Name: Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Scopri il metodo di cattura selettiva di 5-hmC dal DNA genomico utilizzando β-glucosyltransferasi e click chemistry con biotina. Questa tecnica indipendente dalla densità consente l'arricchimento efficiente per l'epigenomica ad alto rendimento.

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Questo studio è stato sostenuto in parte dal National Institutes of Health (GM071440 a CH e NS051630/MH076090/MH078972 a PJ).

1. Frammentazione del DNA genomico Frammento di DNA genomico mediante ultrasuoni ad una vasta dimensione desiderata adatto per il genoma a livello di piattaforma di sequenziamento. (Di solito sonicazione a ~ 300 bp.) Verificare la distribuzione dimensionale del DNA genomico frammentato 1% gel (Figura 1). 2. Estrazione del DNA Determinare le quantità di DNA di partenza in base alla abbondanza di 5-HMC nel DNA genomico. Dal 5-HMC livelli variano in modo significativo in diversi tipi di tessuto, quantità di DNA di partenza dipendono dalle 5-HMC livelli dei campioni. Si prega di fare riferimento alla Tabella 1 per gli esempi. 3. β-GT reazione catalizzata (reazione di trasferimento del glucosio) <ol><li> Mescolare pipettando la miscela come descritto in Tabella 2 e incubare a 37 ° C in bagno di acqua per 1 ora. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, pulire la reazione con Kit Rimozione QIAquick Nucleotide, con 10 microgrammi di DNA percolonna. Eluire con 30 microlitri di acqua per colonna e combinare. </li></ol> 4. Biotinilazione Reazione (Click Chemistry) <ol><li> Aggiungere DBCO-SS-PEG3-Biotin coniugato soluzione di lavoro (1 mM) nella soluzione di DNA eluito (punto 3) ad una concentrazione finale di 150 pM (cioè 5 ml di soluzione di lavoro per 30 microlitri soluzione di DNA). </li><li> Mescolare pipettando e incubare a 37 ° C bagno di acqua per 2 ore. </li><li> Pulire la reazione con Kit Rimozione QIAquick Nucleotide. Il volume ideale di eluizione totale è di 100 ul. </li><li> Quantificare la quantità di DNA recuperato mediante spettrofotometro scala microlitro (ad es., NanoDrop). </li></ol> 5. Cattura di 5-HMC contenente DNA <ol><li> Lavare 50 pl di Dynabeads MyOne streptavidina C1 3 volte con 1 ml di 1X B &amp; W tampone secondo le istruzioni del produttore. Separare le perline con un supporto magnetico. </li><li> Aggiungere il volume uguale di 2X B &amp; W per il buffer di recupero D biotinilatoNA (100 ul) ai talloni lavate. </li><li> Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente con lieve rotazione su un rotatore. </li><li> Separare le perline con un supporto magnetico e lavare le microsfere 3 volte con 1 ml di tampone 1X B &amp; W. </li><li> Eluire il DNA incubando le perle in 100 pl di preparati DTT 50 mM per 2 ore a temperatura ambiente con lieve rotazione su un rotatore. </li><li> Separare le perline con un supporto magnetico. Aspirare il eluente e carico su un Micro Bio-Spin 6 Colonna secondo le istruzioni fabbricazione per rimuovere il DTT. Il DNA bersaglio è nella soluzione ora. </li><li> Purificare il DNA eluito dal passaggio precedente Purification Kit Qiagen MinElute PCR e DNA eluire in 10 microlitri di tampone EB. Quantificare DNA utilizzando fluorimetro Qubit, NanoDrop o se la concentrazione è superiore a 20 ng / ul. Il DNA è pronto per la valle genome-wide preparazione sequenziamento biblioteca. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Se la qualità of DNA genomico è alta, i rendimenti tipici di recupero dopo il β-GT e le reazioni sono biotinilazione ~ 60-70%. Tuttavia, l&#39;efficienza di cattura variare significativamente diversi tipi di tessuto a seconda delle 5-HMC livelli dei campioni. Tipicamente, l&#39;efficienza di cattura per il DNA genomico è cervello ~ 4-9%, e in alcuni casi estremi, l&#39;efficienza può arrivare fino al 12%. Per le cellule ES, l&#39;efficienza di cattura medio è ~ 2-4%, in contrasto con ~ 0,5% per le cellule staminali neuronali. Il più basso rendimento visto finora è stato per il DNA genomico da cellule tumorali. Tutto DNA arricchito è pronto per i protocolli della libreria standard di nuova generazione di preparazione. Inoltre, il DNA catturato può anche essere usato come stampo per PCR in tempo reale per rilevare l&#39;arricchimento di alcuni frammenti rispetto al DNA di ingresso, se i primers correlati sono disponibili. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4441/4441fig1.jpg" /> Figura 1. Sonicati umani frammenti di DNA genomico in1% gel. 10 ug di DNA genomico isolato da cellule iPS umane in 120 pl di tampone TE 1X stata sonicata utilizzando un dispositivo di sonicazione (Covaris). Dopo sonicazione, 2 microlitri del DNA sonicato viene caricata su gel di agarosio 1% usando 100 bp di DNA marcatore per confrontare le dimensioni dei frammenti di DNA sonicato. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> Acqua </td><td> _ Pl </td><td></td></tr><tr><td> 10 X β-GT Reaction Buffer </td><td> 2 microlitri </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> Fino a 10 microgrammi di DNA genomico </td><td> _ Pl </td><td> Fino a 500 ng / pl </td></tr><tr><td> UDP-6-N 3-Glc (3 mM) </td><td> 0,67 pl </td><td> 100 pM </td></tr><tr><td> β-GT (40 pM) </td><td> 1 ml </td><td> 2 pM </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 20 pl </td&gt; <td></td></tr></tbody></table> i) Per il DNA genomico del tessuto (alta 5-HMC contenuto&gt; 0,1%) <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> Acqua </td><td> _ Pl </td><td></td></tr><tr><td> 10 X β-GT Reaction Buffer </td><td> 10 pl </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> Fino a 20 microgrammi di DNA genomico </td><td> _ Pl </td><td> Fino a 500 ng / pl </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-Glc (3 mM) </td><td> 1,33 pl </td><td> 100 pM </td></tr><tr><td> β-GT (40 pM) </td><td> 2 microlitri </td><td> 2 pM </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 40 ml </td><td></td></tr></tbody></table> ii) Per il DNA genomico di cellule staminali (mediana 5 HMC contenuti ~ 0,05%) <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> Acqua </td><td> _ Pl </td><td></td></tr><tr><td> 10 X β-GT Reaction Buffer </td><td> 10 pl </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> Fino a 50 microgrammi di DNA genomico </td><td> _ Pl </td><td> Fino a 500 ng / pl </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-Glc (3 mM) </td><td> 3,33 pl </td><td> 100 pM </td></tr><tr><td> β-GT (40 pM) </td><td> 5 microlitri </td><td> 2 pM </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 100 pl </td><td></td></tr></tbody></table> iii) Per il DNA genomico delle cellule del cancro (basso 5-HMC contenuti ~ 0,01%) Tabella 1. Esempi di quantità di DNA di ingresso e di reazioni etichettatura utilizzando i campioni con diversi livelli di 5-HMC secondo il metodo chimico selettivo etichettatura. <table border="1"><tbody><tr><td> Campione </td><td> 5-HMC livello </strong&gt; </td><td> DNA di partenza (mg) </td><td> Il recupero dopo l&#39;etichettatura (ingresso a sfere) (mg) </td><td> Recupero resa </td><td> Pull-down DNA (ng) </td><td> Pull-down cedere </td></tr><tr><td> Del mouse cervelletto adulto </td><td> 0,4% </td><td> 10 </td><td> 7,5 </td><td> 75% </td><td> 236 </td><td> 3,1% </td></tr><tr><td> Postnatale giorno 7 del mouse cervelletto </td><td> 0,1% </td><td> 11 </td><td> 9 </td><td> 82% </td><td> 140 </td><td> 1,6% </td></tr><tr><td> Topo ES cellule E14 </td><td> 0,05% </td><td> 60 </td><td> 42 </td><td> 70% </td><td> 350 </td><td> 0,8% </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Risultati rappresentativi di tessuti cerebrali di topo e cellule ES.

<ol><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. , Suppl 33. 245-254 (2003).</li>
<li>Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion%2C+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466, 1129-1133 (2010).</li>
<li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li>
<li>Ko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li>
<li>Koh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet1+and+tet2+regulate+5-hydroxymethylcytosine+production+and+cell+lineage+specification+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).</li>
<li>Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+the+paternal+genome+upon+fertilization+involves+genome-wide+oxidation+of+5-methylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).</li>
<li>Wossidlo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nat. Commun. 2, 241(2011).</li>
<li>Gu, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Tet3+DNA+dioxygenase+in+epigenetic+reprogramming+by+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes.</a> Nature. 477, 606-610 (2011).</li>
<li>Dawlaty, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet1+is+dispensable+for+maintaining+pluripotency+and+its+loss+is+compatible+with+embryonic+and+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development.</a> Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).</li>
<li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+of+5-hydroxymethylcytosine+in+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing.</a> PLoS One. 5, e8888(2010).</li>
<li>Song, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).</li>
<li>Pastor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473, 394-397 (2011).</li>
<li>Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine%3A+a+new+kid+on+the+epigenetic+block%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block.</a> Mol. Syst. Biol. 7, 562(2011).</li>
<li>Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+enzymatic+quantification+of+5-hydroxymethylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, 181(2010).</li>
<li>Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+recombinant+%CE%B2-glucosyltransferase+and+analysis+of+global+5-hydroxymethylcytosine+in+unique+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes.</a> Biochemistry. , (2012).</li>
<li>Rusmintratip, V., Sowers, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpectedly+high+excision+capacity+for+mispaired+5-hydroxymethyluracil+in+human+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).</li>
<li>Globisch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PLoS One. 5, e15367(2010).</li>
<li>Yildirim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mbd3%2FNURD+Complex+Regulates+Expression+of+5-Hydroxymethylcytosine+Marked+Genes+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 147, 1498-1510 (2011).</li>
<li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+5-hydroxymethylcytosine+into+the+epigenomic+landscape+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells.</a> PLoS Genet. 7, e1002154(2011).</li>
<li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) è un regalo recentemente identificato modificazione epigenetica in quantità notevoli in alcuni tipi di cellule di mammifero. Il metodo qui presentato è per la determinazione del genoma distribuzione a livello di 5-HMC. Usiamo batteriofago T4 β-glucosil trasferire una porzione multistrato glucosio contenente un gruppo azide sul gruppo ossidrile di 5-HMC. Il gruppo azide può essere chimicamente modificato con biotina per il rilevamento, l&#39;arricchimento di affinità, e sequenziamento di 5...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Catalogare # </td><td> Commento </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenti </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio 5M (NaCl) </td><td> Promega </td><td> V4221 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5M pH8.0 Etilendiammintetraacetato (EDTA) </td><td> Promega </td><td> V4231 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Trizma base (Tris) pH7.5 </td><td> Invitrogen </td><td> 15567-027) </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di magnesio (MgCl2) 1M </td><td> Ambion </td><td> AM9530G </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher BioReagents </td><td> BP337-100 </td><td></td></tr><tr><td> DBCO-SS-PEG3-biotina coniugato </td><td> Fare clic su Strumenti Chimica </td><td> A112P3 </td><td></td></tr><tr><td> 1,4-Dithiothreitol, ultrapura (DTT) superpuro </td><td> Invitrogen </td><td> 15508-013 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick Kit Rimozione Nucleotide </td><td> Qiagen </td><td> 28304 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Bio-Spin 6 Colonna </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6222 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne </td><td> Invitrogen </td><td> 650-01 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidina C1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute PCR Purification Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28004 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapura agarosio </td><td> Invitrogen </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> UDP-6-N 3-glucosio </td><td> Motif attivo </td><td> 55013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Enzima </td></tr><tr><td> β-glucosil (β-GT) </td><td> New England Biolab </td><td> M0357 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Sonicazione dispositivo </td><td> Covaris </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Desktop centrifuga </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bagnomaria </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel apparecchi in esecuzione </td><td> Bio-Rad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop1000 </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tubo Shaker </td><td> Barnstead </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tubo Shaker </td><td> Thermolyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Separazione supporto magnetico </td><td> Promega </td><td> Z5342 </td><td></td></tr><tr><td> Qubit 2,0 fluorimetro </td><td> Invitrogen </td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente di installazione 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7,9, 250 mM MgCl2) 2 X Legatura e lavaggio (B &amp; W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0,02% Tween 20) . </td></tr></tbody></table>

cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal dna genomico

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-metilcitosina (5-mC) costituisce ~ 2-8% dei cytosines totali in DNA genomico umano e influisce un&#39;ampia gamma di funzioni biologiche, tra l&#39;espressione genica, il mantenimento dell&#39;integrità genomica, imprinting parentale, inattivazione del cromosoma X, regolazione sviluppo, invecchiamento e cancro 1. Recentemente, la presenza di un ossidato 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), è stato scoperto in cellule di mammifero, in particolare nel staminali embrionali (ES) cellule e cellule neuronali 2-4. 5-HMC è generato per ossidazione di 5-mC catalizzata da TET famiglia ferro (II) / α-chetoglutarato-dipendente diossigenasi 2, 3. 5-HMC si propone di essere coinvolto nel mantenimento di staminali embrionali (MES) delle cellule, emopoiesi normale e le neoplasie, e zigote sviluppo 2, 5-10. Per capire meglio la funzione di 5-HMC, un sistema di sequenziamento affidabile e semplice è essenziale. Sequenziamento bisolfito tradizionale non è possibile distinguere 5-HMC da 5-MC 11 </sup&gt;. Per svelare la biologia di 5-HMC, abbiamo sviluppato un approccio chimico altamente efficiente e selettivo di etichettare e catturare 5-HMC, approfittando di un enzima batteriofago che aggiunge una frazione di glucosio al 5-HMC specifico 12. Qui si descrive una semplice procedura in due fasi per l&#39;etichettatura chimica selettiva di 5-HMC. Nella prima fase di etichettatura, 5-HMC nel DNA genomico viene etichettato con un 6-catalizzata azide-glucosio da β-GT, un glucosiltransferasi dal batteriofago T4, in modo che trasferisce il 6-azide-glucosio al 5-HMC dal modificato cofattore, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). Nella seconda fase, biotinilazione, un linker biotina disolfuro è attaccato al gruppo azide dalla chimica click. Entrambe le fasi sono altamente specifici ed efficienti, portando a completare etichettatura indipendentemente l&#39;abbondanza di 5-HMC in regioni genomiche e dando fondo estremamente bassa. Biotinilazione seguito di 5-HMC, i 5-HMC contenenti frammenti di DNA vengono selettivamente catturatiutilizzando perline streptavidina in una densità modo indipendente. La risultante 5-HMC arricchiti frammenti di DNA potrebbe essere utilizzato per analisi a valle, sequenziamento di prossima generazione. La nostra etichettatura selettiva e il protocollo di acquisizione conferisce elevata sensibilità, applicabile a qualsiasi fonte di DNA genomico con variabili / 5-HMC diverse abbondanze. Anche se lo scopo principale di questo protocollo è la sua applicazione a valle (ad es., Sequenziamento di prossima generazione per tracciare il 5-HMC distribuzione nel genoma), è compatibile con singola molecola, in tempo reale SMRT (DNA) sequenziamento, che è in grado di erogare singola base sequenziamento risoluzione del 5-HMC.

Descritto è un processo a due fasi usando etichettatura β-glucosil (β-GT) per trasferire una azide-glucosio al 5-HMC, seguita dalla chimica click per trasferire un linker biotina per l&#39;arricchimento facile e densità-indipendenti. Questo metodo efficace di etichettatura e specifica consente l&#39;arricchimento di 5-HMC con fondo estremamente basso e high-throughput mappatura epigenomic tramite sequenziamento di prossima generazione.

Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico

La 5-metilcitosina (5-mC) costituisce circa il 2-8% delle citosine totali nel DNA genomico umano e influisce su un'ampia gamma di funzioni biologiche, tra cui l'espressione genica...

L'obiettivo generale di questa procedura è etichettare e isolare la cinque-idrossietil-citosina, una nuova modifica del DNA recentemente scoperta. Innanzitutto frammentare il DNA genomico mediante sonificazione, quindi eseguire una reazione di trasferimento del glucosio beta-glucosidico per trasferire residui di glucosio azidici sui residui di cinque-idrossietil-citosina del DNA utilizzando la chimica Qlik. Aggiungere un legame biotinico solfidico al gruppo azidico per produrre DNA biotinilato. Successivamente, isolare in modo selettivo i frammenti di DNA contenenti cinque-idrossietil-citosina su perle di streptavidina in maniera indipendente dalla densità.I frammenti di DNA purificati arricchiti in cinque idrossietil citidina possono essere utilizzati per analisi successive, inclusa il sequenziamento di nuova generazione. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto agli approcci esistenti, come quelli basati su anticorpi, è che l'acquisizione di idrossietil citosina è indipendente dalla densità di PHY C. Eugene Lee, ricercatore associato senior del laboratorio, illustrerà questo protocollo.Prima di tutto, sottoporre il DNA genomico a sonica per ottenere frammenti di dimensioni adatte alla piattaforma di sequenziamento su scala genomica. Verificare la distribuzione delle dimensioni del DNA genomico frammentato su un gel all'1% di agarosio. A questo punto, determinare le quantità iniziali di DNA in base all'abbondanza di cinque idrossietil citabina nel DNA genomico.Dato che i livelli di idrossietil citabina cinque variano notevolmente tra diversi prelievi di tessuto, la quantità iniziale di DNA dipenderà dal livello di cinque C nei campioni. Si rimanda alla tabella uno del manoscritto per degli esempi. Il primo passaggio del processo di marcatura consiste in una reazione di trasferimento basica per trasferire l'AZA glucosio Es ai residui di cinque C sul DNA genomico frammentato.Combinare i componenti della reazione e mescolare mediante pipetta, quindi incubare la reazione enzimatica in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per un'ora. Far passare la reazione attraverso un kayak quick nucleotide removal kit utilizzando 10 microgrammi di DNA per colonna, eluendo il DNA con 30 microlitri di acqua per colonna e raccogliere i campioni nel secondo passaggio del processo di marcatura.Il legame salifico del linker bing è collegato al gruppo eza mediante chimica click. Per la reazione di biotinilazione, aggiungere cinque microlitri di soluzione lavorativa del coniugato biotinico per ogni 30 microlitri di soluzione di DNA. Incubare in un bagno termico a 37 °C per due ore.Processare la reazione mediante un kayak, un kit rapido di rimozione dei nucleotidi e diluire il DNA in 100 microlitri. Quindi quantificare il DNA recuperato utilizzando NanoDrop. Iniziare con 50 microlitri di microsferette di streptavidina Dyna.Eseguire tre lavaggi seguendo le istruzioni del produttore e raccogliere le perle su un supporto magnetico. Diluire ora il DNA biotinilato con 100 microlitri di buffer BNW 2x e aggiungere il campione alle perle lavate. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente con rotazione delicata.Raccogliere le perle con un supporto magnetico e lavarle tre volte prima di eluire il DNA. Aggiungere 100 microlitri di DTT 50 millimolare appena preparato ed incubare a temperatura ambiente sotto rotazione delicata per due ore. Separare le perle utilizzando un supporto magnetico.Quindi raccogliere la EENT contenente il DNA bersaglio e caricare il campione su una colonna MicroBio Spin Six. Per rimuovere ulteriormente il DTT, purificare il campione su una colonna Cogen ed eluire il DNA in 10 microlitri di tampone EB; quantificare il DNA utilizzando un Qubit, un fluorimetro o un NanoDrop. Se la concentrazione è superiore a 20 nanogrammi per microlitro, questo gel all'1% mostra frammenti di DNA sonicati, isolati da cellule staminali pluripotenti indotte umane.Per applicazioni successive come il sequenziamento di nuova generazione, la dimensione tipica della frammentazione è di circa 300 paia di basi. Si noti che quando la qualità del DNA genomico è elevata, i rendimenti di recupero dopo le reazioni con beta GT e biotina sono dell'ordine del 60-70%. Tuttavia, i rendimenti di arricchimento variano notevolmente a seconda del tipo di tessuto, in base ai livelli di idrossietilcitosina cinque dei campioni. Tipicamente, l'efficienza di cattura per il DNA genomico cerebrale è compresa tra il 4 e il 9%, e in alcuni casi estremi può raggiungere anche il 12%. Per le cellule staminali embrionali (ES), l'efficienza media di cattura è di circa il 2-4%, a differenza dello 0,5% circa per le cellule staminali neuronali, per le quali finora si è osservata la minore efficienza. Il valore più basso di efficienza è stato finora riscontrato per il DNA genomico proveniente da cellule tumorali.Seguendo queste procedure, altri metodi come la tecnica di sequenziamento di nuova generazione potrebbero essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio sulla distribuzione su scala genomica delle cinque modifiche della citosina in metilazione GC.

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