Name: Peptide: MHC Tetramero basata Arricchimento di epitopi specifici per cellule T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Scopri come isolare rarissime cellule T specifiche per epitopo usando tetrameri peptide:MHC e microsfere magnetiche. Questo metodo consente lo studio di popolazioni polyclonali endogene in immunologia.

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Gli autori desiderano ringraziare Andre Han e Yen Lawrence per l&#39;assistenza tecnica, ed i membri del laboratorio Jenkins aiuto per lo sviluppo di questo protocollo.

1. Isolamento delle cellule da tessuto linfoide <ol><li> Aggiungere 1 ml di ghiaccio freddo cEHAA (EHAA + 10% FBS, pen / strep, gentamicina, 2 mM L-glutammina, 55 mM 2-mercaptoetanolo) o altro equivalente mezzo di cellule T, un piatto di coltura di 60 millimetri contenente un piccolo quadrato di nylon 100 micron maglia e posto sul ghiaccio. </li><li> Eutanasia mouse. </li><li> Rimuovere la milza e come molti nodi linfatici facilmente accessibili possibile. Queste dovrebbero includere almeno le inguinali, ascellari, brachiale, linfonodi cervicali, e mesenterici. Metterli sulla parte superiore della maglia di nylon in piatto di coltura. </li><li> Utilizzando la cima piatta di una provetta da microcentrifuga 1,5 chiuso ml, schiacciare delicatamente il tessuto linfoide sulla maglia di nylon per liberare linfociti. Aggiungere un altro 1 ml di cEHAA e pipettare su e giù per lavorare le cellule in una sospensione. Trasferire le cellule attraverso un altro pezzo di maglia di nylon posizionato sopra di un tubo da centrifuga 15 ml polipropilene. Sciacquare il piatto e la rete con un altro 1 ml di ghiaccio freddo cEHAA, pooling i volumi nel tubo stesso. Ripetere per ottenere un volume finale di sospensione di cellule di 4 ml. </li><li> Aggiungere tampone freddo sorter (PBS + 2% FBS, azide 0,05%) ad un volume finale di 15 ml e centrifugare la provetta per 5 minuti a 300 xg, a 4 ° C. </li><li> Aspirare accuratamente il supernatante, assicurandosi senza goccioline di liquido vengono lasciati sui lati del tubo. Risospendere il pellet cellulare in Fc block (sorter tampone + 2.4G2 anticorpo) ad un volume finale pari a circa due volte quella della stessa pellet. Ad esempio, i milza e linfonodi di un mouse ingenua solitamente produce un pellet di cellule di circa 100 pl. In questo caso, aggiungere 100 microlitri di blocco Fc per portare il volume a 200 pl. Se un elevato grado di aggregazione delle cellule si è verificato, rimuovere con attenzione il gruppo della cella a questo punto con una punta della pipetta. </li></ol> 2. Tetramero colorazione <ol><li> Aggiungere o PE-APC-etichettati pMHC tetramero ad una concentrazione finale di 10 nM (o concentrazione empiricamente ottimizzata). </li><li> Mix e incubazionete per 1 ora a temperatura ambiente (o tempo empiricamente ottimizzata e temperatura). </li><li> Aggiungere tampone freddo sorter ad un volume di 15 ml e centrifugare la provetta per 5 minuti a 300 xg, a 4 ° C. I campioni in ghiaccio oa 4 ° C da ora. </li><li> Aspirare accuratamente il supernatante, assicurandosi senza goccioline di liquido vengono lasciati sui lati del tubo. Risospendere il pellet di cellule in tampone sorter ad un volume finale di 200 microlitri. Per l&#39;arricchimento tetramero doppia, risospendere ad un volume finale di 150 microlitri. </li></ol> 3. Arricchimento magnetica <ol><li> Aggiungere 50 ml di microsfere Miltenyi anti-PE o anti-APC. Per arricchimento tetramero matrimoniale, aggiungere 50 microlitri di entrambi. </li><li> Mescolare e incubare per 20 min a 4 ° C. </li><li> Aggiungere tampone freddo sorter ad un volume di 15 ml e centrifugare la provetta per 5 minuti a 300 xg, a 4 ° C. </li><li> In attesa, impostare una colonna Miltenyi LS magnetico su un magnete MidiMACS o QuadroMACS. Posizionare un tubo di polipropilene aperta 15 ml centrifuga su unaaccumulare direttamente sotto la colonna. </li><li> Aggiungere 3 ml di tampone sorter alla sommità della colonna, permettendo di scarico nel tubo 15 ml. </li><li> Inserire un quadrato di nylon 100 micron maglie sulla sommità della colonna. </li><li> Quando le cellule hanno finito la filatura, aspirare accuratamente il supernatante e risospendere il pellet in 3 ml di tampone sorter. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare attraverso la rete di nylon sulla parte superiore della colonna. </li><li> Quando la sospensione cellulare viene scaricata completamente nella colonna, lavare il tubo originale con altro 3 ml di tampone sorter e trasferire il buffer attraverso la rete di nylon nella colonna, risciacquo la maglia del processo. Gettare la rete di nylon. </li><li> Quando il buffer è svuotato completamente nella colonna, aggiungere un altro 3 ml di tampone sorter alla colonna. </li><li> Ripetere il passaggio 10 per un totale di 3 x 3 ml lavaggi. </li><li> Rimuovere la colonna dal magnete e sistemarla su un nuovo tubo da centrifuga 15 ml in polipropilene. </li><li> Aggiungere 5 ml di tampone sorter di tegli colonna. </li><li> Inserire immediatamente lo stantuffo nella parte superiore della colonna e un movimento continuo, spingere lo stantuffo fino in fondo, costringendo il buffer la colonna nel tubo. </li><li> Centrifugare le provette contenenti la frazione eluita associato e l&#39;deflusso frazione non legata per 5 min a 300 xg, a 4 ° C. </li><li> Aspirare accuratamente il supernatante dalla frazione legata, assicurandosi senza goccioline di liquido vengono lasciati sui lati del tubo. Risospendere il pellet di cellule in tampone sorter ad un volume finale di 95 microlitri esattamente. Aspirare e risospendere la frazione non legata ad un volume finale di 2 ml. </li></ol> 4. Citometria a Flusso <ol><li> Per ciascuna frazione, rimuovere 5 microlitri ed aggiungere 200 ml di perline di conteggio (regolato ad una concentrazione di 200.000 / ml in tampone sorter) in una provetta 5 ml FACS. Mettere da parte a 4 ° C per una successiva analisi. Per risparmiare tempo, perline possono essere pre-aliquotati per provette etichettate prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento. </li><li> Preparare amaster mix di anticorpi per colorare marcatori di superficie sulle cellule (Tabella 1). Per risparmiare tempo, questo può essere fatto prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento. </li><li> Per la frazione legata, aggiungere una dose di cocktail di anticorpi direttamente al 90 ~ microlitri di cellule nel tubo. Se l&#39;analisi della frazione non legata è desiderato, trasferire 90 microlitri di cellule in una provetta da 5 ml FACS e aggiungere una dose di cocktail di anticorpi. </li><li> Impostare un gruppo di monocolore controlli di compensazione per il citofluorimetro. Per ciascun fluorocromo da utilizzare, miscelare 50 microlitri di cellule non legate frazione rimanenti in un tubo 5 ml FACS con 1 pl di anticorpo anti-CD4 coniugato al fluorocromo corrispondente. Ricordate di impostare un controllo senza macchia pure. </li><li> Vortex e incubare tutti i campioni per 30 min a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 5 ml di tampone sorter a ciascuna provetta e centrifugare per 5 min a 300 xg, a 4 ° C. </li><li> Per la frazione legata, aspirare accuratamente il surnatante e risospendere le cellule in 200 ml di buf sorterfer. Trasferire le cellule in una provetta 1,2 ml FACS. Sciacquare il tubo con un altro 200 microlitri di tampone sorter e la piscina nella stessa provetta. Se ciuffi cellulari sono evidenti, passare le cellule attraverso un filtro 50 micron. </li><li> Per la frazione libera e controlli di compensazione, decantare o aspirare il surnatante e risospendere in 2 ml di tampone sorter. </li><li> Impostare il citofluorimetro utilizzando il solo colore controlli di compensazione. Selezionare side scatter-larghezza (SSC-W) come parametro aggiuntivo da registrare. </li><li> Analizzare i campioni colorarle con una sequenza di porte inclusione successive per identificare CD4 + o CD8 + cellule T, come illustrato nelle figure 1 e 2. Per le frazioni legate, raccogliere le cellule il più possibile fino ad un massimo di 2.000.000 di eventi totali. Per le frazioni non legate, raccogliere 1.000.000 eventi totali. Mantenere la velocità di acquisizione pari o inferiore a 3.000 eventi al secondo. </li><li> Utilizzando le impostazioni della macchina stessa, analizzare i campioni di conteggio tallone. Raccogliere 10.000 eventi totali. &lt;/ Li&gt; <li> Salvare tutti i dati come file FCS. </li></ol> 5. Analisi dei dati <ol><li> Analizzare FCS file di dati per i campioni di conteggio tallone utilizzando il software FlowJo. Diagramma a dispersione in avanti da FITC e impostare una porta era infatti proprio dietro le perle di conteggio (vedi figure 1 e 2). Determinare il numero totale di conteggio perline rilevate in ciascun campione. Sottrarre dal numero totale di eventi raccolti per determinare il numero di eventi cellulari raccolti. </li><li> Calcolare il numero totale di tutte le celle in ogni campione utilizzando le equazioni descritte nel riquadro 1. </li><li> Analizzare FCS file di dati per i campioni colorati frazione legati e non legati. Impostare una sequenza di porte inclusione successive per identificare + linfoide, side-scatter-larghezza lo, dump-, CD3 +, CD4 + o CD8 +, tetramero + cellule T in ogni campione come illustrato nelle figure 1 e 2. </li><li> Moltiplicare il numero totale di cellule nel campione dalle frequenze di ciascuna delle porte di inclusione utilizzati per definire CD4 + tetramero+ O CD8 + cellule tetramero + per calcolare il numero totale di epitopo-specifiche cellule T (Box 1). </li></ol>

<ol><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
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<li>Burchill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li>
<li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il pMHC tetramero metodo basato arricchimento delle cellule presentata da questo protocollo è un potente strumento per lo studio delle cellule T epitopo-specifici di cellule T endogene repertori. L&#39;utilizzo di tetrameri pMHC consente il rilevamento di epitopo-specifiche cellule T basati direttamente sulla capacità dei loro TCR per legare ligandi affini pMHC. L&#39;arricchimento fornisce un livello di sensibilità in modo tale che le popolazioni estremamente rari di antigene-specifiche cellule T può essere rilevata da...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagente</strong</td&gt;<td<strong&gt; Fornitore</strong</td&gt;<td<strong&gt; Numero di catalogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE o APC coniugato pMHC tetramero (o multimero)</td&gt;<td&gt; Realizzato da investigatore, ottenuto dal nucleo NIH tetramero, o acquistati da fonti commerciali</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-PE microsfere coniugate magnetici</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-APC microsfere coniugate magnetici</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Colonne LS magnetici</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS o QuadroMACS magnete</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 o 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cell conteggio perline</td&gt;<td&gt; Life Technologies</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

peptide: mhc tetramero basata arricchimento di epitopi specifici per cellule t

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Una necessità di base per i ricercatori che studiano immunità adattativa con modelli sperimentali in vivo è la capacità di identificare cellule T in base al loro recettore antigene sulla cellula T (TCR) specificità. Molti metodi indiretti sono disponibili in cui una popolazione di cellule T bulk è stimolata in vitro con un antigene specifico epitopo-specifici e le cellule T sono identificati mediante la misurazione di una risposta funzionale come proliferazione, produzione di citochine, o l&#39;espressione di marcatori di attivazione 1. Tuttavia, questi metodi solo identificare epitopi specifici per cellule T presentano una delle tante possibili funzioni, e non sono sufficientemente sensibili per rilevare le cellule T epitopo-specifici a frequenze precursori naive. Un&#39;alternativa popolare è il modello transgenico trasferimento TCR adottiva, in cui le cellule T monoclonali da un topo transgenico TCR sono seminati in istocompatibili host per creare una vasta popolazione precursore di epitopo-specifiche cellule T che possono essere facilly cingolato con l&#39;uso di un anticorpo marcatore congenic 2,3. Mentre potente, questo metodo soffre di artefatti sperimentali associate alla frequenza fisiologica di cellule T con specificità per un singolo epitopo 4,5. Inoltre, questo sistema non può essere usato per studiare l&#39;eterogeneità funzionale di epitopo-specifici cloni di cellule T all&#39;interno di una popolazione policlonale. Il modo ideale per studiare l&#39;immunità adattativa dovrebbe coinvolgere il rilevamento diretto di cellule T epitopo-specifici del repertorio endogeno delle cellule T utilizzando un metodo che distingue la specificità TCR esclusivamente dal suo legame con l&#39;affine peptide: MHC (pMHC) complessi. L&#39;utilizzo di tetrameri pMHC e citometria di flusso realizza questo 6, ma è limitata alla rilevazione di popolazioni ad alta frequenza di epitopo-specifiche cellule T solo trovati seguente indotta da antigene espansione clonale. In questo protocollo, si descrive un metodo che coordina l&#39;uso di tetrameri pMHC e magnetecnologia delle celle tic arricchimento abilitare il rilevamento di frequenza estremamente bassa epitopo-specifiche cellule T di topo tessuti linfoidi 3,7. Con questa tecnica, si può globalmente intera traccia epitopo-specifiche popolazioni di cellule T endogene in topi in tutte le fasi della risposta immunitaria.

La figura 1 illustra rappresentante trame citometria a flusso di milza pMHCII tetramero arricchito e campioni di linfonodi di topi naive, mentre la figura 2 mostra i dati rappresentativi per topi precedentemente immunizzati con il peptide corrispondente + CFA. Gating seriale rimuove eventi indesiderati autofluorescenti e altre dall&#39;analisi di CD4 + popolazioni di cellule T. Il CD8 + popolazione di cellule T serve come controllo interno negativo utile per la colorazione pMHCII tetram...

Questo protocollo descrive l&#39;uso del peptide: MHC tetrameri e microsfere magnetiche per isolare popolazioni bassa frequenza di epitopo-specifiche cellule T e analizzarli mediante citometria a flusso. Questo metodo consente lo studio diretto delle popolazioni di cellule T endogene di interesse da<em&gt; In vivo</em&gt; Sistemi sperimentali.

Peptide: MHC Tetramero basata Arricchimento di epitopi specifici per cellule T

Una necessità fondamentale per i ricercatori che studiano l'immunità adattativa attraverso modelli sperimentali in vivo è la capacità di identificare le cellule T in base al loro recettore per le cellule T...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare cellule T specifiche per epitopi rari nel repertorio endogeno di cellule T di topi. Questo risultato si ottiene innanzitutto marcando con reagenti tetramerici peptidi-MHC le cellule linfoidi isolate, che etichettano fluorescentemente le cellule T specifiche per l'epitopo in questione. Successivamente, queste cellule marcate con il tetramero vengono incubate con microsferette magnetiche coniugate ad anticorpi specifici per il marcatore fluorescente presente sul tetramero.Successivamente, le cellule marcate magneticamente vengono fatte passare attraverso una colonna magnetizzata al fine di arricchire il campione con cellule T specifiche per l'epitopo legato al tetramero. Infine, le cellule vengono marcate con i marcatori cellulari desiderati per l'esperimento e viene eseguita una citometria a flusso multiparametrica per rilevare e quantificare le rare popolazioni di cellule T specifiche per l'epitopo arricchite con il tetramero. Il principale vantaggio dell'utilizzo di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come il sistema di trasferimento adottivo di cellule T transgeniche per il TCR, è che gli studi vengono condotti su popolazioni reali policlonali di cellule T specifiche per l'epitopo che si sviluppano naturalmente all'interno del sistema immunitario.Inoltre, l'elevata sensibilità di rilevamento offerta da questa tecnica consente studi su queste popolazioni anche quando sono presenti a frequenze estremamente basse. Questo metodo può aiutare a rispondere a numerose domande fondamentali nel campo dell'immunologia, ad esempio quante cellule T naive possano riconoscere un particolare antigene proveniente da un microrganismo patogeno, e come la composizione clonale di una popolazione di cellule T specifiche per un epitopo cambi nel corso di una risposta immunitaria. Prima di iniziare la dissezione, aggiungere un millilitro di mezzo EHAA completo in una piastra da coltura da 60 millimetri contenente un piccolo quadrato di rete in nylon da 100 micron e posizionare la piastra sul ghiaccio.Quindi rimuovere la milza da un topo eutanasizzato e il maggior numero possibile di linfonodi facilmente accessibili. Posizionare i tessuti sulla maglia di nylon nella piastra di coltura. Utilizzare la parte superiore piatta di una microprovetta da 1,5 millimetri chiusa per schiacciare delicatamente i tessuti linfoidi sulla maglia di nylon.Per liberare i linfociti, aggiungere un altro millilitro di mezzo nel piatto e quindi pipettare la soluzione su e giù per favorire la sospensione delle cellule. A questo punto, posizionare una nuova maglia di nylon sopra un tubo da centrifuga in polipropilene da 15 millilitri, quindi trasferire le cellule attraverso la nuova maglia. Risciacquare il piatto e la maglia con un altro millilitro di mezzo freddo ed eluirla attraverso il nuovo pezzo di maglia nel tubo da 15 millilitri.Ripetere il risciacquo un'altra volta. Dopo aver aggiunto il buffer freddo per l'ordinatore fino a un volume finale di 15 millilitri, centrifugare il tubo per cinque minuti a 300 ×g e a quattro gradi Celsius. Quindi aspirare con attenzione il surnatante e risospendere.Sospendere il pellet cellulare nel blocco FC fino a un volume finale pari a circa il doppio di quello del pellet stesso. Se si è verificato un notevole grado di aggregazione cellulare, rimuovere con attenzione l'aggregato cellulare mediante una pipetta per la colorazione delle cellule T specifiche per l'antigene.Aggiungere il tetramero peptidico MHC marcato con fluorocromo al pellet cellulare risospeso alla concentrazione ottimizzata. Quindi mescolare la sospensione cellulare e incubare al tempo e alla temperatura ottimizzati per il legame del tetramero. Successivamente, aggiungere tampone freddo per il sorting fino a raggiungere un volume di 15 millilitri e centrifugare mantenendo le cellule a quattro gradi Celsius.Da questo momento aspirare con attenzione il soprannatante. Quindi risospendere il pellet cellulare nel buffer per ordinatore fino a un volume finale di 200 microlitri. Aggiungere ora 50 microlitri di microperle coniugate con l'anticorpo mil tenny che si legheranno specificamente al marcatore fluorescente della miscela di tetrameri, quindi incubare le cellule legate al tetramero e le microperle a quattro gradi Celsius.Dopo 20 minuti, lavare le cellule nel buffer per ordinatore mentre le cellule sono nella centrifuga. Posizionare una colonna magnetica Milani LS su un magnete Quadro Max e posizionare un nuovo tubo centrifugo in polipropilene da 15 millilitri direttamente al di sotto della colonna. Aggiungere tre millilitri di buffer per ordinatore nella parte superiore della colonna, lasciandolo defluire nel tubo da 15 millilitri.Quindi posizionare un quadrato di setaccio in nylon da 100 micron sulla sommità della colonna. Una volta terminata la centrifugazione delle cellule, aspirare con attenzione il sopranatante e risospendere il pellet in tre millilitri di buffer per ordinatore, quindi trasferire la sospensione cellulare attraverso il setaccio in nylon sulla sommità della colonna. Quando la sospensione cellulare è completamente drenata nella colonna, risciacquare il tubo originale con altri tre millilitri di buffer per ordinatore e trasferirla attraverso il setaccio sulla colonna.Unendo il lavaggio nel tubo di raccolta, scartare la maglia di nylon. Una volta che il tampone è completamente defluito nel tubo, lavare la colonna altre due volte con tre millilitri di tampone per ordinatore ad ogni lavaggio. Successivamente, rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla sopra un nuovo tubo da centrifuga in polipropilene da 15 millilitri.Ora aggiungere altri cinque millilitri di buffer per ordinatore sulla colonna. Inserire immediatamente lo stantuffo nella parte superiore della colonna e, con un unico movimento continuo, spingere lo stantuffo completamente verso il basso, spingendo il buffer fuori dalla colonna e nel tubo. Dopo aver centrifugato sia il tubo contenente la frazione legata eluita sia il tubo contenente la frazione non legata passata in flusso, aspirare con attenzione il soprannatante dalla frazione legata e risospendere il pellet cellulare in buffer per ordinatore fino a un volume finale esattamente di 95 microlitri; aspirare e risospendere la frazione non legata fino a un volume finale di due millilitri. Prima di proseguire con la colorazione delle frazioni cellulari, aggiungere 200 microlitri di perline per conteggio in un tubo fax da cinque millilitri e trasferire cinque microlitri di cellule in questo tubo.Mettere da parte queste provette a quattro gradi Celsius per l'analisi. Successivamente, preparare un mix master di anticorpi per colorare i marcatori di superficie delle cellule secondo la tabella. Per la frazione legata, aggiungere direttamente alle cellule un'opportuna quantità di cocktail di anticorpi; per la frazione non legata, procedere analogamente.Trasferire 90 microlitri di cellule in un tubo FACS da cinque millilitri e aggiungere al campione trasferito una dose di cocktail di anticorpi per ogni fluorocromo da utilizzare. Mescolare 50 microlitri della frazione residua di cellule non legate in un tubo FACS da cinque millilitri con un microlitro di anticorpo anti-CD4 coniugato al fluorocromo appropriato. Preparare anche un controllo non colorato; dopo aver eseguito la vortexazione, incubare tutti i campioni a quattro gradi Celsius per 30 minuti.Quindi, dopo aver lavato ogni provetta con cinque millilitri di buffer per ordinatore, aspirare con attenzione il soprannatante dai campioni della frazione legata e risospendere le cellule in 200 microlitri di buffer per ordinatore. Trasferire le cellule in provette microcentrifughe da 1,2 millilitro, quindi risciacquare le provette precedentemente utilizzate con altri 200 microlitri di buffer per ordinatore, raccogliendo i risciacqui nelle corrispondenti provette microcentrifughe. Se sono visibili grumi, far passare le cellule attraverso un filtro da 50 micron per la frazione non legata e i controlli di compensazione, decantare il soprannatante e risospendere i pellet in un millilitro di buffer per ordinatore.Analizzare i campioni colorati utilizzando una sequenza di gate di inclusione successivi per identificare le cellule T positive per CD4 o positive per CD8, come illustrato qui per i campioni della frazione legata. Raccogliere il maggior numero possibile di cellule, fino a un massimo di 2 milioni di eventi totali per i campioni della frazione non legata. Raccogliere 1 milione di eventi totali.Infine, utilizzando le stesse impostazioni della macchina, raccogliere 10.000 eventi dai campioni di microsfere di conteggio. Questa prima figura RAPPRESENTA grafici rappresentativi di citometria a flusso di campioni di milza e linfonodi arricchiti con tetramero peptidico MHC di classe due provenienti da topi naïve, relativi alle frazioni di cellule legate e non legate. È stata impostata una serie di porte per selezionare eventi positivi per lo scatter linfocitario e con basso scatter laterale negativi per il dump e positivi per CD3; tra questi, gli eventi positivi per CD4 o positivi per CD8 sono stati selezionati per l'analisi delle cellule T specifiche per l'epitopo o per la valutazione della colorazione di fondo.Aliquote di cellule non colorate provenienti dalle frazioni legate e non legate sono state mescolate con microsfere fluorescenti per il conteggio e analizzate separatamente. Questi grafici di densità mostrano dati rappresentativi di topi precedentemente immunizzati con il peptide specifico più adiuvante completo. È stata utilizzata la stessa strategia di selezione in serie dell'esperimento precedente per eliminare qualsiasi autofluorescenza e altri eventi indesiderati.Dall'analisi delle popolazioni di linfociti T CD4 positivi, la popolazione di linfociti T CD8 positivi ha funto da controllo negativo interno utile per la colorazione con tetramero peptidico MHC di classe II dei linfociti T CD4 positivi. Il numero assoluto di linfociti T specifici per l'epitopo in un campione viene calcolato moltiplicando il numero totale di tutte le cellule nella frazione legata del campione arricchito, determinato dall'analisi del conteggio delle microsferette, per la proporzione di queste cellule che risultano positive al tetramero, determinata dall'analisi della colorazione cellulare. Per i dati rappresentativi del topo naïve mostrati nella prima serie di grafici di densità, il conteggio totale delle cellule era di 4.411 e il conteggio delle microsferette era di 5.589. La concentrazione della sospensione madre di microsferette era di 2 × 10⁵ per millilitro.Il volume delle perle era di 0,2 millilitri e il volume delle cellule era di 0,005 millilitri. Pertanto, questi dati sono stati utilizzati per calcolare la concentrazione cellulare pari a 6,31 per 10 alla sesta per millilitro. La concentrazione cellulare è stata quindi moltiplicata per il volume totale del campione per ottenere il numero totale di cellule.Questi dati sono stati poi moltiplicati per la percentuale di eventi tetramero-positivi ottenuta dall'analisi cellulare, determinando che il numero di cellule T CD4 positive specifiche per l'epitopo in questo topo naïve era pari a 98. Per i dati rappresentativi del topo immunizzato nella seconda serie di grafici di densità, il numero totale di cellule T CD4 positive specifiche per l'epitopo è stato di 1,53 × 10⁴. L'efficienza dell'arricchimento diminuisce all'aumentare del numero di cellule T specifiche per l'epitopo.Pertanto, le cellule positive al tetramero possono essere osservate nella frazione non legata di campioni contenenti frequenze molto elevate di cellule T specifiche per l'epitopo. In tali casi, il numero di cellule T specifiche per l'epitopo presenti nella frazione non legata può essere calcolato separatamente e aggiunto al numero rilevato nella frazione legata. Ad esempio, nella frazione di cellule non legate di un topo rappresentativo immunizzato, il numero totale di cellule T CD4 positive specifiche per l'epitopo era di 8,97 × 10³.Pertanto, sommando i numeri delle frazioni legate e non legate, erano presenti 2,43 volte 10 alla quarta cellule T positive per il CD4 specifiche per l'epitopo nel campione totale del topo immunizzato. In effetti, se l'espansione delle cellule specifiche per l'epitopo è sufficientemente robusta, il processo di arricchimento può essere saltato. Dopo la procedura di arricchimento, possono essere eseguiti i passaggi di fissazione e permeabilizzazione per consentire la colorazione di proteine intracellulari come citochine e fattori di trascrizione.Sebbene questo metodo sia stato inizialmente progettato per lo studio di cellule T provenienti dalla milza e dai linfonodi, può essere applicato anche ad altri tessuti come il timo e l'intestino. La tecnica può inoltre essere utilizzata per studiare cellule T specifiche per epatiti in campioni di sangue e tessuti umani.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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