Microgavage di larve Zebrafish

Lo scopo generale di questa procedura è somministrare oralmente materiali nella lume intestinale di larve di zebrafish. Innanzitutto, le larve vengono anestetizzate e posizionate su uno stampo per iniezioni rivestito con metilcellulosa. Successivamente, le larve vengono delicatamente immerse nello stampo e allineate con l'angolo dell'ago da gavaggio e del micromanipolatore.

L'ago viene quindi inserito nella bocca della larva e manovrato fino al bulbo intestinale. Una volta posizionato, il materiale viene rilasciato nella luz. L'ultimo passaggio consiste nell'estrarre la larva dal metilcellulosa e collocarla in un mezzo fresco per favorire il recupero dall'anestesia.

In definitiva, questo metodo può essere utilizzato per consegnare materiali specificamente alla luce intestinale di larve di zebrafish, dove è possibile studiare il trasporto all'interno dell'intestino o nei tessuti extraintestinali. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'immersione in acqua contenente il materiale di interesse, è che la quantità di materiale somministrato all'animale, così come i tempi e il dosaggio, può essere rigorosamente controllata. Ciò riduce la variabilità sperimentale e, in alcuni casi, la tossicità associata a determinati materiali.

L'idea per questo metodo è nata quando abbiamo avuto difficoltà ad applicare certi sonde fluorescenti a livelli sufficientemente elevati da essere rilevabili nell'epitelio intestinale mediante microscopia. Alte concentrazioni a volte uccidono i pesci e comunque non producono un segnale fluorescente sufficientemente intenso per l'acquisizione delle immagini. Per iniziare, tirare diversi aghi da sondino utilizzando un estrattore di micropipette e procurarsi capillari di vetro al quarzo.

Spostarsi su un microscopio stereoscopico per tagliare gli aghi. Innanzitutto, allineare la punta dell'ago con l'estremità di un righello trasparente o di una scala grafica. Una volta allineata, utilizzare pinzette da orologiaio a punta fine per tagliare l'ago a circa un millimetro dalla punta.

Esaminare la punta dell'ago con un ingrandimento di 100 volte. La punta dovrebbe avere un diametro compreso tra 27 e 30 micron ed essere smussata. Si devono evitare aghi appuntiti o seghettati per ottenere risultati più consistenti.

Una microfiamma può essere utilizzata per controllare meglio il punto di taglio dell'ago e per lucidare l'ago a fiamma. Suggerimenti per rimuovere gli spigoli vivi. Successivamente, preparare la soluzione da somministrare per gavaggio.

Per la maggior parte delle applicazioni, viene aggiunto fenolo rosso per facilitare la visualizzazione del microiniettore e il posizionamento della soluzione da somministrare per sondino. Dopo aver riempito con olio minerale, montare l'ago per sondino sull'unità di microiniezione Nano Jet Two. Avvolgere una piastra di Petri in plastica da 10 centimetri con pellicola biologica per ottenere una superficie piana e impermeabile ed eseguire un'aliquote di circa due microlitri della soluzione da somministrare sulla pellicola parafilm.

Il passo successivo consiste nel riempire manualmente l'ago per la gavaggio. Prestare attenzione a non introdurre bolle d'aria nell'olio minerale. Per calibrare il volume di espulsione, iniettare piccole gocce in una piccola piastra di Petri riempita con olio minerale finché non risultano uniformi in dimensione, misurare il diametro delle gocce utilizzando lo strumento grafico e calcolare il volume della goccia.Volume.

La coerenza tra gli aghi viene riportata qui. Prima di utilizzare l'ago per la gavaggio, rimuovere qualsiasi residuo di olio minerale sciacquandolo in un mezzo pulito per pesci zebra. Dopo aver riscaldato lo stampo per aros, coprire tre scanalature con metilcellulosa al 3%. La scanalatura deve essere coperta appena sufficiente per trattenere il pesce, ma non così poco che la metilcellulosa si asciughi rapidamente.

Successivamente, aliquotare circa quattro millilitri di mezzo per zebrafish nelle pozzette di una piastra a sei pozzette e trasferire i larve di zebrafish di ciascun gruppo sperimentale in pozzette separate. Per anestetizzare i pesci, preparare una soluzione di trica tre volte nella quantità appropriata di mezzo per zebrafish. Una volta per pozzetta.

Anestetizzare il pesce mescolando un volume uguale di soluzione trica nel mezzo e agitando delicatamente. Non appena il pesce smette di muoversi, utilizzare una pipetta Pasteur in vetro borg larga per posizionarli uno alla volta sulla metilcellulosa con le teste sull'angolo di 45 gradi della scanalatura e le code rivolte verso l'angolo di 90 gradi della scanalatura. Usare una sonda da dissezione smussata per premere delicatamente ciascuna larva nella metilcellulosa, stabilizzandone la posizione.

Successivamente, regolare il dispositivo di microiniezione nano jet in modo che l'ago sia inclinato con un angolo ridotto. Assicurarsi che l'escursione sia sufficiente a raggiungere il fondo della pozzetta. Per ridurre al minimo la necessità di ulteriori regolazioni, impostare l'unità di microiniezione sulla posizione di iniezione lenta per rilasciare 4,6 nanolitri, utilizzando una mano per effettuare piccole regolazioni della piastra contenente le larve immobilizzate e l'altra per controllare il micromanipolatore dell'unità di microiniezione.

Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà poiché i pesci zebra sono molto piccoli e facilmente danneggiabili. È necessario esercitarsi per identificare la struttura esofagea al microscopio stereoscopico e per determinare la pressione appropriata da applicare all'ago di garbaggio per raggiungere la cavità intestinale. Prima di tutto, manovrare delicatamente l'ago di garbaggio nella bocca di un pesce anestetizzato.

Fare passare l'endoscopio attraverso l'esofago e premere leggermente sullo sfintere esofageo per introdurre la punta appena all'interno della parete intestinale anteriore. Una volta all'interno del bulbo anteriore, somministrare delicatamente il materiale con queste impostazioni. Il volume somministrato dovrebbe riempire appena il bulbo anteriore dell'intestino senza fuoriuscire dall'esofago o dal cloaca.

Ritrarre rapidamente e delicatamente l'ago. Prestare attenzione a non rilasciare quantità significative di materiale nell'esofago. Dopo aver rimosso l'ago di sondaggio, trasferire il pesce in una piastra contenente mezzo fresco.

Rianima le larve dall'anestesia e rimuovi la metilcellulosa lavandole più volte in mezzo fresco. Trasferisci le larve in una piastra di Petri o in una piastra a sei pozzetti fino al momento dell'utilizzo. Per analisi successive, la microsonda gastrica può essere utilizzata per somministrare diversi materiali nel test sulle larve di pesce zebra.

Per iniziare, preparare le soluzioni necessarie per la gavaggio allo scopo di dimostrare questo metodo. Il dextrano di 10 KD coniugato con Texas Red viene utilizzato per analizzare l'integrità della barriera dell'epitelio intestinale.

Seguire i passaggi dimostrati in precedenza per eseguire la gavaggio su gruppi di 10-20 larve di pesce zebra per ciascuna condizione sperimentale. Ripetere l'operazione su gruppi duplicati o triplicati, se possibile. Dopo il gavaggio, recuperare le larve dall'anestesia e lasciarle nuotare liberamente in un mezzo fresco.

Dopo circa 20 minuti, anestetizzare nuovamente le larve come mostrato in precedenza. Una volta anestetizzate, posizionare le larve in metilcellulosa al 3% sopra un blocco di agarosio al 3% e osservare le larve con un microscopio stereoscopico a fluorescenza utilizzando un filtro Texas red, selezionando un'ingrandimento che mostri le larve dal muso fino immediatamente posteriormente alla fine del cloaca. La fluorescenza deve essere intensa nel lume intestinale.

Tuttavia, la funzione di barriera viene valutata in base al livello di dextrano che appare nei tessuti extra-intestinali, regolando l'esposizione per consentire la visualizzazione della fluorescenza del tronco. Anche se ciò sovraesponesse la fluorescenza luminale quando somministrato da solo, il dextrano viene trattenuto all'interno della lucentezza dell'intestino. Tuttavia, nei larvi co-trattati con EDTA, che altera le giunzioni strette epiteliali, il dextrano è visibile in circolo e nei vasi e spazi antisemitici.

In questi esempi, ImageJ è stato utilizzato per quantificare la fluorescenza media relativa in una regione di interesse nel tronco del pesce zebra e normalizzata rispetto a una ROI al di fuori del pesce come controllo interno. Qui, i risultati ottenuti con un ago standard vengono confrontati con quelli ottenuti con un ago micro forgiato. Un numero minore di larve nel gruppo trattato solo con destrosio ha mostrato fluorescenza extraintestinale, suggerendo che gli aghi micro forgiati danneggiano meno frequentemente le larve.

Analizzando più da vicino una regione, il dextrano risulta nuovamente confinato alla luce intestinale senza fuoriuscire nella vascolarizzazione o negli spazi extra-intestinali. In assenza di EDTA, quando viene somministrato insieme all'EDTA, il dextrano è osservato negli spazi extra-intestinali e all'interno della luce dell'aorta dorsale e della vena cardiaca posteriore; il segnale ematico qui presente è dovuto al flusso sanguigno. Durante il tentativo di questa procedura, assicurarsi che l'ago non presenti bordi irregolari, che i pesci siano ben posizionati e stabilizzati nella metilcellulosa, e procedere con attenzione e pazienza nell'imparare a manovrare l'ago attraverso l'esofago della larva.

Questa tecnica può essere utilizzata in un'ampia gamma di applicazioni nel pesce zebra che richiedono l'introduzione controllata o la visualizzazione di materiali all'interno dell'intestino. Permette un rigoroso controllo sui tempi, sulla via e sulla dose di somministrazione all'interno dell'animale, e riduce notevolmente la variabilità all'interno di un esperimento e tra esperimenti diversi.