Isolamento di fibroblasti normali e tumorali associata da tessuti freschi di fluorescenza activated cell sorting (FACS)

Lo scopo di questa procedura è isolare fibroblasti normali e associati al cancro da tessuti freschi. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando le ghiandole mammarie. Il secondo passaggio consiste nel preparare le ghiandole mammarie, sospensioni cellulari singole e successivamente selezionare le cellule con anticorpi specifici per i fibroblasti, nonché con anticorpi specifici per altre popolazioni cellulari.

L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire il sorting cellulare attivato da fluorescenza o FACS. Infine, il profilo di espressione mediante Q-R-T-P-C-R di marcatori specifici espressi nelle popolazioni cellulari ordinate viene utilizzato per valutare la purezza delle popolazioni cellulari ordinate. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per l'isolamento dei fibroblasti è che consente l'isolamento della maggior parte dei fibroblasti tissutali con minima contaminazione da cellule immunitarie o cellule epiteliali, evitando al contempo un passaggio di coltura tissutale che potrebbe alterare il profilo di espressione genica dei fibroblasti.

Le implicazioni di questa tecnica riguardano tutte le terapie per il cancro al seno, poiché la comprensione e l'identificazione di bersagli molecolari potrebbero fornire un approccio combinatorio innovativo per combattere la progressione del tumore al seno, prolungare la sopravvivenza dei pazienti e, in ultima analisi, contribuire a migliorare e personalizzare le opzioni terapeutiche individualizzate. Oltre al suo occhio, solo il dottor Lena, il responsabile del laboratorio, dimostrerà la procedura. Per iniziare questa procedura, posizionare il topo femmina eutanasizzato supino su una superficie di polistirolo e utilizzare aghi da 25 gauge per fissare saldamente tutti e quattro gli arti.

Spruzzare abbondantemente il topo con etanolo al 70% utilizzando pinze. Sollevare la pelle addominale lungo la linea mediana ed effettuare una piccola incisione con forbici affilate a partire dall'incisione. Tagliare la pelle fino al collo dell'animale evitando di perforare le cavità addominali e toraciche.

Tagliare la pelle sulle zampe posteriori partendo dall'incisione mediana verso la gamba, ottenendo una forma a Y. Successivamente, staccare la pelle dal corpo del topo e fissarla con spilli, esponendo le ghiandole mammarie attaccate alla superficie inferiore della pelle. Una delle cose più problematiche in questa procedura è evitare di asportare tessuto muscolare.

Per evitare questo problema, preleverò solo la quarta e la quinta ghiandola mammaria e non la seconda, che è in prossimità del tessuto muscolare. Utilizzare bastoncini di cotone per separare delicatamente la ghiandola mammaria dalla pelle, tagliando il tessuto connettivo con forbici piccole e affilate per staccare la ghiandola mammaria verso la spina dorsale del topo ed eliminare eventuali aree necrotiche riscontrate. Posizionare le ghiandole mammarie dissezionate in PBS su ghiaccio.

Il modo più semplice per ottenere tessuto cutaneo senza dover rimuovere i peli è utilizzare le orecchie del topo. Usare forbici affilate per tagliare entrambe le orecchie dal topo eutanasizzato. Porre immediatamente le orecchie in un barattolo per digestione contenente un piccolo volume di PBS su ghiaccio.

Per preparare una sospensione di singole cellule della ghiandola mammaria, utilizzare forbici curve per tritare accuratamente le ghiandole mammarie in un barattolo per digestione contenente un piccolo volume di PBS su ghiaccio; aggiungere 20 millilitri di soluzione di collagenasi al tessuto tritato. Questa quantità di soluzione di collagenasi dissocerà in modo efficiente circa cinque grammi di tessuto mammario o tumorale e orecchie provenienti da fino a 15 topi. Porre immediatamente su un agitatore in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e incubare per 15 minuti sotto agitazione a velocità media, quindi arrestare la reazione con 30 millilitri di DMEM freddo più 10% FCS.

Successivamente, filtrare la miscela di tessuto e mezzo attraverso un filtro cellulare da 70 micron posizionato sopra un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare il tubo conico per cinque minuti a 450 ×g a quattro gradi Celsius. Se i topi non sono stati perfusi al cuore con PBS prima dell'eutanasia, i globuli rossi nel campione dovranno essere lisati prima della colorazione immunitaria.

Le cellule devono essere bloccate per il FC endogeno prima dell'etichettatura dei fibroblasti e di altre popolazioni cellulari. Risospendere le cellule in uno-tre millilitri di buffer fax uno, quindi aggiungere il blocco FC in una diluizione 1:50 e incubare sul ghiaccio per 10-20 minuti. Non è necessario rimuovere il blocco FC; trasferire aliquote cellulari di 100 microlitri in provette eppendorf da utilizzare come controllo non colorato e controlli monocromatici.

A seconda del numero di anticorpi fluorescenti utilizzati in questa dimostrazione, verranno impiegati due anticorpi fluorescenti per etichettare i fibroblasti contro il recettore alfa per il PDGF. Questi sono direttamente coniugati a un fluorocromo e utilizzati in una diluizione di uno a 50 sul campione da ordinare, così come sui controlli monocromatici per etichettare altre popolazioni cellulari. Aggiungere gli anticorpi coniugati in modo fluorescente appropriati ai marcatori di superficie, anch'essi in una diluizione di uno a 50.

Aggiungere anticorpi anche a provette di controllo monocromatiche appropriate, inclusi anticorpi per cellule immunitarie e cellule epiteliali, per escludere eventuali popolazioni doppiamente positive e migliorare così la purezza dei fibroblasti isolati. Successivamente, incubare le cellule con gli anticorpi per un'ora sul ghiaccio al buio; dopo un'ora, lavare le cellule riempiendo le provette con buffer fax uno e centrifugando per cinque minuti a 450 ×g a quattro gradi Celsius, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in buffer fax uno a una concentrazione più adatta per l'ordinamento mediante il sorter fax da utilizzare. Trasferire le cellule marcate in provette fax con tappi filtranti e filtrare le cellule nelle provette per evitare aggregati o grumi, al fine di escludere le cellule morte.

Un DPI a tutti i campioni, ad eccezione del controllo non colorato. Mantenere i campioni sul ghiaccio durante l'analisi al fax. Per iniziare questa procedura, utilizzare il software del cell sorter per impostare le condizioni di fluorescenza, le condizioni di acquisizione e le condizioni idrodinamiche delle gocce.

Vortexare brevemente ogni campione per risospendere le cellule prima del caricamento nell'ordinatore cellulare. Iniziare analizzando il campione non colorato per impostare la selezione della popolazione cellulare totale, escludere i detriti cellulari e determinare l'autofluorescenza o la colorazione di fondo. Successivamente, analizzare il campione non colorato più DPI per determinare e selezionare la popolazione di cellule vive all'interno della popolazione cellulare totale.

Analizzare ciascun controllo monocromatico per determinare e calibrare parametri come la compensazione. Analizzare il campione colorato per definire la posizione dei gate per l'ordinamento. Una volta impostati i parametri e i gate per le popolazioni cellulari desiderate, iniziare a ordinare le popolazioni cellulari marcate in provette eppendorf o in provette coniche da 15 millilitri contenenti mezzo di coltura o buffer di lisi per l'RNA.

Immediatamente dopo il completamento del sorting, centrifugare le cellule e trasferirle in mezzo fresco o in un buffer di lisi per l'RNA. A seconda dello scopo del vostro esperimento, se i fibroblasti selezionati devono essere coltivati, occorre sempre seminarli su piastre rivestite con collagene e mai direttamente su plastica, poiché ciò provocherebbe l'attivazione dei fibroblasti con conseguenti modifiche nell'espressione genica. L'utilizzo del recettore alfa per il PDGF come marcatore per i fibroblasti consente l'isolamento di popolazioni altamente arricchite di fibroblasti tissutali.

In questo esempio, sospensioni cellulari singole di ghiandole mammarie di topo sono state marcate con anticorpi contro il recettore di PDGF alfa e F quattro 80. Il grafico di selezione è mostrato nel pannello sinistro, dove P due è la finestra per i fibroblasti e P quattro è la finestra per i macrofagi. È stata eseguita un'analisi post-selezione per determinare la purezza dei fibroblasti selezionati, mostrata nel pannello destro, e dei macrofagi, mostrati nel pannello centrale.

La figura seguente mostra un'analisi della purezza del campionamento mediante Q-R-T-P-C-R di geni di controllo specifici per cellule, come fibroblasti, cellule immunitarie e cellule epiteliali. I risultati sono stati normalizzati a due geni di controllo, ga, DH e mgus, e l'espressione relativa a gap. DH è mostrata; tali analisi mostrano tipicamente una contaminazione compresa tra lo 0,1 e lo 0,6%.

Questo livello di purezza permette un'analisi di alta qualità del trascrittoma dei fibroblasti isolati. La quantificazione dell'espressione del recettore alfa per il PDGF in una popolazione non ordinata di fibroblasti mammari indica che circa l'85% dei fibroblasti totali del tessuto nelle ghiandole mammarie è positivo per il recettore alfa del PDGF. Ho isolato.

I fibroblasti possono essere coltivati direttamente dopo il sorting, ma potrebbero richiedere alcuni giorni per riprendersi. È essenziale eseguire tutti i successivi esperimenti con cellule a basso numero di passaggi, poiché i fibroblasti primari entrano in senescenza durante la propagazione. In coltura, una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata in quattro ore se eseguita correttamente.

Se le cellule tritate sono destinate alla coltura, è importante ricordare di eseguire tutte le procedure in condizioni sterili. In questo caso, non abbiamo eseguito un'ordinazione sterile. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come isolare una popolazione altamente arricchita di fibroblasti da tessuto fresco.