Trapping ottica di nanoparticelle

L'obiettivo generale di questa procedura è creare una configurazione di trappola ottica ad apertura per intrappolare particelle di circa 20 nanometri di dimensione. A tale scopo, viene aggiunto un rivelatore a una configurazione esistente di trappola laser ottica per consentire la misurazione. Successivamente, la soluzione di nanoparticelle da misurare viene dispensata in una camera microfluidica con la trappola a doppio foro nanometrico, e la camera viene caricata sulla configurazione di trappolamento ottico.

Quando una particella entra nell'apertura illuminata, la trasmissione della luce aumenta notevolmente a causa del carico dielettrico. Se la particella tenta di uscire dall'apertura, la riduzione della trasmissione provoca un cambiamento del momento diretto verso l'esterno rispetto al foro e, in base alla terza legge di Newton, si genera una forza che riattira la particella all'interno del foro, intrappolandola. La particella provoca uno spostamento verso il rosso della curva di trasmissione, che può essere monitorato.

Pertanto, la trappia può diventare un sensore. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano eventi di intrappolamento di nanoparticelle, inclusi il dispiegamento delle proteine intrappolate, indicati da variazioni nell'intensità del laser attraverso il doppio foro nanostrutturato. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'intrappolamento ottico basato sulla forza gradiente, è la capacità di intrappolare nanoparticelle più piccole utilizzando intensità laser inferiori.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nella biochimica, come ad esempio in che modo le singole proteine si ripiegano e interagiscono, e come le particelle virali infettano le cellule viventi? Generalmente, le persone che adottano questo metodo incontrano difficoltà perché è complesso integrare il doppio foro nana in un sistema di trappole laser esistente. La configurazione della trappola ottica si basa su un kit di pinzette ottiche di Thor Lab, dotato di un modulo per la misurazione della forza.

Un fotodiodo ad avalanche viene utilizzato per sostituire il rilevatore a quadranti nel modulo di misurazione della forza. Durante l'allestimento del sistema di trappola ottica, si deve indossare una protezione oculare ogni volta che il laser è acceso. Assicurarsi che il fascio sia contenuto all'interno di un'area sicura operando in una stanza chiusa e confinando il fascio all'interno dell'apparato di trappola il più possibile; si consiglia di evitare gioielli riflettenti.

Indossare guanti in lattice. Per garantire la pulizia dell'ottica, configurare il kit della pinza ottica e il modulo di misurazione della forza. Secondo le istruzioni del produttore, il kit della pinza ottica assemblato ha una configurazione a microscopio invertito e comprende i seguenti componenti: un laser trappola, un obiettivo ad immersione in olio da 100x, una piattaforma di posizionamento del campione a tre assi e una telecamera CCD.

Si noti che è consigliabile adottare protezioni contro le scariche elettrostatiche durante la manipolazione dei diodi laser. Il modulo di misurazione della forza consente la calibrazione delle pinze ottiche mediante il rilevamento posizionale del piano focale posteriore del condensatore. Un fotodiodo a valanga a base di silicone o un PD vengono utilizzati al posto dei moduli di misurazione della forza.

Il rilevatore di posizione a quadrante inserisce anche un filtro resistore-condensatore o filtro RC utilizzando una resistenza da 200 kilo ohm e un condensatore da 100 picofarad. Questo viene utilizzato per ridurre il rumore ad alta frequenza e facilitare la visualizzazione degli eventi di intrappolamento sull'oscilloscopio. Utilizzare un cavo coassiale per collegare il filtro RC dopo il PD a. Quindi utilizzare cavi coassiali e un adattatore a T per collegare l'oscilloscopio e il modulo di acquisizione dati al filtro RC.

Il sistema è ora pronto per il caricamento del campione. L'apertura con doppio foro nano è composta da due fori nano realizzati in un film d'oro mediante un fascio ionico focalizzato. Il film ha uno spessore di 100 nanometri ed è sostenuto da un substrato di vetro.

I nano fori si sovrappongono per produrre due punte acute. Le nanoparticelle verranno intrappolate nel gap tra queste punte dalla luce laser che incide sul doppio nano foro.

Devono essere inoltre fresati nel film metallico dei grandi elementi di allineamento per facilitare l'individuazione della posizione del doppio nano-foro al microscopio ottico. Questi elementi devono essere posizionati a circa 100 micron dal doppio nano-foro. Versare 10 grammi di poli dimetil silossano o base PDMS e un grammo di agente indurente in un bicchiere monouso; mescolare per alcuni minuti.

Quindi, evacuare la miscela in una camera a vuoto fino a quando tutte le bolle non saranno scomparse. Successivamente, versare 1,5 grammi di PDMS in una piastra di Petri di nove centimetri di diametro. Applicare il PDMS per centrifugazione sul fondo della piastra di Petri a 950 giri/minuto per 65 secondi seguendo la procedura di rivestimento rotante.

Lo spessore non è critico, purché sia inferiore a 80 micron. Posizionare delicatamente tre a cinque coprioggetti numero 1,5 sul PDMS in modo che non si sovrappongano ed evacuare per 30 minuti.

Se durante l'evacuazione i vetrini hanno scivolato e si sono sovrapposti, spostarli delicatamente l'uno dall'altro. Assicurarsi che il PDMS sotto i vetrini rimanga sottile e uniforme. Quindi sottoporre nuovamente la piastra di Petri a evacuazione per 30 minuti.

Rimuovere la piastra di Petri dalla camera a vuoto e riscaldarla su una piastra riscaldante per 20 minuti a 85 gradi Celsius per polimerizzare il PDMS. Una volta che il PDMS si è solidificato, utilizzare una lametta per tagliare lungo i bordi di uno dei vetrini. Quindi, usando pinzette a punta fine o una lametta, sollevare delicatamente il vetrino: uno strato sottile di PDMS aderirà al vetrino.

Posizionare il vetrino con il PDMS in una nuova piastra di Petri. Quindi, utilizzando una lametta, tagliare una finestra di tre millimetri per tre millimetri nel PDMS. Questa finestra formerà la camera in cui verrà mantenuta la soluzione di nanoparticelle.

Utilizzare un tagliacello a laser per realizzare un supporto in acrilico per vetrini microscopici con un foro centrale del diametro di tre quarti di pollice. Applicare del nastro adesivo doppia faccia lungo la circonferenza del foro. Utilizzare una lama di rasoio per rimuovere ogni eventuale eccesso di nastro.

Posizionare il vetrino fabbricato su una delle coprioggetti preparate rivestite con PDMS in modo che il PDMS sia incapsulato tra il vetro e l'acrilico. Utilizzando una pipetta microlitrica, aggiungere alcune gocce di soluzione di nanosfere di polistirene allo 0,05% in peso/volume alla finestra di PDMS.

Aggiungere una goccia sul film d'oro nella zona in cui si trovano i nano fori. Posizionare il campione d'oro sopra le coprioggetti, con i nano fori all'interno della finestra in PDMS. Assicurarsi che non siano presenti bolle nella camera.

Quindi premere il campione d'oro contro il vetrino. Rimuovere con delicatezza e tamponare qualsiasi soluzione in eccesso, poiché verrà utilizzato un obiettivo a immersione in olio. Aggiungere una goccia di olio sull'altro lato del vetrino, sopra la finestra in PDMS.

Prendere nota della posizione dei nano fori. Inserire il microscopio. Far scivolare il vetrino nel supporto con l'olio rivolto verso il basso, quindi abbassare il supporto fino a quando l'olio di immersione entra in contatto con il microscopio.

Obiettivo, allineare approssimativamente la fase del vetrino in modo che i segni di registrazione incisi nel film d'oro si trovino sotto l'obiettivo. Utilizzando un software di acquisizione delle immagini come Thor site, incluso nel kit di trapping, individuare i segni di registrazione sul film d'oro e seguire le linee indicatrici fino ai nano fori.

Posizionare il vetrino in modo che i segni indicatori e le altre aree aperte siano spostati dal centro dello schermo. Un'eccessiva trasmissione della luce può danneggiare il fotodiodo a valanga; attivare il laser. Poiché lo specchio dicromatico non è perfetto, dovrebbe apparire un punto vicino al centro dello schermo proveniente dal fascio laser.

Utilizzando il software di controllo del palco pizo. Affinare ulteriormente l'allineamento su tutti e tre gli assi. Quando l'allineamento è corretto, si osserverà il massimo di una tensione PD, indicando la trasmissione più elevata attraverso l'apertura nano.

Ora che il sistema è stato configurato e il campione è stato caricato, è possibile acquisire i dati del trappolamento ottico. Con l'aiuto dei segni indicatori, posizionare il punto vicino a una posizione nota di un nano foro. I doppi nano fori saranno troppo piccoli per essere risolti chiaramente e appariranno come piccoli punti sullo schermo.

La trasmissione della luce attraverso il campione è indicata dal livello del segnale sull'oscilloscopio. Allineare ulteriormente il campione in modo da massimizzare la trasmissione della luce. Prestare attenzione ai segni indicatori e alle graffiature visibili e non visibili, poiché la trasmissione della luce sarà elevata in queste aree; i nano fori mostreranno bruschi salti nella trasmissione della luce, a differenza dei graffi.

Utilizzare la piastra ondulata per ottenere cambiamenti più graduali. Regolare la polarizzazione della luce per raggiungere la massima trasmissione luminosa quando la struttura a doppio nano-foro è polarizzata. Per acquisire i dati, campionare la tensione degli APD mediante il modulo di acquisizione dati per il tempo desiderato.

Tempi di acquisizione sono tipicamente nell'ordine delle centinaia di secondi. In questo caso, si utilizza un software personalizzato per l'acquisizione dei dati e la tensione viene campionata 2000 volte al secondo. Utilizzando MATLAB, filtrare i dati acquisiti mediante un filtro KY Gole e tracciarli in funzione del tempo su un grafico per mostrare l'intrappolamento di nanoparticelle di polistirene di 20 nanometri; la trasmissione attraverso la doppia nanoapertura è stata misurata in funzione del tempo.

È stato quindi tracciato il grafico della trasmissione ottica utilizzando un PD. Nel tempo, l'evento di trappolamento è caratteristicamente improvviso, con un bordo netto che mostra un chiaro passaggio tra due livelli di potenza di trasmissione, come mostrato in questo esempio; nello stato di trappolamento si osserva frequentemente un aumento del rumore del segnale. Questo aumento del rumore è dovuto al moto browniano della particella intrappolata.

Si noti che, in assenza della particella intrappolata, questa fonte di rumore non è presente. Alcuni artefatti potrebbero comparire nei risultati senza indicare effettivi eventi di intrappolamento. I risultati che mostrano deriva, osservabile come lente variazioni della trasmissione nel corso di alcuni minuti come mostrato qui, devono essere scartati. Seguendo questa procedura, altri metodi come la spettroscopia Raman e la spettroscopia fluorescente possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande sulla natura della nanoparticella intrappolata dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per lo studio di nanoparticelle biologicamente rilevanti a livello di singola molecola. Ad esempio, per rilevare il legame proteico e studiare l'infezione virale entrambi a livello di singola molecola. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come integrare un doppio trappola ottica nho in un sistema laser a microscopio invertito T per intrappolare singole nanoparticelle.