Name: Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) analisi per la determinazione della proteasi SENP1 Cinetica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 2 s
Description: Scopri l'analisi quantitativa FRET per la cinetica della proteasi SENP1 utilizzando un saggio a singolo passo in tempo reale. Questo metodo consente di determinare i parametri KM e kcat con alta precisione.

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Siamo molto grati a Victor GJ Rodgers per preziosi consigli. Ringraziamo tutti i membri del gruppo di Liao per molto stretto lavoro di collaborazione e di aiuto con questo studio. Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health (Grant AI076504 a JL).

1. Costrutti plasmidici <ol><li> Amplificare le fasi di lettura aperte dei geni mediante PCR, e clonare i prodotti di PCR in pCRII-TOPO vettore. </li><li> Confermare i prodotti dal sequenziamento, e clonare il cDNA codificante CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet e domini catalitici di SENP1 nella (b) pET28 vettore con un N-terminale tag hexahistidine. </li></ol> 2. Espressione e purificazione di proteine <ol><li> Trasformare cellule di Escherichia coli ceppo BL21 (DE3) con pET28 (b) vettori codificanti CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet ed i domini catalitici di SENP1. </li><li> Coltivato i batteri trasformati in mezzo 2xYT per 3 ore a 37 ° C (agitando a 250 rpm) per raggiungere una densità ottica di 0,5 a 600 nm. </li><li> Aggiungere 100 mM isopropil-β-D-tiogalattoside (IPTG) (concentrazione finale) per indurre l&#39;espressione di proteine ​​e agitare per 16 ore a 25 ° C a 200 rpm. </li><li> Raccogliere i batteri da centrifugzione a 10.000 rpm a 4 ° C per 5 minuti e risospendere in un tampone di 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 5 mM e imidazolo. </li><li> Sonicare le cellule per 10 min a 5-sec intervalli in un livello di potenza di 25 W utilizzando MiSonics 4000 sonicatore e alla loro raccolta per centrifugazione a 35.000 xg a 4 ° C per 30 min. </li><li> Impostare la colonna con 500 ml Ni-NTA perline per 1 L cultura e trasferire il sopranatante in colonna. </li><li> Lavare la resina con tampone di 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl, 10 mM imidazolo e due volte. </li><li> Proteine ​​eluire con tampone di 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, e 500 mM imidazolo e dialisi in un tampone di 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 1 mM ditiotreitolo (DTT) a 4 ° C per una notte. </li><li> Determinare le concentrazioni delle proteine ​​purificate dal saggio Bradford. Metodo alternativo per la misura della concentrazione di proteine ​​sarà SDS-PAGE elettroforesi su gel e quindi colorato con Coomassie blue seguita con imagingquantitativa. </li></ol> 3. Quantitativa FRET Analisi dello spettro <ol><li> La strategia generale per il saggio è basato su FRET segnalazione (Figura 1). La coppia FRET, CyPet e YPet, è stato etichettato per la N-e C-termini, rispettivamente, di pre-SUMO1. SENP1 scinde la proteina di fusione CyPet-(pre-SUMO1)-YPet al Gly-Gly del sito in SUMO1 del C-terminale e, quindi, rilascia la coda SUMO con YPet. Il segnale di FRET è interrotto, con conseguente aumento delle emissioni da CyPet e una drastica riduzione delle emissioni di YPet alla lunghezza d&#39;onda di eccitazione CyPet. </li><li> Quando eccitato dalla luce di lunghezza d&#39;onda 414 nm, l&#39;emissione totale di fluorescenza di CyPet-(pre-SUMO1)-YPet a 530 nm può essere derivato da tre fonti: emissione assoluto FRET indotta YPet, il CyPet emissione diretta e YPet emissione diretta (Figura 2). </li></ol><img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq1.jpg" /> dove FL 530/414 &lt;/ Sub&gt; è l&#39;emissione totale di fluorescenza a 530 nm quando viene eccitato a 414 nm, FL FRET è l&#39;assoluto segnale di FRET, FL CyPet (continua) è l&#39;emissione CyPet diretta quando viene eccitato a 414 nm, e FL YPet (continua) è la YPet emissione diretta quando viene eccitato a 414 nm. L&#39;indice di (continua) sta per contributo. <ol start="3"><li> L&#39;emissione diretta di CyPet a 530 nm è proporzionale alla sua emissione a 475 nm quando viene eccitato a 414 nm con un rapporto costante di α. CyPet-SUMO1 è stato preparato a concentrazioni di 50, 100, 200, 500, e 750 nm e 1 mm , e le emissioni a 475 e 530 nm sono stati misurati dopo eccitazione a 414 nm per determinare α (Figura 3-1). </li><li> L&#39;emissione diretta di YPet a 530 nm in eccitazione a 414 nm è proporzionale alla sua emissione a 530 nm quando viene eccitato a 475 nm con un rapporto costante di β. YPet è stato preparato a concentrazioni di 50, 100, 200, 500, 750 And 1.000 nm e l&#39;emissione a 530 nm è stata misurata quando i campioni sono stati eccitati da lunghezze d&#39;onda di 414 e 475 nm per determinare β (Figura 3-2). </li><li> Quando CyPet-(pre-SUMO1)-YPet è stato digerito dal SENP1, la scissione rilasciato CyPet-SUMO1 e la coda SUMO1 con YPet. Quando il composto è stato eccitato a 414 nm, l&#39;emissione di fluorescenza a 530 nm (FL &#39;530/414) è diminuita ma può ancora essere divisa in tre parti come: </li></ol><img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq2.jpg" /> dove FL &#39;530/414 è il totale delle emissioni di fluorescenza a 530 nm dopo la digestione quando eccitato a 414 nm, FL&#39; FRET è il restante assoluto segnale di FRET, FL &#39;CyPet (475/414) è l&#39;emissione CyPet a 475 nm dopo la digestione quando eccitato a 414 nm (in questo caso l&#39;emissione CyPet è da due parti: non digerito CyPet-(pre-SUMO1)-YPet e digerito CyPet-SUMO1), e FL YPet(530/475) è l&#39;emissione YPet quando eccitato a 475 nm, che è costante se CyPet-(pre-SUMO1)-YPet viene digerito o meno. <ol start="6"><li> Dopo digestione SENP1, il restante FRET emissione (FL &#39;FRET) è: </li></ol><img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq3.jpg" /> dove C è la concentrazione totale di CyPet-(pre-SUMO1)-YPet ed x è la concentrazione di digerito CyPet-(pre-SUMO1)-YPet. <ol start="7"><li> Combinando tutti gli elementi, l&#39;emissione di fluorescenza rilevata a 530 nm in eccitazione di 414 nm (FL &#39;530/414) è: </li></ol><img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq4.jpg" /> 4. FRET saggio basato Proteasi per Enzyme studio cinetico <ol><li> CyPet-(pre-SUMO1)-YPet stato incubato con il dominio catalitico di SENP1 a 37 ° C in un tampone di 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 0,1% (v /v) Tween-20 e DTT 1 mM in un volume totale di 80 ml e trasferita in piastra a 384 pozzetti. </li><li> Piste stati condotti misurando l&#39;emissione di fluorescenza a 475 e 530 nm dopo eccitazione a 414 nm in un lettore di piastra multipozzetto fluorescenza per 5 minuti con intervalli di 15 sec. </li><li> La velocità di reazione (v) è stata correlata con la variazione della quantità di substrato (S), come: </li></ol><img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq5.jpg" /><ol start="4"><li> La concentrazione di prodotto aumentato esponenzialmente da 0 a [S] 0 (concentrazione del substrato originale) quando t = 0: </li></ol><img alt="Equazione 6" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq6.jpg" /><ol start="5"><li> Quando t = 0, la velocità iniziale (V 0) è: </li></ol><img alt="Equazione 7" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq7.jpg" /><ol start="6"><li> Il concentration di SENP1 è stato fissato, e la concentrazione di CyPet-(pre-SUMO1)-YPet stata aumentata da 100 volte superiore alla concentrazione di enzima, che è richiesta da Michaelis-Menten. </li><li> Tutte le letture di fluorescenza sono stati analizzati con il metodo di analisi quantitativa FRET e tracciata in Software GraphPad Prism V per adattarsi alla Michaelis-Menten. La regressione non lineare può essere eseguita anche con l&#39;ausilio di pacchetti software più comuni, come i programmi di fogli di calcolo (ad esempio Microsoft Excel). </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Maturazione di pre-SUMO1 da SENP1 può essere determinata monitorando i cambiamenti nel segnale di fluorescenza a 475 e 530 nm durante il processo. Il risultato ha mostrato che la velocità di pre-SUMO1 digestione SENP1 in un modo dipendente dalla dose-substrato (Figura 4). Questo suggerisce che il dominio catalitico di SENP1 mostra un&#39;attività eccellente per la maturazione di pre-SUMO1. La reazione inizialevelocità zione sono stati calcolati dalla precedente analisi con diverse concentrazioni di substrato (Tabella 1). Il cat / K k rapporto M è generalmente utilizzato per confrontare le efficienze di differenti enzimi con un substrato o un particolare enzima con substrati diversi. K M e V max può essere ottenuta dalla equazione di Michaelis-Menten tracciando le velocità iniziali diverse, corrispondenti per le diverse concentrazioni di CyPet-(pre-SUMO1)-YPet (Figura 5) cat k è stato ottenuto come.: <img alt="Equazione 8" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq8.jpg" /> Secondo l&#39;analisi di cui sopra, il valore calcolato per K M è stato 0,21 ± 0,04 mM, il gatto k era 6,90 ± 0,28 s-1, e il gatto / K M k rapporto era (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 </sup<html> &gt; S -1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig1.jpg" /> Figura 1. Grafico di FRET saggio basato proteasi per SENP pre-Sumos maturazione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig2.jpg" /> Figura 2. L&#39;analisi quantitativa del segnale fluorescente, come contributi del donatore accettore, e FRET. Dissezione di spettri di emissione da CyPet-(pre-SUMO1)-YPet sotto eccitazione a 414 nm. FL CyPet (530/414) è emissione CyPet di a 530 nm in eccitazione di 414 nm, FL FRET è il FRET indotta emissioni YPet a 530 nm in eccitazione di 414 nm, e FL YPet (530/414) è l&#39;emissione YPet di a 530 nm in eccitazione di 414 nm. load/4430/4430fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Calcolo del fattore di emissione α direzione e β. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig4.jpg" /> Figura 4. Analisi quantitativa di CyPet-(pre-SUMO1)-YPet digerito dai rapporti diversi del dominio catalitico di SENP1. Le reazioni sono state monitorate entro i primi 5 min. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig5.jpg" /> Figura 5. Michaelis-Menten analisi grafica di digestione CyPet-(pre-SUMO1)-YPet da parte SENP1. I dati sono stati riportati e analizzati da GraphPad Prism V e la regressione non lineare. <table border="1"><tbody><tr><td> [S] (pM) </td><td> V 0 (pM / s) </td></tr><tr><td> 0,115 </td><td> 0,0023 ± 0,00005 </td></tr&gt; <tr><td> 0,214 </td><td> 0,0028 ± 0,00004 </td></tr><tr><td> 0,407 </td><td> 0,0033 ± 0,00007 </td></tr><tr><td> 0,594 </td><td> 0,0037 ± 0,00013 </td></tr><tr><td> 0,725 </td><td> 0,0043 ± 0,00012 </td></tr><tr><td> 1,471 </td><td> 0,0051 ± 0,00036 </td></tr><tr><td> 1,899 </td><td> 0,0050 ± 0,00031 </td></tr><tr><td> 2,300 </td><td> 0,0050 ± 0,00062 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Iniziale determinazione velocità di maturazione pre-SUMO1 da parte SENP1. In ogni concentrazione del substrato, quattro campioni sono stati utilizzati per misurare la digestione. La deviazione standard è venuto dalle variazioni di questi quattro campioni. <table border="1"><tbody><tr><td> K M (pM) </td><td> k cat (s-1) </td><td> k cat / K M (M -1 • s-1) </td></tr><tr><td> 0,21 ± 0,04 </td><td> 6,90 ± 0,28 </td><td> 3,2 ± 0,55 × 10 7 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Parametri cinetici di maturazione pre-SUMO1 da parte SENP1 da quantitativa FRET analisi. La deviazione standard è venuto dai quattro campioni per ogni concentrazione del substrato.

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<li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

FRET tecnologia è stata usata per studiare la maturazione pre-SUMO1 da parte SENP1 9. CFP-YFP è stato usato come FRET coppia e analisi raziometrico, che è il rapporto tra accettore di emissioni donatori, è stato utilizzato per caratterizzare le proprietà cinetiche. Tuttavia, non vi è alcuna considerazione di donatore e accettore auto-fluorescenza nella raziometrica tradizionale analisi FRET. Il rapporto non è direttamente correlata con la quantità di substrato digerito. Qui riport...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> PCR II TOPO Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K466040 </td></tr><tr><td> 2xYT </td><td> Ricerca Prodotti Internationa.l Corp. </td><td> X15600 </td></tr><tr><td> Ni-NTA Agrose </td><td> Thermo Scientific </td><td> 88222 </td></tr><tr><td> Coomassie più (Bradford) Regent Assay </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23238 </td></tr><tr><td> Piastra a 384 pozzetti (inferiore di vetro) </td><td> Greiner </td><td> 781892 </td></tr><tr><td> FlexStation II 384 lettore di piastre </td><td> Dispositivo molecolare </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitativa fret (förster resonance energy transfer) analisi per la determinazione della proteasi senp1 cinetica

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Reversibili modificazioni post-traduzionali di proteine ​​con proteine ​​ubiquitina o ubiquitina-like (Ubls) sono ampiamente utilizzati per regolare in modo dinamico l&#39;attività della proteina e hanno ruoli diversi in molti processi biologici. Ad esempio, SUMO modifica covalentemente un numero grande o proteine ​​con un ruolo importante in molti processi cellulari, tra cui cellule-regolazione del ciclo, la sopravvivenza cellulare e la morte, danno la risposta del DNA e risposta allo stress 1-5. SENP, come SUMO-specifiche proteasi, funziona come un endopeptidasi nella maturazione dei precursori SUMO o come isopeptidase per rimuovere SUMO dalle sue proteine ​​bersaglio e aggiornare il ciclo sumoilazione 1,3,6,7. L&#39;efficienza catalitica o specificità di un enzima è meglio caratterizzato dal rapporto delle costanti cinetiche, k cat / K M. In diversi studi, i parametri cinetici di SUMO-SENP coppie sono state determinate con vari metodi, tra cui gel di poliacrilammide-based western blot, radIOActive-marcato substrato, composto fluorescente o proteina marcata substrato 8-13. Tuttavia, le poliacrilammide-gel a base di tecniche, che hanno utilizzato i &quot;nativi&quot;, ma le proteine ​​sono laboriosi e tecnicamente impegnativo, che non si prestano ad una dettagliata analisi quantitativa. Il ottenuta k cat / K M da studi usando tetrapeptidi o proteine ​​con ACC (7-ammino-4-carbamoylmetylcoumarin) o AMC (7-ammino-4-metil) fluoroforo erano o fino a due ordini di grandezza inferiore ai substrati naturali o non può chiaramente distinguere le iso-e attività di endopeptidasi SENPs. Saggi della proteasi Recentemente, FRET-based sono stati utilizzati per studiare gli enzimi deubiquitinating (Dubs) o SENPs con il FRET coppia di proteina fluorescente ciano (PCP) e giallo proteina fluorescente (YFP) 9,10,14,15. Il rapporto di emissione dell&#39;accettore di emissione del donatore è stato utilizzato come parametro quantitativo per FRET segnale monitor per proteasi acproduttività determinazione. Tuttavia, questo metodo ignorato segnale contaminazioni crociate al accettore e lunghezze d&#39;onda di emissione del donatore e accettore da donatore auto-fluorescenza e quindi non era accurata. Abbiamo sviluppato un nuovo altamente sensibile e quantitativa FRET saggio basato proteasi per determinare i parametri cinetici di pre-SUMO1 maturazione da SENP1. Un multistrato FRET CyPet coppia e YPet con significativamente migliorato FRET efficienza e resa quantica di fluorescenza, sono stati utilizzati per generare il CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substrato 16. Abbiamo differenziato e quantificato assoluti segnali di fluorescenza fornite dal donatore e accettore FRET e alle lunghezze d&#39;onda di emissione e accettori, rispettivamente. Il valore di k cat / K M è stato ottenuto come (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 s -1 SENP1 verso di pre-SUMO1, che è in accordo con i parametri generali cinetica enzimatica. Pertanto, questo metodo è valido e può essere utilizzato unsa generale approccio per caratterizzare proteasi anche altri.

Un nuovo metodo che utilizza l&#39;analisi quantitativa di FRET (Förster Resonance Energy Transfer) segnali è descritto per lo studio di cinetica enzimatica.<em&gt; K<sub&gt; M</sub</em&gt; E<em&gt; K<sub&gt; Cat</sub</em&gt; Sono stati ottenuti per l&#39;idrolisi del dominio catalitico di SENP1 (SUMO / Sentrin specifica proteasi 1) di controllare la validità SUMO1 (Small ubiquitina-like Modifier). I principi generali della presente quantitativa-FRET-based studio cinetico proteasi può essere applicato ad altre proteasi.

Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) analisi per la determinazione della proteasi SENP1 Cinetica

Le modificazioni post-traduzionali reversibili delle proteine mediante ubiquitina o proteine simil-ubiquitina (Ubl) sono ampiamente utilizzate per regolare dinamicamente le proteine...

Questo video dimostra un nuovo saggio fret in un singolo passaggio per l'analisi quantitativa della cinetica delle proteasi. La strategia generale per il saggio seguente si basa sull'analisi del segnale fret. Qui, la coppia fret, cype e ype, è legata ai terminali N e C del pre sumo uno nel substrato integro e cype e ype sono in prossimità ravvicinata.Quando questa molecola viene eccitata a 414 nanometri, la maggior parte del segnale di emissione si trova a 530 nanometri. Tuttavia, quando viene aggiunta la proteasi SENP1, il substrato viene scisso a livello del residuo Gly-Gly al termine C-terminale di SUMO1, separando così CIPA e WPA. A questo punto, eccitando a 414 nanometri, la maggior parte del segnale di emissione osservato si trova a 475 nanometri.Per valutare la cinetica di questa reazione, le emissioni di fluorescenza vengono misurate ogni 15 secondi per un periodo di cinque minuti. L'analisi dei dati di fluorescenza ottenuti rivela la velocità con cui il substrato cype pre sumo one ype viene digerito dalla proteasi SENP one. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come un saggio basato su massa, un saggio con substrato peptidico fluorescente o un'analisi radiometrica o un western blot, consiste nella capacità di determinare i parametri cinetici in tempo reale mediante un saggio in un unico passaggio e in tempo reale.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla diagnosi di malattie correlate a proteine, come i tumori e le malattie metaboliche. Poiché questa tecnica può fornire saggi precisi e ad alto rendimento per varie proteine, nonché per la scoperta di inibitori e la caratterizzazione delle procedure dimostrative delle malattie, lo studente laureando ENUA del mio laboratorio, che è stato la prima persona a sviluppare questo metodo e questa procedura, ne illustrerà l'applicazione. Iniziare questa procedura amplificando, mediante PCR, i frame di lettura aperti di Cype ype pre sumo uno, sumo uno maturo e il dominio catalitico di SENP uno.Clonare i prodotti ottenuti nel vettore PCR two topo. Successivamente, confermare che le sequenze dei geni siano corrette mediante sequenziamento. Quindi, clonare il CD NA che codifica CYPE pre sumo one ype cype sumo, one ype e il dominio catalitico di SENP one nel vettore PET 28 B con un tag Polyhis all'estremità N-terminale.Dopo aver clonato i geni nel vettore, trasformarli in Esia coli, BBL 21 DE tre mediante elettroporazione. Dopo aver seminato i batteri trasformati su mezzo solido, selezionare singole colonie e coltivarle per tutta la notte. Successivamente, inoculare fiasche da due litri di mezzo due XYT con i batteri trasformati in un rapporto di uno a 100.Incubare le colture per tre ore a 37 gradi Celsius, agitando a 250 giri/min, fino a raggiungere una densità ottica di 0,5 a 600 nanometri. Per indurre l'espressione proteica, aggiungere IPTG fino a una concentrazione finale di 100 micromolare e agitare per 16 ore a 25 gradi Celsius a 200 giri/min. Successivamente, trasferire i batteri in bottiglie da centrifuga da 250 millilitri.Quindi raccogliere i batteri mediante centrifugazione a 8.000 G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Al termine della centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule batteriche in un buffer di lisi costituito da cloruro di sodio e tris HCl, trasferendo le colture in provette da 50 millilitri. Centrifugare quindi le provette e sottoporre le cellule a sonica ad un'ampiezza del 70% per 10 minuti, con intervalli di cinque secondi, al fine di rompere le cellule batteriche.Quindi, per separare le proteine di fusione dai detriti cellulari, centrifugare i tubi a 35.000 RCF a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Durante la centrifugazione, preparare una colonna BioRad da 10 millilitri con 500 microlitri di perle al nichel NTI per ogni litro di cellule coltivate. Lasciare scorrere la soluzione dalla colonna al termine della centrifugazione.Trasferire il soprannatante in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Versare la soluzione del soprannatante nella colonna. Una volta che tutto il soprannatante è penetrato nella resina, lavare la colonna due volte con 10 millilitri di buffer tris cloridrato cloruro di sodio e emettere un buffer aole.Per eluire, aggiungere 500 microlitri dello stesso tampone, questa volta contenente 500 millimolari di ole. Raccogliere il flusso in uscita in un tubo da microcentrifuga.Successivamente, trasferire la soluzione in un tubo da dialisi con cutoff molecolare di 10 chilodalton e dializzare il campione per tutta la notte in un litro di tampone contenente 20 millimoli di tris, 50 millimoli di cloruro di sodio e 1 millimole di DTT a quattro gradi Celsius. Dopo la dialisi, trasferire le proteine purificate in una provetta da microcentrifuga e determinarne la concentrazione mediante saggio di Bradford. In seguito, le proteine purificate vengono utilizzate per valutare la velocità con cui pre-sumo uno viene scisso da SENP uno, mediante un saggio FRET quantitativo.In provette microcentrifuga preparare 60 millilitri di Spet Sumo uno e YA a concentrazioni di 5100, 200 500, 750 e 1000 nanomolari. Questi campioni di controllo verranno utilizzati per caratterizzare il rapporto costante tra l'emissione diretta di cype e YA nello stesso tampone. Preparare cype pre sumo uno y PET a 12 concentrazioni comprese tra 0,03 micromolari e 0,9 micromolari e una diluizione di 0,3 nanomolari del dominio catalitico di SENP uno.Impostare il lettore di piastre multipozzetto a fluorescenza per misurare l'emissione fluorescente a 475 e 530 nanometri dopo un'eccitazione a 414 nanometri e l'emissione a 530 nanometri dopo un'eccitazione a 475 nanometri, con intervalli di 32 secondi per due minuti a 37 gradi Celsius. Per ottenere l'autofluorescenza della piastra, posizionare una piastra vuota da 384 pozzetti nel fluorimetro ed effettuare le misurazioni. Una volta determinata l'autofluorescenza della piastra, regolare le impostazioni del fluorimetro in modo che per Cype Sumo un'eccitazione sia a 414 nanometri e le misurazioni vengano effettuate a 475 e 530 nanometri, mentre per ype l'eccitazione sarà a 414 e 475 nanometri e le misurazioni verranno effettuate a 530 nanometri.Successivamente, aggiungere 75 microlitri di cype Sumo one ype o cype sumo one ype nelle pozzette appropriate della piastra a 384 pozzette in triplicato, come mostrato in questo diagramma. Quindi aggiungere 5 microlitri della SENP uno preparata in ogni pozzetta, portando il volume finale a 80 microlitri; posizionare immediatamente la piastra nel fluorimetro e iniziare le misurazioni di fluorescenza seguendo l'analisi. Analizzare i valori di fluorescenza utilizzando il metodo quantitativo di analisi FRET illustrato nella prossima sezione.L'idea generale di questa tecnologia consiste nel correlare il segnale di trasferimento assoluto con la digestione. Per ottenere il segnale di trasferimento assoluto, è necessario escludere i contributi diretti del donatore e dell'accettore dall'emissione fluorescente totale alle lunghezze d'onda di emissione dell'accettore.I contributi diretti del donatore e dell'accettore vengono calcolati a partire dai fattori del coefficiente di correlazione alfa e beta del donatore e degli accettori, rispettivamente. In questa sezione del video verrà illustrato nel dettaglio come vengono effettuati i calcoli. Per analizzare la cinetica della digestione del substrato da parte di SENP1, utilizzare il software GraphPad Prism 5; iniziare aprendo il file txt esportato in Excel, dopo aver sottratto la fluorescenza di fondo della piastra.La concentrazione del substrato digerito in diversi punti temporali viene calcolata dalle formulazioni PrepU quando eccitate da luce con lunghezza d'onda di 414 nanometri; l'emissione fluorescente totale di spet pre sumo one ype a 530 nanometri può essere derivata da tre fonti: l'emissione assoluta di Y pets indotta da FRET, l'emissione diretta di cype e l'emissione diretta di wpe. In questa equazione, FL 530/414 è l'emissione fluorescente totale a 530 nanometri quando viene eccitata a 414 nanometri, mentre FL fret rappresenta il segnale FRET assoluto.FL Spet Con è l'emissione diretta di Spet. Quando viene eccitato a 414 nanometri e FL Ype Con è l'emissione diretta di Ype. Quando viene eccitato a 414 nanometri, l'emissione diretta di spet a 530 nanometri è proporzionale alla sua emissione a 475 nanometri.Quando viene eccitato a 414 nanometri con un rapporto costante di alfa, l'emissione diretta di YA a 530 nanometri sotto eccitazione a 414 nanometri è proporzionale alla sua emissione a 530 nanometri. Quando viene eccitato a 475 nanometri con un rapporto costante di beta quando spet pre sumo una ype viene digerita da SENP uno ed eccitata a 414 nanometri. L'emissione fluorescente a 530 nanometri diminuisce, ma può comunque essere suddivisa in tre parti come indicato qui.FL Prime cinque 30 barra quattro 14 è l'emissione di fluorescenza totale a 530 nanometri dopo la digestione. Quando eccitata a 414, FL Prime fret è il segnale FRET assoluto residuo e FL prime SPET 4 75 barra quattro 14 è l'emissione SPET a 475 nanometri dopo la digestione quando eccitata a 414 nanometri. L'emissione proviene da due parti: cype non digerita, pre sumo, una ype e cype Sumo una digerita.Un FL Y PET cinque 30 diviso 4 75 è l'emissione Y quando eccitato a 475 nanometri, che rimane costante indipendentemente dal fatto che CYPE pre-SUMO uno YPE sia digerito o meno dopo la digestione da parte di SENP uno. L'emissione FRET residua è mostrata in questa equazione, dove C rappresenta la concentrazione totale di CYPE pre-SUMO uno YPE, e X è la concentrazione di CYPE pre-SUMO uno YA digerito. Combinando tutti gli elementi, l'emissione di fluorescenza rilevata a 530 nanometri con eccitazione a 414 nanometri è espressa da questa equazione per il saggio proteasico basato su FRET, utilizzato nello studio della cinetica enzimatica; la velocità della reazione è correlata al cambiamento nella quantità di substrato man mano che la concentrazione del prodotto aumenta esponenzialmente a partire da zero.Quando T è uguale a zero, come mostrato qui, S con zero indica la concentrazione iniziale del substrato quando T è uguale a zero. La velocità iniziale è la maturazione della pre-sumo. Uno per SENP.Uno può essere determinato monitorando le variazioni del segnale fluorescente a 475 e 530 nanometri durante il processo. Come mostrato qui, la velocità della maturazione della pre-sumo uno era dipendente dalla concentrazione del substrato, il che suggerisce che il dominio catalitico della SENP uno mostra un'ottima attività nella maturazione della pre-sumo uno. Le velocità iniziali di reazione sono state calcolate utilizzando la stessa analisi con diverse concentrazioni di substrato.Il rapporto tra KCAT e KM è generalmente utilizzato per confrontare l'efficienza di enzimi diversi con un unico substrato o di un enzima specifico con substrati diversi. I valori di KM e Vmax possono essere ottenuti dall'equazione di McKayla Cementin tracciando le diverse velocità iniziali corrispondenti alle diverse concentrazioni di cype. Si presume che il valore di kcat per uno YA sia stato ottenuto utilizzando questa equazione.In base all'analisi sopra descritta, il KM calcolato era di 0,21 più o meno 0,4 micromolare. Il valore di kcat era di 6,90 più o meno 0,28 al secondo, e il rapporto kcat/KM era di 3,2 più o meno 0,55 per 10 alla settima per molare. In secondo luogo, dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come determinare i parametri cinetici della proteasi mediante un nuovo saggio quantitativo basato sui grassi, in un unico passaggio e in tempo reale, seguendo questa procedura.Un altro metodo, come l'inibizione del prodotto o la caratterizzazione degli inibitori, può essere eseguito per rispondere a domande aggiuntive, come il KM apparente reale o la costante di inibizione K. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle proteine per esplorare in modo accurato gli aspetti genetici, la comprensione delle proteine coinvolte nei processi fisiologici e patologici nei sensori ottici, nonché nella diagnosi immediata e nella scoperta di farmaci.

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