Isolamento di fibroblasti normali e tumorali associata da tessuti freschi di fluorescenza activated cell sorting (FACS)

Cancro fibroblasti associati (CAF) facilitare l'iniziazione del tumore, la crescita e la progressione attraverso la segnalazione che promuove la proliferazione, l'angiogenesi, e l'infiammazione. Qui si descrive un metodo per isolare popolazioni pure di fibroblasti normali e CAF dal topo freschi e tessuti umani mediante selezione delle cellule, utilizzando PDGFRα come marcatore di superficie.

Lo scopo di questa procedura è isolare i fibroblasti normali e associati al cancro da tessuti freschi. Ciò si ottiene sezionando prima le ghiandole mammarie. Il secondo passo consiste nel preparare le ghiandole mammarie, le sospensioni di singole cellule, la cellula successiva sostenuta con anticorpi specifici per i fibroblasti e anticorpi specifici per altre popolazioni cellulari.

Il passaggio finale consiste nell'eseguire l'approvvigionamento di cellule attivate dalla fluorescenza o i fatti. In definitiva, il profilo di espressione Q-R-T-P-C-R di specifici marcatori espressi nelle popolazioni cellulari selezionate viene utilizzato per valutare la purezza delle popolazioni cellulari selezionate. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per l'isolamento dei fibroblasti è che consente l'isolamento della maggior parte dei fibroblasti tissutali con una contaminazione minima da parte di cellule immunitarie o cellule epiteliali, evitando al contempo una fase di coltura tissutale che può modificare il profilo di espressione genica dei fibroblasti.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono a tutte le terapie per il cancro al seno perché la comprensione e l'identificazione di bersagli molecolari può fornire un nuovo approccio combinatore per combattere la progressione del cancro al seno, estendere la sopravvivenza dei pazienti e, in ultima analisi, aiutare a migliorare e personalizzare le opzioni terapeutiche individualizzate. Oltre al tuo occhio, la dottoressa Lena da sola, il responsabile del laboratorio dimostrerà la procedura per iniziare questa procedura. Posiziona il topo femmina soppresso sul dorso su una superficie di polistirolo e usa aghi da 25 gauge per bloccare saldamente tutti e quattro gli arti.

Spruzzare generosamente il topo con etanolo al 70% usando una pinza. Tirare verso l'alto la pelle addominale sulla linea mediana e praticare una piccola incisione con le forbici affilate partendo dall'incisione. Tagliare la pelle fino al collo dell'animale evitando di perforare le cavità toraciche addominali.

Tagliare la pelle delle zampe posteriori dall'incisione della linea mediana verso la gamba, ottenendo una forma a Y. Quindi, allontanare la pelle dal corpo del topo e fissarla esponendo le ghiandole mammarie attaccate alla parte inferiore della pelle. Una delle cose più problematiche in questa procedura è evitare di prelevare tessuto muscolare.

Per evitare questo problema, prenderò solo la quarta e la quinta ghiandola mammaria e non la seconda, che si trova in prossimità del tessuto muscolare. Usa i cotton fioc per separare delicatamente la ghiandola della memoria dalla pelle mentre tagli il tessuto congiuntivo con piccole forbici affilate per separare la ghiandola della memoria verso la colonna vertebrale del topo, rimuovere eventuali regioni necrotiche che si trovano. Posizionare le ghiandole di memoria sezionate in PBS sul ghiaccio.

Il modo più semplice per ottenere tessuto cutaneo senza doversi occupare della depilazione è usare le orecchie del topo. Usa le forbici affilate per tagliare entrambe le orecchie dal topo soppresso. Metti immediatamente le orecchie in un barattolo per la digestione contenente un piccolo volume di PBS con ghiaccio.

Per preparare una sospensione di una singola cellula della ghiandola mammaria si utilizzano forbici curve per tritare accuratamente le ghiandole mammarie in un barattolo di digestione contenente un piccolo volume di PBS su ghiaccio, aggiungere 20 millilitri di soluzione di collagenasi al tessuto macinato. Questa quantità di soluzione di collagenasi dissocierà in modo efficiente circa cinque grammi di memoria o tessuto tumorale e orecchie da un massimo di 15 topi. Mettere immediatamente su una piastra di agitazione a bagnomaria a 37 gradi Celsius e incubare per 15 minuti mescolando a una velocità media per fermare la reazione a 30 millilitri di DMEM freddo più il 10% di FCS.

Quindi, filtrare la miscela di tessuto e terreno attraverso un colino cellulare da 70 micron posizionato sopra un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare la provetta conica per cinque minuti a 450 volte G a quattro gradi Celsius. Se i topi non sono stati perfusi al cuore con PBS prima del sacrificio, i globuli rossi nel campione dovranno essere bugiardi prima della colorazione immunitaria.

Le cellule devono essere bloccate per la FC endogena prima di marcare i fibroblasti e altre popolazioni cellulari. Resus sospendere le cellule in uno o tre millilitri di tampone fax, quindi aggiungere il blocco FC a una diluizione da uno a 50 incubare su ghiaccio per 10-20 minuti. Non è necessario lavare via le aliquote di celle da 100 microlitri trasferite in blocco FC per terminare le provette orph da utilizzare come controllo non colorato e controlli a colore singolo.

A seconda del numero di anticorpi fluorescenti utilizzati in questa dimostrazione, verranno utilizzati due anticorpi fluorescenti per marcare i fibroblasti all'anti recettore alfa PDGF. Questo è direttamente coniugato a un Fluor con una diluizione da uno a 50 per il campione di smistamento, nonché ai controlli a colore singolo per etichettare altre popolazioni cellulari. Aggiungere gli appropriati anticorpi coniugati fluorescenti ai marcatori di superficie anche con una diluizione da uno a 50.

Si raccomanda di aggiungere anticorpi anche a provette di controllo monocolore, compresi gli anticorpi per le cellule immunitarie e le cellule epiteliali, al fine di escludere eventuali popolazioni doppie positive e quindi migliorare la purezza dei fibroblasti isolati. Quindi, incubare le cellule con anticorpi per un'ora sul ghiaccio al buio, dopo un'ora di lavaggio delle cellule riempiendo le provette con il tampone fax uno e centrifugando per cinque minuti a 450 volte G a quattro gradi Celsius, le cellule US aspirate sate e resus piegano le cellule nel tampone fax uno fino a una concentrazione più appropriata per lo smistamento con lo smistatore fax da utilizzare. Trasferire le cellule marcate nei tubi fax con la parte superiore del filtro e filtrare le celle nei tubi per evitare grumi di cellule e grumi per escludere le cellule morte.

Un DPI per tutti i campioni ad eccezione del controllo non colorato. Conservare i campioni sul ghiaccio durante l'analisi fax. Per iniziare questa procedura, utilizzare il software fact sorter per preparare l'impostazione della fluorescenza, l'impostazione dell'acquisizione e l'impostazione della goccia idrodinamica.

Agitare brevemente ogni campione per risospendere le cellule prima di caricarlo nel selezionatore di celle. Iniziare analizzando il campione non colorato per impostare il gating per la popolazione cellulare totale per eliminare i detriti cellulari e determinare l'autofluorescenza o la colorazione di fondo. Successivamente, analizzare il campione non colorato più DPI per determinare e controllare la popolazione di cellule vive dalla popolazione cellulare totale.

Analizza ogni singolo controllo del colore per determinare e calibrare parametri come la compensazione. Analizzare il campione di colorazione per definire la posizione dei cancelli per l'ordinamento. Una volta impostati i parametri e i cancelli per le popolazioni cellulari desiderate, iniziare a smistare le popolazioni cellulari marcate in provette eph o provette coniche da 15 millilitri contenenti terreno di coltura o tampone di lisi dell'RNA.

Immediatamente dopo la cernita, centrifugare le cellule e trasferirle in un terreno fresco o in un tampone di lisi dell'RNA. A seconda dello scopo dell'esperimento, se ordinati, i fibroblasti devono essere coltivati, sempre piastra su piastre rivestite di collagene, mai piastra direttamente sulla plastica, poiché ciò comporterà l'attivazione dei fibroblasti che porterà a cambiamenti nella loro espressione genica. L'utilizzo del recettore alfa PDGF come marcatore per i fibroblasti consente di isolare popolazioni altamente arricchite di fibroblasti tissutali.

In questo esempio, sospensioni di singole cellule di ghiandole mammarie di topo sono state colorate con il recettore PDGF alfa e gli anticorpi F 4 80. Il grafico di smistamento dei fatti è mostrato nel pannello di sinistra, dove P due è la porta dei fibroblasti e P quattro è la porta dei macrofagi. È stata eseguita un'analisi post-sorgente per determinare la purezza dei fibroblasti selezionati mostrati nel pannello di destra e dei macrofagi mostrati nel pannello centrale.

La figura seguente mostra un'analisi della purezza di approvvigionamento da parte di Q-R-T-P-C-R dei geni di controllo specifici per fibroblasti, cellule immunitarie e cellule epiteliali. I risultati sono stati normalizzati in due geni housekeeping, ga, DH e mgus, e l'espressione relativa al gap. È dimostrato che tali analisi mostrano in genere una contaminazione da 0,1 a 0,6%.

Questo livello di purezza consente la profilazione del trascrittoma di alta qualità dei fibroblasti isolati. La quantificazione dell'espressione del recettore alfa PDGF in una popolazione non selezionata di fibroblasti mammari indica che circa l'85% dei fibroblasti tissutali totali nelle ghiandole mammarie sono positivi al recettore alfa PDGF. Mi sono isolato.

I fibroblasti possono essere coltivati direttamente dopo la cernita, ma possono richiedere alcuni giorni per riprendersi. È essenziale eseguire tutti gli ulteriori esperimenti con cellule a basso massaggio poiché i fibroblasti primari vanno incontro a senescenza durante la propagazione. Nella cultura, una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se eseguita correttamente.

Se le cellule di terze parti sono destinate ad essere coltivate, è necessario ricordarsi di eseguire tutta la procedura in condizioni sterili. In questo servizio fotografico, non abbiamo eseguito una cernita sterile. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare una popolazione altamente arricchita di fibroblasti da tessuto fresco.