Espianti blastomero al test per l'Impegno cellulare Fate durante lo sviluppo embrionale

Il metodo mostrato in questo video utilizza le mappe del destino dell'embrione opus in fase di scissione per identificare la coltura di un singolo blaser in isolamento per valutare se il solfato embrionale è determinato da istruzioni intrinseche o estrinseche, vengono raccolti i primi due embrioni cellulari in cui il primo solco di scissione divide in due l'area leggermente pigmentata dell'emisfero animale. Questi embrioni vengono coltivati quando gli embrioni raggiungono da 16 a 32 cellule, la membrana del vitel viene quindi rimossa e le cellule vicine vengono sezionate lontano dalla cellula scelta. Ad esempio, il blaster sezionato viene quindi trasferito in una depressione in una coltura rivestita di coclea, ben coltivato.

Una volta che l'explan raggiunge lo stadio desiderato, viene raccolto per valutare l'espressione genica o proteica utilizzando l'ibridazione in situ QPCR o l'immunoistochimica. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altre, come la coltura di grandi gruppi di cellule embrionali o organi al login, è che i singoli blasfemi embrionali il cui destino di sviluppo è noto da studi di tracciamento del lignaggio possono essere coltivati senza l'aggiunta di fattori di crescita o la presenza di cellule vicine. Così, si può verificare direttamente se i fattori intrinseci alla cellula istruiscono quella bestemmia a diventare il precursore di un tessuto specifico o se richiede segnali dalle cellule circostanti.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la dissezione dei Blair e il loro trasferimento nei pozzetti di coltura richiedono delicate manipolazioni al microscopio stereoscopico. In questo video, utilizzerò questo metodo per dimostrare se gli mRNA di derivazione materna influenzano le cellule verso un destino neurale Lavorando al microscopio da dissezione. Affilare quattro serie di pinze utilizzando la pellicola abrasiva Illumina.

Un paio di pinze funge da backup nel caso in cui una punta venga danneggiata durante la procedura, autoclavare tutte e quattro le pinze e conservarle in un contenitore sterile, fare 500 millilitri ciascuno di 0,1 x e 1,0 x di soluzione salina barth modificata o MBS e sterilizzarli con filtro. Conservare queste soluzioni a una temperatura compresa tra 14 e 18 gradi Celsius per mesi in un flacone di vetro con tappo a vite, preparare aros di grado elettroforesi al 2% in 100 millilitri di coltura X. Autoclave media per sciogliere l'aros a microonde, per liquefare l'aros quando è necessario la prossima volta mentre l'aros è liquido.

Versare circa 0,5 millilitri sul fondo di ciascun pozzetto di una piastra di coltura sterile a 24 pozzetti. In questo modo si eviterà che le protesi si attacchino alla plastica. Quindi versare circa due o tre millilitri sul fondo di piastre di Petri da due a 360 millimetri e agitare delicatamente per distribuire.

Questi serviranno come piastre di dissezione e l'aros impedisce agli embrioni di attaccarsi alla plastica. Una volta rimosse le membrane, quando l'aros si è raffreddato e ha indurito la fiamma, la punta di una pipetta da pascolo da sei pollici fino a quando non si scioglie in una palla. Riformulare brevemente la palla, quindi toccarla leggermente sulla superficie dell'aros in un pozzetto della piastra di coltura.

Questo creerà una depressione poco profonda in cui verrà collocata la X explan. Ripetere per ogni pozzetto della piastra. Quindi, riempire ogni pozzetto della piastra di coltura con un millilitro di un terreno di coltura sterile.

Quindi riempire il piatto di dissezione con 0,1 XMBS per facilitare la separazione del blaster. Una volta preparate le piastre di dissezione, trasferire le uova fecondate con i rivestimenti di gelatina rimossi in piastre di Petri da 100 millimetri contenenti 0,5 x terreno di coltura. Quelli che non vengono utilizzati immediatamente possono essere coltivati a 14 gradi Celsius, mentre il primo piatto viene esaminato per due embrioni cellulari.

Esamina gli embrioni nella prima capsula di Petri utilizzando un microscopio da dissezione utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, trasferisci circa 101 cellule e due embrioni cellulari in una piastra separata riempita con coltura 0,5 x. Medio. Metti la capsula di Petri in un'incubatrice a 14 gradi Celsius. La capacità di questo test di valutare con precisione il potenziale di sviluppo di una cellula si basa sull'analisi della corretta blasfemia basata sulle mappe del destino.

Pertanto, è fondamentale scegliere embrioni con il corretto modello di pigmentazione allo stadio di due cellule che di conseguenza si conformi ai normali schemi di scissione. Come illustrato qui. Le scissioni regolari spesso si verificano solo su un lato dell'embrione.

Questi embrioni possono ancora essere utilizzati come donatori se la cellula del donatore proviene dal lato regolare. Quando gli embrioni raggiungono lo stadio di due cellule, ordinate quelli in cui il primo solco di scissione divide in due l'area leggermente pigmentata nell'emisfero animale in un piatto separato, ordinate circa cinque volte il numero di embrioni che verranno sezionati. Questi saranno i donatori per l'explan.

Conserva i restanti due embrioni cellulari in un piatto separato accanto agli embrioni del donatore durante la procedura per fungere da controlli tra fratelli per mettere in scena la spiegazione. Dopo che gli embrioni sono stati ordinati e sezionati, torna alle piastre nell'incubatrice per trovare altri embrioni di una cellula e due cellule. Poiché gli embrioni di una cellula impiegano circa 90 minuti per dividersi, questo può essere fatto fino a due ore dopo il prelievo degli ovuli.

Per preparare l'explan, posizionare da cinque a 10 embrioni in una capsula di dissezione. Quindi posizionare il primo embrione in modo che la membrana vitel trasparente possa essere afferrata con una pinza. Di solito non può essere visto, ma può essere afferrato al palo dell'animale dove è separato da un chiaro spazio perale sopra la superficie dell'embrione.

Usando una pinza affilata in una mano, afferrare a una certa distanza dal blaster che deve essere sezionato per evitare di danneggiarlo. Quindi, con una pinza affilata, nell'altra mano, afferrare la membrana vicino alla punta dell'altra pinza e tirare delicatamente in direzioni opposte per staccare la membrana. L'embrione si appiattirà quando la membrana sarà stata rimossa.

Quindi, afferra una cellula vicina con il forcipe e usa questa cella come maniglia in modo che la cellula da sezionare non venga toccata direttamente con il forcipe nell'altra mano, tira delicatamente le cellule vicine rimanenti lontano dal bestemmia desiderata. Se vengono prese di mira le cellule della linea mediana che condividono lo stesso destino, possono essere rimosse insieme in coppia. Infine, sezionare la cella del manico.

Raccogli la coppia di bestemmia o amere con un bicchiere sterile oltre la pipetta, evitando bolle d'aria e aspirazione eccessiva. Posizionare la punta della pipetta per pascoli sotto la superficie del terreno di coltura in un pozzetto della piastra di coltura X explan ed espellere delicatamente il blaster. Dovrebbe scivolare nella depressione poco profonda per gravità.

I blasfemi di più di un embrione possono essere combinati in un unico explan, depositandoli nella stessa depressione in una coltura. Ripeti bene questa procedura con gli embrioni rimanenti nella capsula di dissezione uno per uno. Dopo circa 10 embrioni, la capsula di dissezione verrà riempita con detriti cellulari.

Quando ciò si verifica, passare al piatto di dissezione successivo. Dopo che tutte le dissezioni sono state eseguite, controllare se le explan si trovano nelle depressioni poco profonde. In caso contrario, possono essere spinti delicatamente nella depressione con un anello di capelli che è stato sterilizzato in etanolo al 70% e incubare impianti essiccati all'aria a temperatura ambiente sul banco circa un'ora dopo l'ultima dissezione.

Rimuovere i detriti che circondano l'explan guarito con una pipetta sterile per pascolo in vetro. La piastra di explan a 14-20 gradi Celsius accanto alla capsula di Petri contenente gli embrioni di controllo fratelli. Gli embrioni dei fratelli indicheranno lo stadio di sviluppo della blasfemia explan.

Dopo circa una o due ore di coltura, i blastomeri espiantati si saranno divisi circa quattro volte e si saranno staccati dalla maggior parte dei detriti rimasti dalle cellule vicine danneggiate. Dopo 20 ore, formano piccole e robuste palle di cellule. Quando i fratelli raggiungono lo stadio di sviluppo desiderato, raccogli l'explan.

Queste explan sopravvivono abbastanza bene, anche se alcune delle cellule si disintegrano. Pertanto, se c'è una massa nuvolosa nella cultura, esplorala bene con un anello di capelli o una pinza per determinare se all'interno è sepolto un explan sano. Prelevare l'explan in un piccolo volume di soluzione di coltura con un bicchiere oltre la pipetta ed espellerlo delicatamente in un fissativo o in un tampone di lisi appropriato per il test da condurre.

Due blasfemi dorsali o due blasfemi ventrali sono stati sezionati allo stadio di 16 cellule e coltivati in un XMBS a 14 gradi Celsius fino a quando gli embrioni fratelli hanno raggiunto gli stadi precoci della placca neurale. Ogni campione è stato analizzato per l'espressione di una placca neurale zigotica. Gene Sox due mediante ibridazione in situ, che è visto come il prodotto della reazione blu.

I risultati di questo test dimostrano che la maggior parte dei bestemmiatori di animali dorsali, che sono precursori della placca neurale, possono esprimere SOX due in modo autonomo. Questo senza ulteriori segnali da altre regioni dell'embrione. Quelle che non esprimono SOX 2 potrebbero essere state identificate in modo errato al momento della dissezione.

Al contrario, nessuno degli animali bestemmiatori ventrali, che sono precursori dell'epidermide ventrale, esprime SOX due. Questi dati indicano che i bestemmiatori animali dorsali hanno una capacità intrinseca di formare tessuto neurale, mentre i bestemmiatori animali ventrali non notano. Alcune delle piante dorsali hanno anche allungato una morfologia indicativa della formazione del mesoderma dorsale.

Questi blastomeri sono anche sbiaditi per formare il Noor nell'embrione intatto e una coltura explan esprime una proteina marcatore Noor per testare l'effetto dell'alterazione dei livelli endogeni di un gene neurale espresso materno. Cinque mRNA di Fox D sono stati iniettati nei blasfemi precursori ventrali di otto cellule. Come mostrato qui, la maggior parte degli impianti ventrali esprimeva SOX due.

Al contrario, quando il livello endogeno di Fox D 5 è stato ridotto mediante iniezione di oligonucleotidi antisenso nei blaster precursori dorsali a otto cellule, solo pochi explan dorsali esprimevano SOX due. Questi esperimenti indicano che l'espressione materna di Fox D 5 gioca un ruolo nella capacità intrinseca dei blasfemi dorsali di acquisire un destino neurale Prima di questa procedura. Altri metodi, come l'iniezione nei Blair per essere sezionati, possono essere eseguiti mRNA per il guadagno di funzione o oligonucleotidi morfo antisenso per la perdita di funzione.

Ad esempio, quali geni sono coinvolti nella capacità intrinseca delle cellule di dare origine a uno specifico destino di sviluppo? Inoltre, è possibile testare i fattori di segnalazione noti aggiungendo fattori purificati al terreno di coltura. Questo approccio può essere utilizzato anche per trapiantare singoli blasfemi in nuove posizioni nell'embrione intatto.

Questa informazione è fondamentale per definire i meccanismi cellulari attraverso i quali una cellula embrionale pluripotente si impegna a diventare il precursore di un tessuto definito.