Name: Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) analisi per la determinazione della proteasi SENP1 Cinetica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 2 s
Description: Scopri l'analisi quantitativa FRET per la cinetica della proteasi SENP1 utilizzando un saggio a singolo passo in tempo reale. Questo metodo consente di determinare i parametri KM e kcat con alta precisione.

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Siamo molto grati a Victor GJ Rodgers per preziosi consigli. Ringraziamo tutti i membri del gruppo di Liao per molto stretto lavoro di collaborazione e di aiuto con questo studio. Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health (Grant AI076504 a JL).

1. Costrutti plasmidici <ol><li> Amplificare le fasi di lettura aperte dei geni mediante PCR, e clonare i prodotti di PCR in pCRII-TOPO vettore. </li><li> Confermare i prodotti dal sequenziamento, e clonare il cDNA codificante CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet e domini catalitici di SENP1 nella (b) pET28 vettore con un N-terminale tag hexahistidine. </li></ol> 2. Espressione e purificazione di proteine <ol><li> Trasformare cellule di Escherichia coli ceppo BL21 (DE3) con pET28 (b) vettori codificanti CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet ed i domini catalitici di SENP1. </li><li> Coltivato i batteri trasformati in mezzo 2xYT per 3 ore a 37 ° C (agitando a 250 rpm) per raggiungere una densità ottica di 0,5 a 600 nm. </li><li> Aggiungere 100 mM isopropil-β-D-tiogalattoside (IPTG) (concentrazione finale) per indurre l&#39;espressione di proteine ​​e agitare per 16 ore a 25 ° C a 200 rpm. </li><li> Raccogliere i batteri da centrifugzione a 10.000 rpm a 4 ° C per 5 minuti e risospendere in un tampone di 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 5 mM e imidazolo. </li><li> Sonicare le cellule per 10 min a 5-sec intervalli in un livello di potenza di 25 W utilizzando MiSonics 4000 sonicatore e alla loro raccolta per centrifugazione a 35.000 xg a 4 ° C per 30 min. </li><li> Impostare la colonna con 500 ml Ni-NTA perline per 1 L cultura e trasferire il sopranatante in colonna. </li><li> Lavare la resina con tampone di 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl, 10 mM imidazolo e due volte. </li><li> Proteine ​​eluire con tampone di 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, e 500 mM imidazolo e dialisi in un tampone di 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 1 mM ditiotreitolo (DTT) a 4 ° C per una notte. </li><li> Determinare le concentrazioni delle proteine ​​purificate dal saggio Bradford. Metodo alternativo per la misura della concentrazione di proteine ​​sarà SDS-PAGE elettroforesi su gel e quindi colorato con Coomassie blue seguita con imagingquantitativa. </li></ol> 3. Quantitativa FRET Analisi dello spettro <ol><li> La strategia generale per il saggio è basato su FRET segnalazione (Figura 1). La coppia FRET, CyPet e YPet, è stato etichettato per la N-e C-termini, rispettivamente, di pre-SUMO1. SENP1 scinde la proteina di fusione CyPet-(pre-SUMO1)-YPet al Gly-Gly del sito in SUMO1 del C-terminale e, quindi, rilascia la coda SUMO con YPet. Il segnale di FRET è interrotto, con conseguente aumento delle emissioni da CyPet e una drastica riduzione delle emissioni di YPet alla lunghezza d&#39;onda di eccitazione CyPet. </li><li> Quando eccitato dalla luce di lunghezza d&#39;onda 414 nm, l&#39;emissione totale di fluorescenza di CyPet-(pre-SUMO1)-YPet a 530 nm può essere derivato da tre fonti: emissione assoluto FRET indotta YPet, il CyPet emissione diretta e YPet emissione diretta (Figura 2). </li></ol><img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq1.jpg" /> dove FL 530/414 &lt;/ Sub&gt; è l&#39;emissione totale di fluorescenza a 530 nm quando viene eccitato a 414 nm, FL FRET è l&#39;assoluto segnale di FRET, FL CyPet (continua) è l&#39;emissione CyPet diretta quando viene eccitato a 414 nm, e FL YPet (continua) è la YPet emissione diretta quando viene eccitato a 414 nm. L&#39;indice di (continua) sta per contributo. <ol start="3"><li> L&#39;emissione diretta di CyPet a 530 nm è proporzionale alla sua emissione a 475 nm quando viene eccitato a 414 nm con un rapporto costante di α. CyPet-SUMO1 è stato preparato a concentrazioni di 50, 100, 200, 500, e 750 nm e 1 mm , e le emissioni a 475 e 530 nm sono stati misurati dopo eccitazione a 414 nm per determinare α (Figura 3-1). </li><li> L&#39;emissione diretta di YPet a 530 nm in eccitazione a 414 nm è proporzionale alla sua emissione a 530 nm quando viene eccitato a 475 nm con un rapporto costante di β. YPet è stato preparato a concentrazioni di 50, 100, 200, 500, 750 And 1.000 nm e l&#39;emissione a 530 nm è stata misurata quando i campioni sono stati eccitati da lunghezze d&#39;onda di 414 e 475 nm per determinare β (Figura 3-2). </li><li> Quando CyPet-(pre-SUMO1)-YPet è stato digerito dal SENP1, la scissione rilasciato CyPet-SUMO1 e la coda SUMO1 con YPet. Quando il composto è stato eccitato a 414 nm, l&#39;emissione di fluorescenza a 530 nm (FL &#39;530/414) è diminuita ma può ancora essere divisa in tre parti come: </li></ol><img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq2.jpg" /> dove FL &#39;530/414 è il totale delle emissioni di fluorescenza a 530 nm dopo la digestione quando eccitato a 414 nm, FL&#39; FRET è il restante assoluto segnale di FRET, FL &#39;CyPet (475/414) è l&#39;emissione CyPet a 475 nm dopo la digestione quando eccitato a 414 nm (in questo caso l&#39;emissione CyPet è da due parti: non digerito CyPet-(pre-SUMO1)-YPet e digerito CyPet-SUMO1), e FL YPet(530/475) è l&#39;emissione YPet quando eccitato a 475 nm, che è costante se CyPet-(pre-SUMO1)-YPet viene digerito o meno. <ol start="6"><li> Dopo digestione SENP1, il restante FRET emissione (FL &#39;FRET) è: </li></ol><img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq3.jpg" /> dove C è la concentrazione totale di CyPet-(pre-SUMO1)-YPet ed x è la concentrazione di digerito CyPet-(pre-SUMO1)-YPet. <ol start="7"><li> Combinando tutti gli elementi, l&#39;emissione di fluorescenza rilevata a 530 nm in eccitazione di 414 nm (FL &#39;530/414) è: </li></ol><img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq4.jpg" /> 4. FRET saggio basato Proteasi per Enzyme studio cinetico <ol><li> CyPet-(pre-SUMO1)-YPet stato incubato con il dominio catalitico di SENP1 a 37 ° C in un tampone di 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 0,1% (v /v) Tween-20 e DTT 1 mM in un volume totale di 80 ml e trasferita in piastra a 384 pozzetti. </li><li> Piste stati condotti misurando l&#39;emissione di fluorescenza a 475 e 530 nm dopo eccitazione a 414 nm in un lettore di piastra multipozzetto fluorescenza per 5 minuti con intervalli di 15 sec. </li><li> La velocità di reazione (v) è stata correlata con la variazione della quantità di substrato (S), come: </li></ol><img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq5.jpg" /><ol start="4"><li> La concentrazione di prodotto aumentato esponenzialmente da 0 a [S] 0 (concentrazione del substrato originale) quando t = 0: </li></ol><img alt="Equazione 6" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq6.jpg" /><ol start="5"><li> Quando t = 0, la velocità iniziale (V 0) è: </li></ol><img alt="Equazione 7" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq7.jpg" /><ol start="6"><li> Il concentration di SENP1 è stato fissato, e la concentrazione di CyPet-(pre-SUMO1)-YPet stata aumentata da 100 volte superiore alla concentrazione di enzima, che è richiesta da Michaelis-Menten. </li><li> Tutte le letture di fluorescenza sono stati analizzati con il metodo di analisi quantitativa FRET e tracciata in Software GraphPad Prism V per adattarsi alla Michaelis-Menten. La regressione non lineare può essere eseguita anche con l&#39;ausilio di pacchetti software più comuni, come i programmi di fogli di calcolo (ad esempio Microsoft Excel). </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Maturazione di pre-SUMO1 da SENP1 può essere determinata monitorando i cambiamenti nel segnale di fluorescenza a 475 e 530 nm durante il processo. Il risultato ha mostrato che la velocità di pre-SUMO1 digestione SENP1 in un modo dipendente dalla dose-substrato (Figura 4). Questo suggerisce che il dominio catalitico di SENP1 mostra un&#39;attività eccellente per la maturazione di pre-SUMO1. La reazione inizialevelocità zione sono stati calcolati dalla precedente analisi con diverse concentrazioni di substrato (Tabella 1). Il cat / K k rapporto M è generalmente utilizzato per confrontare le efficienze di differenti enzimi con un substrato o un particolare enzima con substrati diversi. K M e V max può essere ottenuta dalla equazione di Michaelis-Menten tracciando le velocità iniziali diverse, corrispondenti per le diverse concentrazioni di CyPet-(pre-SUMO1)-YPet (Figura 5) cat k è stato ottenuto come.: <img alt="Equazione 8" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq8.jpg" /> Secondo l&#39;analisi di cui sopra, il valore calcolato per K M è stato 0,21 ± 0,04 mM, il gatto k era 6,90 ± 0,28 s-1, e il gatto / K M k rapporto era (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 </sup<html> &gt; S -1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig1.jpg" /> Figura 1. Grafico di FRET saggio basato proteasi per SENP pre-Sumos maturazione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig2.jpg" /> Figura 2. L&#39;analisi quantitativa del segnale fluorescente, come contributi del donatore accettore, e FRET. Dissezione di spettri di emissione da CyPet-(pre-SUMO1)-YPet sotto eccitazione a 414 nm. FL CyPet (530/414) è emissione CyPet di a 530 nm in eccitazione di 414 nm, FL FRET è il FRET indotta emissioni YPet a 530 nm in eccitazione di 414 nm, e FL YPet (530/414) è l&#39;emissione YPet di a 530 nm in eccitazione di 414 nm. load/4430/4430fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Calcolo del fattore di emissione α direzione e β. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig4.jpg" /> Figura 4. Analisi quantitativa di CyPet-(pre-SUMO1)-YPet digerito dai rapporti diversi del dominio catalitico di SENP1. Le reazioni sono state monitorate entro i primi 5 min. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig5.jpg" /> Figura 5. Michaelis-Menten analisi grafica di digestione CyPet-(pre-SUMO1)-YPet da parte SENP1. I dati sono stati riportati e analizzati da GraphPad Prism V e la regressione non lineare. <table border="1"><tbody><tr><td> [S] (pM) </td><td> V 0 (pM / s) </td></tr><tr><td> 0,115 </td><td> 0,0023 ± 0,00005 </td></tr&gt; <tr><td> 0,214 </td><td> 0,0028 ± 0,00004 </td></tr><tr><td> 0,407 </td><td> 0,0033 ± 0,00007 </td></tr><tr><td> 0,594 </td><td> 0,0037 ± 0,00013 </td></tr><tr><td> 0,725 </td><td> 0,0043 ± 0,00012 </td></tr><tr><td> 1,471 </td><td> 0,0051 ± 0,00036 </td></tr><tr><td> 1,899 </td><td> 0,0050 ± 0,00031 </td></tr><tr><td> 2,300 </td><td> 0,0050 ± 0,00062 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Iniziale determinazione velocità di maturazione pre-SUMO1 da parte SENP1. In ogni concentrazione del substrato, quattro campioni sono stati utilizzati per misurare la digestione. La deviazione standard è venuto dalle variazioni di questi quattro campioni. <table border="1"><tbody><tr><td> K M (pM) </td><td> k cat (s-1) </td><td> k cat / K M (M -1 • s-1) </td></tr><tr><td> 0,21 ± 0,04 </td><td> 6,90 ± 0,28 </td><td> 3,2 ± 0,55 × 10 7 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Parametri cinetici di maturazione pre-SUMO1 da parte SENP1 da quantitativa FRET analisi. La deviazione standard è venuto dai quattro campioni per ogni concentrazione del substrato.

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<li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+Ubiquitin-related+Modifier+%28SUMO%29-specific+Proteases%3A+PROFILING+THE+SPECIFICITIES+AND+ACTIVITIES+OF+HUMAN+SENPs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).</li>
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<li>Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+profiling+of+human+deSUMOylating+enzymes+%28SENPs%29+with+synthetic+substrates+suggests+an+unexpected+specificity+of+two+newly+characterized+members+of+the+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family.</a> Biochemical Journal. 409, 461(2008).</li>
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<li>Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-resonance-energy-transfer-based+protease+activity+assay+and+its+use+to+monitor+paralog-specific+small+ubiquitin-like+modifier+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing.</a> Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).</li>
<li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

FRET tecnologia è stata usata per studiare la maturazione pre-SUMO1 da parte SENP1 9. CFP-YFP è stato usato come FRET coppia e analisi raziometrico, che è il rapporto tra accettore di emissioni donatori, è stato utilizzato per caratterizzare le proprietà cinetiche. Tuttavia, non vi è alcuna considerazione di donatore e accettore auto-fluorescenza nella raziometrica tradizionale analisi FRET. Il rapporto non è direttamente correlata con la quantità di substrato digerito. Qui riport...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> PCR II TOPO Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K466040 </td></tr><tr><td> 2xYT </td><td> Ricerca Prodotti Internationa.l Corp. </td><td> X15600 </td></tr><tr><td> Ni-NTA Agrose </td><td> Thermo Scientific </td><td> 88222 </td></tr><tr><td> Coomassie più (Bradford) Regent Assay </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23238 </td></tr><tr><td> Piastra a 384 pozzetti (inferiore di vetro) </td><td> Greiner </td><td> 781892 </td></tr><tr><td> FlexStation II 384 lettore di piastre </td><td> Dispositivo molecolare </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitativa fret (förster resonance energy transfer) analisi per la determinazione della proteasi senp1 cinetica

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Reversibili modificazioni post-traduzionali di proteine ​​con proteine ​​ubiquitina o ubiquitina-like (Ubls) sono ampiamente utilizzati per regolare in modo dinamico l&#39;attività della proteina e hanno ruoli diversi in molti processi biologici. Ad esempio, SUMO modifica covalentemente un numero grande o proteine ​​con un ruolo importante in molti processi cellulari, tra cui cellule-regolazione del ciclo, la sopravvivenza cellulare e la morte, danno la risposta del DNA e risposta allo stress 1-5. SENP, come SUMO-specifiche proteasi, funziona come un endopeptidasi nella maturazione dei precursori SUMO o come isopeptidase per rimuovere SUMO dalle sue proteine ​​bersaglio e aggiornare il ciclo sumoilazione 1,3,6,7. L&#39;efficienza catalitica o specificità di un enzima è meglio caratterizzato dal rapporto delle costanti cinetiche, k cat / K M. In diversi studi, i parametri cinetici di SUMO-SENP coppie sono state determinate con vari metodi, tra cui gel di poliacrilammide-based western blot, radIOActive-marcato substrato, composto fluorescente o proteina marcata substrato 8-13. Tuttavia, le poliacrilammide-gel a base di tecniche, che hanno utilizzato i &quot;nativi&quot;, ma le proteine ​​sono laboriosi e tecnicamente impegnativo, che non si prestano ad una dettagliata analisi quantitativa. Il ottenuta k cat / K M da studi usando tetrapeptidi o proteine ​​con ACC (7-ammino-4-carbamoylmetylcoumarin) o AMC (7-ammino-4-metil) fluoroforo erano o fino a due ordini di grandezza inferiore ai substrati naturali o non può chiaramente distinguere le iso-e attività di endopeptidasi SENPs. Saggi della proteasi Recentemente, FRET-based sono stati utilizzati per studiare gli enzimi deubiquitinating (Dubs) o SENPs con il FRET coppia di proteina fluorescente ciano (PCP) e giallo proteina fluorescente (YFP) 9,10,14,15. Il rapporto di emissione dell&#39;accettore di emissione del donatore è stato utilizzato come parametro quantitativo per FRET segnale monitor per proteasi acproduttività determinazione. Tuttavia, questo metodo ignorato segnale contaminazioni crociate al accettore e lunghezze d&#39;onda di emissione del donatore e accettore da donatore auto-fluorescenza e quindi non era accurata. Abbiamo sviluppato un nuovo altamente sensibile e quantitativa FRET saggio basato proteasi per determinare i parametri cinetici di pre-SUMO1 maturazione da SENP1. Un multistrato FRET CyPet coppia e YPet con significativamente migliorato FRET efficienza e resa quantica di fluorescenza, sono stati utilizzati per generare il CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substrato 16. Abbiamo differenziato e quantificato assoluti segnali di fluorescenza fornite dal donatore e accettore FRET e alle lunghezze d&#39;onda di emissione e accettori, rispettivamente. Il valore di k cat / K M è stato ottenuto come (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 s -1 SENP1 verso di pre-SUMO1, che è in accordo con i parametri generali cinetica enzimatica. Pertanto, questo metodo è valido e può essere utilizzato unsa generale approccio per caratterizzare proteasi anche altri.

Un nuovo metodo che utilizza l&#39;analisi quantitativa di FRET (Förster Resonance Energy Transfer) segnali è descritto per lo studio di cinetica enzimatica.<em&gt; K<sub&gt; M</sub</em&gt; E<em&gt; K<sub&gt; Cat</sub</em&gt; Sono stati ottenuti per l&#39;idrolisi del dominio catalitico di SENP1 (SUMO / Sentrin specifica proteasi 1) di controllare la validità SUMO1 (Small ubiquitina-like Modifier). I principi generali della presente quantitativa-FRET-based studio cinetico proteasi può essere applicato ad altre proteasi.

Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) analisi per la determinazione della proteasi SENP1 Cinetica

Le modificazioni post-traduzionali reversibili delle proteine mediante ubiquitina o proteine simil-ubiquitina (Ubl) sono ampiamente utilizzate per regolare dinamicamente le proteine...

Questo video dimostra un nuovo saggio fret in un singolo passaggio per l'analisi quantitativa della cinetica delle proteasi. La strategia generale per il saggio seguente si basa sull'analisi del segnale fret. Qui, la coppia fret, cype e ype, è legata ai terminali N e C del pre sumo uno nel substrato integro e cype e ype sono in prossimità ravvicinata.Quando questa molecola viene eccitata a 414 nanometri, la maggior parte del segnale di emissione si trova a 530 nanometri. Tuttavia, quando viene aggiunta la proteasi SENP1, il substrato viene scisso a livello del residuo Gly-Gly al termine C-terminale di SUMO1, separando così CIPA e WPA. A questo punto, eccitando a 414 nanometri, la maggior parte del segnale di emissione osservato si trova a 475 nanometri.Per valutare la cinetica di questa reazione, le emissioni di fluorescenza vengono misurate ogni 15 secondi per un periodo di cinque minuti. L'analisi dei dati di fluorescenza ottenuti rivela la velocità con cui il substrato cype pre sumo one ype viene digerito dalla proteasi SENP one. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come un saggio basato su massa, un saggio con substrato peptidico fluorescente

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Questo video descrive il trasferimento di energia di risonanza di Förster risolto nel tempo o il saggio TR-FRET per determinare la fosforilazione endogena delle proteine con l'aiuto di fluorofori donatori e accettori marcati su anticorpi specifici per una proteina in esame. Questa tecnica è progettata per misurare la fosforilazione delle proteine in esame nei lisati cellulari.

Trasferimento di energia per risonanza di Forster risolta nel tempo per il monitoraggio della fosforilazione delle proteine nelle cellule

Descriviamo qui un metodo migliorato di trasferimento Luminescence Resonance Energy (lRet) dove introduciamo un sito proteasi scissione tra i siti fluoroforo donatore e accettore. Questa modifica ci permette di ottenere segnali lRet specifici derivanti dalle proteine ​​di membrana di interesse, consentendo lo studio di proteine ​​di membrana, senza purificazione della proteina.

Luminescence Resonance Energy Transfer allo Studio conformazionale Cambiamenti nella membrana proteine ​​espresse in cellule di mammifero

Recentemente sono stati sviluppati numerosi biosensori di forza basati su FRET, che consentono la risoluzione proteina-specifica della forza intracellulare. In questo protocollo, dimostriamo come uno di questi sensori, progettato per il linker della proteina del complesso nucleoscheletro-citoscheletro (LINC) Nesprin-2G, possa essere utilizzato per misurare le forze di actomiosina sul complesso nucleare LINC.

Un protocollo per l&#39;utilizzo di trasferimento di energia per risonanza (FRET) biosensori -force per misurare le forze meccaniche in tutto il complesso LINC nucleare

Qui viene presentato un protocollo per esperimenti FRET ad alta precisione a livello di singola molecola. Inoltre, questa metodologia può essere usata per identificare tre stati conformazionali nel dominio legante del legame del recettore N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinare le distanze precise è il primo passo verso la costruzione di modelli strutturali basati su esperimenti FRET.

FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola

Interazioni proteina-proteina sono critiche per sistemi biologici, e studi di cinetica di legame forniscono intuizioni la dinamica e la funzione dei complessi della proteina. Descriviamo un metodo che quantifica i parametri cinetici di una proteina complessa che utilizza il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza e la tecnica di flusso interrotto.

Utilizzo In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer per studiare la dinamica dei complessi della proteina ad una scala di tempo di millisecondo

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) tra due molecole di fluorofori può essere utilizzato per studiare le interazioni proteiche nella cellula vivente. Qui, viene fornito un protocollo su come misurare la FRET nelle cellule vive rilevando l'emissione sensibilizzata dell'accettore e la tempra della molecola donatrice utilizzando la microscopia a scansione laser confocale.

Valutazione delle interazioni proteiche nelle cellule vive con emissione sensibilizzata alla FRET

Lo studio descrive in dettaglio la metodologia della mappatura FRET, compresa la selezione dei siti di etichettatura, la scelta dei coloranti, l'acquisizione e l'analisi dei dati. Questa metodologia è efficace nel determinare i siti di legame, i cambiamenti conformazionali e i movimenti dinamici nei sistemi proteici ed è più utile se eseguita in combinazione con le informazioni strutturali 3D esistenti.

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: una nuova metodologia per chiarire le caratteristiche strutturali globali

La spettroscopia di retrodiffusione neutronica offre un accesso non distruttivo e privo di etichette alla dinamica ps-ns delle proteine e della loro acqua di idratazione. Il flusso di lavoro è presentato con due studi sulle proteine amiloidi: sulla dinamica tempo-risolta del lisozima durante l'aggregazione e sulla dinamica dell'acqua di idratazione della tau sulla formazione delle fibre.

Spettroscopia neutronica ad alta risoluzione per studiare la dinamica picosecondi-nanosecondi delle proteine e dell'acqua di idratazione

Questo studio presenta un saggio FRET raziometrico semplice e di facile utilizzo per il rilevamento e la valutazione quantitativa dell'attività della DNasi e dimostra la sua applicazione nell'analisi di una nucleasi debole.

Valutazione dell'attività della DNasi mediante trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza raziometrica

Microdisegni adesivo che normalizzano architettura cellulare può essere utilizzato per aumentare la sensibilità nella rilevazione degli effetti dei farmaci, migliorare la riproducibilità e semplificare l'acquisizione automatica delle immagini e analisi. Tale tecnologia andrà a beneficio della droga / siRNA test di screening, eseguite su supporti convenzionali coltura cellulare e quindi soffrono di un eccessivo cellula-cellula variabilità.

Una migliore visualizzazione e analisi quantitativa degli effetti del farmaco utilizzando cellule Micropatterned

Scopri l'analisi quantitativa FRET per la cinetica della proteasi SENP1 utilizzando un saggio a singolo passo in tempo reale. Questo metodo consente di determinare i parametri KM e kcat con alta precisione.

Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) analisi per la determinazione della proteasi SENP1 Cinetica

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