corrente astrocitaria.

Dopo aver visionato questo video, dovremmo avere una migliore comprensione di come impostare ed eseguire registrazioni elettrofisiologiche duali di neuroni e citi. Utilizzando questa tecnica, è possibile studiare in tempo reale la segnalazione dinamica tra neuroni e astrociti per la risposta elettrofisiologica di interesse. In particolare, si può indagare se nuove interazioni GL che coinvolgono funzioni e modulazioni dei canali del ferro contribuiscano a definire condizioni fisiologiche o patologiche.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.