Name: Una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Scopri come misurare l'adattamento olfattivo a lungo termine in C. elegans utilizzando la localizzazione nucleare di GFP::EGL-4 nei neuroni AWC. Questo metodo consente screening genetici rapidi.

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Vorremmo ringraziare Scott Hamilton, ed i membri del laboratorio di O&#39;Halloran per la lettura attenta di questo manoscritto. Ringraziamo anche il nostro anonimo recensore per eccellenti suggerimenti e commenti penetranti.

1. Costruzione di GFP Tagged EGL-4 Animali Esprimere <ol><li> Clonare il traslazionale fusione GFP :: EGL-4 sotto il promotore per l&#39;ODR-3 gene (uso 2678 bp direttamente a monte del codone di inizio): (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4. L&#39;ODR-3 unità promotore espressione nelle coppie neurone amphid: AWA, AWB, AWC e debolmente in ASH. </li><li> Iniettare il plasmide (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4 in di tipo selvatico (N2) gli animali a 50 ng / mL con i co-iniezione utilizzando le normali marcatori della linea germinale tecniche di trasformazione 8: (p) ofm-1: : GFP 9 (25 ng / pl), e (p) ODR-1 :: DsRed 10 (25 ng / pl). L&#39;ODR-1 espressione promotore unità nel AWC e AWB amphid coppie di neuroni, e la-1 ofm espressione promotore unità negli coelomocytes. </li><li> Sottoporre gli animali transgenici che esprimono le matrici extracromosomici descritti al punto 1.2 per la ultravioletti (UV) / trimethylpsoralen (TMP), il protocollo di integrazione11. </li><li> Bleach sincronizzare gli animali 12 e coltivarli in Nematode crescita media (NGM) piastre contenenti OP50 E. coli alla fase L4. Lavare L4 animali in piatti NGM con M9 tampone per rimuovere OP50 E. coli batteri. </li><li> Rimuovere tampone M9 e aggiungere 50-100 ml di 30 mg / ml soluzione TMP lavoro sul verme pellet nel tubo 1,5 ml microcentrifuga. Avvolgere la provetta 1,5 ml in un foglio di bloccare la luce ambiente, e agitare delicatamente su un mixer per 15 minuti nella pellicola protettiva provetta 1,5 ml microcentrifuga. Trasferire i vermi nel TMP / worm soluzione ad un grande piatto NGM testa di serie. </li><li> Esporre i vermi sulla piastra NGM ai raggi UV 350 μJ (X100) utilizzando un Stratalinker 2400. Quindi aggiungere i vermi ad una piastra contenente OP50 NGM e incubare al buio per 5 ore. </li><li> Scegli 50 vermi transgenici a circa 10 piastre di teste di serie (2-5 vermi ogni piastra). Trasferimento P0 è a piatti nuovi ogni 24 ore per 3 giorni. </li><li> Scegli 250 F1 clonale unnimals (1 animale per piastra). Clone out 2-4 animali F2 da F1 ogni piatto. Controllare animali F3 per cercare una linea di trasmissione 100% cercando in (p) ofm-1 :: pattern di espressione GFP sotto un microscopio da dissezione fluorescente. </li><li> Outcross la riga finale integrato (s) con gli animali di tipo selvatico N2 5 volte. Si farà riferimento alla linea finale integrato di pyIs500, e la GFP-tagged EGL-4 molecola come GFP :: EGL-4. </li></ol> 2. La coltivazione e la manutenzione degli animali da saggi traslocazione nucleare <ol><li> Coltivate le pyIs500 animali a 25 ° C su piastre standard di 10 centimetri NGM (vedi sotto per ricetta) seminato con OP50 E. coli 13 (Figura 1). </li><li> Il giorno 1, scegliere 4-5 L4 pyIs500 animali da piastre coltivate a 25 ° C su cinque distinti 10 centimetri OP50 E. coli seminato piastre e incubare a 25 ° C (cioè, L4 4-5 animali per piastra). </li><li> Il giorno 4, lavare adulto populations di pyIs500 animali al largo delle piastre NGM di grandi dimensioni utilizzando S-basale del buffer (vedi sotto per ricetta). Utilizzare pipette in vetro usa e getta per trasferire gli animali, in quanto si attaccano al lato della puntali in plastica. </li></ol> 3. A lungo termine indotta Odore saggi traslocazione nucleare <ol><li> Lavare le pyIs500 animali 3 volte in S-basale per rimuovere i batteri. Non centrifugare animali tra un lavaggio, ma piuttosto permettere agli animali di stabilirsi per gravità in un fermo 1,5 ml microcentrifuga tubo. E &#39;fondamentale per garantire tutti i batteri viene rimosso, e che i paté NGM sono esenti da contaminazione, i batteri residui influenzerà negativamente l&#39;esito del test traslocazione. Inoltre, abbiamo trovato che la sterilizzazione in autoclave le provette da 1,5 ml microcentrifuga produce una proprietà &quot;appiccicoso&quot; sulle pareti interne del tubo che causa gli animali di aderire alle pareti, ed utilizzare quindi non autoclave provette da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Mentre gli animali si stanno stabilendo tra un lavaggio, portare tegli adattamento soluzione. Aggiungere 100 ml di S-basale buffer su un cilindro graduato da 100 ml laurea. Aggiungi adattamento odore della S-basale e sigillare il cilindro con una striscia di parafilm. Se si esegue l&#39;adattamento benzaldeide aggiungere 7,5 ml di benzaldeide a 100 ml di S-Basal, per l&#39;adattamento butanone aggiungere 11 ml di 2-butaone a 100 ml di S-Basal. Capovolgere delicatamente (non agitare) il cilindro laurea contenente S-basali e l&#39;odore 30 volte per creare una emulsione uniforme. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio in S-basale, permettere agli animali di risolvere e rimuovere tutto il liquido. Etichettare una provetta &quot;+ ve&quot; o &quot;adattare&quot; e l&#39;altro tubo &quot;-ve&quot; o &quot;unadapt&quot;. Poi aggiungere 1 ml della miscela di adattamento alla provetta adattamento (+ ve), e aggiungere 1 ml di S-basale al tubo disadattato microcentrifuga di comando (-ve). Cercate di mantenere il numero di animali tra 100 e 200 in ciascun tubo. Con una certa pratica, è possibile stimare il numero approssimativo di animali in un pellet ad occhio. </li><li> Inserire un 1,5 ml microcentrifuga tubo tappo di protezionead ogni provetta (impedisce coperchi da aperto popping) e posizionare i tubi su un rotatore per 80 min. Abbiamo trovato che l&#39;esposizione odore tra 60 min e 80 min produce risultati simili (sia risultato a lungo termine risposte di adattamento). Tuttavia, l&#39;80 minuti di esposizione offre risultati più coerenti nelle nostre mani. Quindi tutti i nostri saggi a lungo termine di adattamento sono standardizzati utilizzando un odore di esposizione 80 min (Figura 2). </li><li> Dopo 80 minuti, lavare gli animali 3 volte in S-basale. Consentire agli animali di risolvere per gravità tra ogni lavaggio. </li></ol> 4. A breve termine Odore indotte saggi traslocazione nucleare <ol><li> In caso di breve termine dell&#39;adattamento odore, utilizzare lo stesso protocollo per lungo termine saggi traslocazione odore indotte (Fasi 3,1-3,4), ma invece di incubazione delle pyIs500 animali nell&#39;adattare odori per 80 min, utilizzare una esposizione 30 min . La quantificazione di odore indotte saggi traslocazione nucleare descritta di seguito (Passaggio 5) è lo stesso per lungo e breve term esposizioni. </li></ol> 5. Segnare l&#39;Odore indotto degli eventi nucleari Traslocazione <ol><li> Fai 2% pastiglie agarosio contenenti 5 mM sodio azide (NaN 3) sciogliendo elettroforesi su gel di agarosio in dH 2 0. Mettere una goccia di agarosio fuso contenente NaN 3 su un vetrino per microscopio. Porre immediatamente un altro vetrino da microscopio di vetro sulla prima diapositiva per appiattire la goccia di agarosio fuso. Lasciare agire per 30 secondi, e poi delicatamente prendere in giro a parte la vetrini lasciando un vetrino da microscopio con un tampone piatto agarosio di circa 1 mm. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio in S-basale, permettere ai vermi di stabilirsi nel tubo 1,5 ml microcentrifuga e rimuovere tutto il liquido. Quindi aggiungere gli animali goccia a goccia sui pad agarosio di vetrini da microscopio diversi. E &#39;importante mantenere il numero di animali per ogni diapositiva a tra 50 e 100. Troppi animali per vetrino si complicano punteggio e spesso creano un bagliore spargendo dopo blu-luce di eccitazione. Liquido in eccesso puòessere cattivi dai pad agarosio con un piccolo Kim-wipe. Collocare un bicchiere 0,5 millimetri copertura antiscivolo sul tampone e lasciare riposare per 2 min per consentire l&#39;NaN 3 per immobilizzare gli animali. Nota, gli animali possono essere recuperato presso le diapositive dopo aver segnato. Gli animali si riprenderà dal 3 NaN anestetico dopo ~ 1 ora in caso di cessione di una piastra NGM seminato in una goccia di tampone M9. </li><li> A questo punto è indispensabile che ogni sperimentatore elaborare una chiave per tenere traccia che scorrono è sperimentale (+ ve) diapositiva e che scorrono è il controllo (-ve) slitta, e passare le diapositive ad un&#39;altra persona che ciecamente segnerà il GFP: EGL-4 modello di localizzazione. Ciò permette di controllare per ogni pregiudizio sperimentatore. </li><li> Punteggio compreso tra 50 e 100 capi per vetrino utilizzando un microscopio a fluorescenza in posizione verticale con gli obiettivi di ingrandimento 10X, 40X e 63X e GFP / RFP filtri. In primo luogo, individuare gli animali a 10 ingrandimenti con campo chiaro illuminazione. In secondo luogo, individuare il neurone AWC spegnendo il bright-campo di illuminazione e utilizzando il filtro RFP. I (p) ODR-1 :: unità DsRed espressione in AWB e neuroni AWC. I neuroni hanno AWC distintivi corpi cellulari di forma ovale rispetto AWB corpi cellulari che sono più piccoli e di forma circolare (Figura 2). </li><li> Una volta che il corpo cellulare AWC è stato localizzato, passare al filtro GFP e registrare la localizzazione di GFP: EGL-4 come nucleare o citoplasmatico. Utilizzando un contatore permette di mantenere lo sperimentatore guardare nell&#39;oculare mentre segnando la diapositiva. Nota: 5,1-5,5 passaggi vengono ripetuti almeno 3 volte in giorni diversi per ottenere dati statisticamente significativi (figure 1-2). </li></ol> 6. Il monitoraggio GFP-tagged EGL-4 durante il recupero da lungo termine adattamento Odore <ol><li> Passo dopo 3,5, dividere le popolazioni di animali pyIs500 in aliquote multiple e punteggio per GFP nucleare rispetto citoplasmatica :: EGL-4 nel AWC punto al tempo zero (cioè, dopo 80 minuti di esposizione) ed multiple punti temporali successivi (Figura 3). </li><li> Trasferire sia il controllo (-ve) e sperimentali (+ ve) animali con pipette in vetro usa e getta su piastre NGM. </li><li> Consentire agli animali di recuperare per varie lunghezze di tempo e di riesaminare la localizzazione di GFP :: EGL-4in AWC ad ogni tempo, come nei passaggi 5,1-5,5. </li></ol> 7. Materiale Piastre NGM: Per 1 L aggiungere a 1 L DDH 2 0: 21 g Bacto-agar, 3 g Cloruro di sodio (NaCl), 2,5 g Bacto-peptone. Autoclave Media. Dopo la sterilizzazione in autoclave, raffreddare l&#39;agar fino a quando la temperatura indica 54 ° C. Aggiungere le seguenti soluzioni: 25 ml 1M tampone fosfato di potassio, 1 ml 1 M di solfato di magnesio (MgSO4), 1 ml 1 M di cloruro di calcio (CaCl 2); 1 colesterolo ml in etanolo (5 mg / ml di brodo). 1 M bibasico K 2 HPO 4 174,2 g / mol: Per 500 ml: In 400 ml DDH 2 O, sciogliere 87,1 g Dibasic K 2 HPO 4. Regolare il volume a 500 L con DDH 2 O. Filtrare sterilizzare con un 500 ml Unità di filtro sterile. 1 M monobasico di KH 2 PO 4 136,1 g / mol: Per 1 L: In 800 ml DDH 2 O, sciogliere 136,1 g monobasico di KH 2 PO 4. Regolare il volume a 1 L con DDH 2 O. Filtrare sterilizzare con un 500 ml Unità di filtro sterile. 1 M fosfato di potassio (K 3 PO 4) pH 6.0: Per 1 L: In una unità 1 L filtro sterile, aggiungere 868 ml di 1 M monobasico di KH 2 PO 4. Permettere all&#39;unità di filtrare, poi aggiungere 132 ml di 1 M bibasico K 2 HPO 4. Permettere all&#39;unità di filtrare tutto il liquido. Rimuovere l&#39;unità di filtro e aggiustare il pH a 6,0. Conservare a temperatura ambiente. S-basale: Per 1 L: aggiungere 50 ml 1M K 3 PO 4 tampone, pH ~ 6.0, e 20 ml di NaCl 5M aq. Riempire a 1 L conDDH 2 O. Autoclave soluzione. M9: Per 1 L: 3 g KH 2 PO 4, 6 g di Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O. Riempire a 1 L con DDH 2 0. Sterilizzare in autoclave.

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<li>Pittenger, C., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+general+mechanisms+for+long-lasting+plasticity%3A+Aplysia+and+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757(2003).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;odore indotta ingresso nucleare di GFP-tagged EGL-4 molecola qui descritta fornisce una lettura solida molecolare di adattamento olfattivo in C. elegans. L&#39;odore indotte saggi traslocazione nucleare sono semplici e richiedono solo pochi giorni di tempo di preparazione. Il pyIs500 animale che abbiamo costruito per questi test, esprime un marcatore che illumina il neurone AWC oltre ad esprimere la GFP-tagged EGL-4 proteine. Pertanto, riteniamo che uno sperimentatore con poca o nessuna esperienz...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> Difco </td><td> DF0140-07-4 </td><td> NGM piastre </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Fisher Chemical </td><td> S671-10 </td><td> NGM piastre </td></tr><tr><td> Bacto Peptone </td><td> Difco </td><td> DF0118-07-2 </td><td> NGM piastre </td></tr><tr><td> Fosfato di potassio bibasico </td><td> Fisher Chemical </td><td> S375-500 </td><td> S-Basal buffer e piastre NGM </td></tr><tr><td> Potassio fosfato monobasico </td><td> Fisher Chemical </td><td> P285-500 </td><td> S-Basal buffer e piastre NGM </td></tr><tr><td> Kimwipes - Piccolo </td><td> Kimberly-Clark </td><td> LS2770 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo 100% </td><td> Gold Shield chimicaCo. </td><td> 43196-115 </td><td> odori diluizione per saggi di chemiotassi </td></tr><tr><td> Cloruro di calcio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C8106-500G </td><td> NGM piastre </td></tr><tr><td> Magnesio solfato </td><td> MP Biomedicals </td><td> 150136-500G </td><td> NGM piastre </td></tr><tr><td> Sodio azide 99% </td><td> Fisher Scientific </td><td> ICN10289180 </td><td> Anestetico </td></tr><tr><td> Agarosio - ultrapura </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td><td> Agarosio pastiglie </td></tr><tr><td> Benzaldeide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1334-100G </td><td> Odore AWC </td></tr><tr><td> Butanone, ACS grado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 360473-500ML </td><td> Odore AWC </td></tr><tr><td> Tubi - microcentrifuga 1,5 ml colorati </td><td> Denville </td><td> LS8147 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettare Pasteur monouso in vetro 5-3/4 &quot; </td><td> Fisher Scientific </td&gt; <td> 13-678-20B </td><td></td></tr><tr><td> Stratalinker </td><td> Stratagene </td><td> Stratalinker 2400 </td><td> Integrazione UV </td></tr><tr><td> Filtrare sotto vuoto bottiglia - 500 ml </td><td> Nalgene </td><td> 09-740-25B </td><td></td></tr></tbody></table>

una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel<em&gt; c. elegans</em

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Durante la stimolazione prolungata più neuroni sensoriali si adatterà la loro risposta diminuendo la loro sensibilità al segnale. La risposta di adattamento aiuta attenzione la forma e protegge anche le cellule provenienti da oltre-stimolazione. Adattamento nel circuito olfattivo di C. elegans è stato descritto da Colbert e Bargmann 1,2. Qui, gli autori hanno definito i parametri del paradigma adattamento olfattivo, che hanno usato per la progettazione di uno screening genetico di isolare mutanti difettosi nella loro capacità di adattarsi agli odori volatili rilevati dalle Amphid cellule alari di tipo C (AWC) neuroni sensoriali. Quando tipo selvatico C. elegans animali sono esposti a un interessante AWC-sentito odore 3 per 30 minuti che si adatterà la rispondenza alle l&#39;odore e quindi ignorare l&#39;odore adattando in un saggio di chemiotassi comportamentale per ~ 1 ora. Quando tipo selvatico C. elegans animali sono esposti a un interessante AWC-sentito odore di ~ 1 ora saranno quindi ignorare l&#39;odore di adattare di achemotaxis test comportamentali per circa 3 ore. Queste due fasi di adattamento olfattivo in C. elegans sono stati descritti come breve termine l&#39;adattamento olfattivo (indotta dopo 30 minuti di esposizione odore), ea lungo termine adattamento olfattivo (indotto dopo 60 minuti di esposizione odore). Più tardi lavorare da L&#39;Etoile et al., 4 scoperto una proteina chinasi G (PKG) chiamato EGL-4 che è necessario sia per l&#39;adattamento a breve e lungo termine nei neuroni olfattivo AWC. Il-4 EGL proteina contiene una sequenza di localizzazione nucleare che è necessario a lungo termine risposte di adattamento olfattive, ma non indispensabili per il breve termine, le risposte di adattamento olfattivo nel AWC 4. Taggando EGL-4 con una proteina fluorescente verde, è stato possibile visualizzare la localizzazione di EGL-4 nel AWC durante l&#39;esposizione prolungata odore. L&#39;utilizzo di questo completamente funzionale GFP-tagged EGL-4 (GFP :: EGL-4) molecola siamo stati in grado di sviluppare una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel AWC 5. Utilizzando questo mlettura olecular di adattamento olfattivo siamo stati in grado di eseguire entrambi gli schermi in avanti e all&#39;indietro genetici per identificare gli animali mutanti che presentano i modelli difettosi localizzazione subcellulare di GFP :: EGL-4 nel AWC 6,7. Qui si descrive: 1) la costruzione di GFP :: EGL-4 animali che esprimono, 2) il protocollo per la coltivazione di animali a lungo termine saggi traslocazione odore indotta nucleari, e 3) il punteggio di lungo termine odore indotta traslocazione evento nucleare e il recupero (ri-sensibilizzazione) dal nucleare GFP :: EGL-4 Stato.

Un esempio del modello di localizzazione GFP :: EGL-4in l&#39;AWC prima e dopo esposizione prolungata odore è mostrato in Figura 2. Prima dell&#39;esposizione prolungata odore, GFP :: EGL-4 è localizzato al citosol della AWC (Figura 2B), e dopo 80 minuti di esposizione GFP odore :: EGL-4 è localizzata nel nucleo della AWC (Figura 2D). A livello comportamentale, gli animali con citosolica GFP :: EGL-4 in AWC sono attratti da una sorgente puntiforme di odore (Figu...

Qui descriviamo una lettura molecolare di lungo termine dell&#39;adattamento olfattivo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. La proteina chinasi G, EGL-4, è necessario per le risposte di adattamento stabili nella coppia primaria neurone sensoriale chiamato AWC. Durante prolungati odore di esposizione EGL-4 trasloca dal citosol al nucleo della AWC.

Una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel<em&gt; C. elegans</em

Durante una stimolazione prolungata, la maggior parte dei neuroni sensoriali adatterà la propria risposta diminuendo la sensibilità al segnale. La risposta di adattamento aiuta...

L'obiettivo generale di questo video è descrivere lo sviluppo e l'implementazione di un indicatore molecolare dell'adattamento olfattivo a lungo termine in *C. elegans* che descrive lo stato di adattamento di un animale. Questo risultato si ottiene etichettando una chinasi delle proteine di tipo G, chiamata EGL-4, con una molecola di proteina fluorescente verde ed esprimendo questa fusione proteica nelle cellule del tipo amfi ala C, o neuronio AWC. Come secondo passaggio, animali che esprimono la forma marcativa con GFP di EGL-4 nei neuroni AWC vengono coltivati su piastre di terreno di crescita per nematodi contenenti la fonte alimentare batterica OP50. Successivamente, dopo quattro giorni, una popolazione di animali viene lavata via dalle piastre di coltura ed esposta a un odore percepito dal neurone AWC per 80 minuti, al fine di indurre un adattamento olfattivo a lungo termine.I risultati mostrano una localizzazione nucleare della proteina GFP marcata con egg L quattro nelle AWC di animali adattati, contrapposta a una localizzazione citoplasmatica della GFP marcata con ALE quattro negli animali di controllo non adattati. Creando una copia funzionale dei campi ALE quattro, le due proteine fluorescenti verdi consentono di tracciare la localizzazione subcellulare di ACO quattro nelle AWC e di descrivere lo stato comportamentale dell'animale in base alla localizzazione della GFP. Questo strumento molecolare ci permette di indagare rapidamente il ruolo di diversi mutanti o trattamenti nella modulazione dell'output cellulare dopo una stimolazione neuronale prolungata.Questo Protocollo inizia con la costruzione di animali esprimenti uova L4 marcate con GFP, come descritto nella procedura scritta allegata a questo video. La linea integrata finale è indicata come IS500 e la molecola di egg L4 marcata con GFP come GFP::egg L4. Coltivare gli animali IS500 a 25 gradi Celsius su piastre standard NGM da 10 centimetri, seminate con batteri OP50 di E. coli. Al primo giorno, selezionare quattro o cinque animali IS500 allo stadio larvale L4 da piastre coltivate a 25 gradi Celsius e trasferirli su piastre da 10 centimetri seminate con OP50 di E. coli, utilizzando un filo di platino di piccole dimensioni, detto "pick", per raccogliere e trasferire gli animali.Ripetere questa procedura per altri quattro piatti. Incubare i piatti a 25 gradi Celsius al quarto giorno. Lavare le popolazioni adulte di 500 IS animali dai piatti NGM di grandi dimensioni aggiungendo sul piatto un tampone basale e agitando delicatamente.Questo stacca gli animali dalla superficie della piastra e li fa passare nella soluzione tampone. Utilizzando pipette di vetro monouso, aspirare gli animali dalla piastra e trasferirli in un tubo einor da 1,5 millilitri. Iniziare i saggi di traslocazione lavando 500 animali in s basil per rimuovere i batteri; non centrifugare.Animali tra un lavaggio e l'altro. Lasciare invece che gli animali si depositino per gravità in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri fermo. È fondamentale assicurarsi che tutti i batteri vengano rimossi e che le piastre NGM siano prive di contaminazioni, poiché i batteri residui influirebbero negativamente sull'esito del saggio di traslocazione.Ripetere il lavaggio con basilico due volte. Preparare la soluzione di adattamento aggiungendo 100 millilitri di tampone S basilico a un cilindro graduato da 100 millilitri. Se si esegue l'adattamento con aldeide, aggiungere 7,5 microlitri di aldeide a 100 millilitri di sigillo ESP basilico chiudendo il cilindro con una striscia di param.Rovesciare delicatamente il cilindro graduato contenente il basilico e l'odore 30 volte. Per creare un'emulsione uniforme, aggiungere animali in ogni provetta cercando di mantenere il numero di animali compreso tra 100 e 200 in ciascuna provetta. Con un po' di pratica, è possibile stimare ad occhio il numero approssimativo di animali in una palato dopo che gli animali si sono depositati.Dopo aver lavato la S basil, rimuovere tutto il liquido dal tubo epi orph; etichettare un nuovo tubo come positivo e l'altro nuovo tubo come negativo. Quindi aggiungere un millilitro della miscela di adattamento nel tubo microcentrifugo positivo e aggiungere un millilitro di S basil nel tubo microcentrifugo di controllo negativo non adattato. Applicare un protettore per cappuccio da 1,5 millilitri su ciascun tubo e posizionare i tubi su un rotatore per 80 minuti.Dopo 80 minuti, lavare gli animali tre volte in S basil, lasciando che gli animali si sedimentino per gravità tra ogni lavaggio. Preparare delle pastiglie di aros al 2% contenenti azide di sodio 5 millimolare sciogliendo l'aros per elettroforesi su gel. In acqua distillata, posizionare una singola goccia di mol e aros contenente azide di sodio su un vetrino da microscopio; immediatamente, apporre un secondo vetrino sul primo per appiattire la goccia di aros fuso.Lasciare per 30 secondi, quindi separare delicatamente i vetrini, lasciandone uno con un cuscinetto di aros piatto di circa un millimetro. A questo punto, è fondamentale che ogni sperimentatore crei una chiave per identificare quali vetrini corrispondono all'esperimento positivo e quali al controllo negativo. Dopo che i vermi si sono depositati dall'ultimo lavaggio in basil, rimuovere tutto il liquido, quindi aggiungere gli animali goccia a goccia sui cuscinetti di aros di diversi vetrini.È importante mantenere il numero di animali per vetrino tra 50 e 100. Un numero eccessivo di animali per vetrino complicherà il conteggio e spesso produrrà una diffusa emissione luminosa. Dopo l'eccitazione con luce blu, il liquido in eccesso può essere assorbito dal tampone aros utilizzando un piccolo fazzoletto di carta assorbente.Posizionare un coprioggetto in vetro da 0,5 millimetri sul tampone e lasciare riposare per due minuti, in modo che l'azoturo di sodio immobilizzi gli animali. Successivamente, consegnare i vetrini a un'altra persona che valuterà in cieco il pattern di localizzazione della GFP nell'uovo L4. Questo permetterà di controllare eventuali bias sperimentali, analizzando tra 50 e 100 animali per vetrino, mediante un microscopio fluorescente eretto dotato di obiettivi con ingrandimenti 10x, 40x e 63x e filtri G-F-P-R-F-P.Per prima cosa, localizzare gli animali con un ingrandimento di 10x utilizzando l'illuminazione in campo chiaro. In secondo luogo, localizzare il neurone AWC spegnendo l'illuminazione in campo chiaro e utilizzando il filtro RFP. Il promotore odore.Un DS rosso attiva l'espressione in un WB e nei neuroni A WC. I neuroni A WC presentano corpi cellulari di forma ovale distintiva rispetto ai corpi cellulari WB, che sono più piccoli e di forma circolare. Una volta localizzato il corpo cellulare del neurone A WC, passare al filtro GFP e registrare la localizzazione di GFP egg L quattro come nucleare o citoplasmatica.L'utilizzo di un contatore permette al sperimentatore di continuare a guardare nel microscopio mentre registra i risultati sul vetrino. Questo processo viene ripetuto almeno tre volte in giorni diversi per ottenere dati statisticamente significativi. Un esempio del modello di localizzazione della GFP uovo L quattro nell'A WC prima e dopo un'esposizione prolungata all'odore è mostrato prima dell'esposizione prolungata all'odore.GFP uovo L quattro è localizzato nel citosol dell'A WC dopo 80 minuti di esposizione all'odore. GFP uovo quattro è localizzato nel nucleo dell'A WC a livello comportamentale. Gli animali con GFP uovo quattro citosolico in un WC sono attratti da una sorgente puntuale di odore.Questo grafico è stato generato a partire da risultati rappresentativi di saggi di chemiotassi effettuati su animali non adattati. Si noti che l'indice di CHEMOTASSI è prossimo a uno. Gli animali che mostrano G-F-P-E-L quattro nucleare nelle A WC non sono attratti da una sorgente puntiforme dell'odore adattante.Questo grafico è stato generato a partire da risultati rappresentativi di saggi di CHEMOTASSI effettuati su animali adottati. Si noti che l'indice di CHEMOTASSI è prossimo allo zero. Quando la forma L4 dell'uovo entra nel nucleo dei neuroni AWC, induce cambiamenti stabili e duraturi nella fisiologia dei neuroni AWC che persistono anche quando la forma L4 dell'uovo non è più presente nel nucleo.Dopo 80 minuti di esposizione all'odore, gli animali ignoreranno una sorgente puntiforme dell'odore adattante, e questa adattamento persisterà anche dopo 120 minuti di recupero. Dopo 80 minuti di esposizione all'odore. GFP Egle four è osservato nel nucleo dell'A WC. Questa entrata nucleare NU è sia necessaria che sufficiente per indurre un adattamento a lungo termine nell'A WC. Dopo 120 minuti di recupero, questi animali non mostrano più GFP Eagle four nel nucleo, ma continueranno comunque a ignorare una sorgente puntiforme dell'aldeide odorante adattante a livello comportamentale, escludendo i tempi di coltivazione.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in poche ore se viene effettuata correttamente.

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