Name: Registrazioni simultanee a cellule di fotorecettori e dei neuroni di secondo ordine in un anfibio Retinal Fetta Preparazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Scopri la preparazione di fette retiniche in salamandra tigre acquatica per registrare simultaneamente fotorecettori e neuroni di secondo ordine. Questo metodo elettrofisiologico preserva le connessioni sinaptiche intatte per studiare le interazioni cellulari nella retina.

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Questo lavoro è stato finanziato da Research per prevenire la cecità e la National Institutes of Health di sovvenzione EY10542.

1. Fette Retinal Preparazione <ol><li> Montare la camera (disegno illustrato nella figura 1). Posto due perle di grasso per vuoto, distanziati ~ 8-10 mm di distanza, attraverso la camera di registrazione per formare un canale per superfusate e in cui incorporare le fette retina. Aggiungere un secondo cordone di grasso di pochi millimetri più lontano al di là di ciascuna di queste due perle di grasso a fare da argine e limite di spillover. Mettere un piccolo pezzo triangolare di KimWipe alla fine della camera di fluido per assicurare il contatto con l&#39;elettrodo di riferimento. </li><li> Premere un pezzo di membrana di nitrocellulosa (~ 5 x 10 mm; pori 0,8 micron) piatto contro il microscopio vetrino in due piccole perle di grasso per vuoto. Evitare di mettere grasso direttamente sotto il centro della membrana di nitrocellulosa, come questo può impedire la retina di aderire. </li><li> Per preparare l&#39;affettatrice tessuto, rompere una doppia lama di rasoio bordo in 4 parti e allegare uno al braccio di taglio. Tagliate una fetta sottile di nitrocellulose membrana per assicurare che il bordo tagliente della lama di rasoio adagiata contro la camera di registrazione e consente di ridurre netto la membrana di nitrocellulosa. </li><li> Tenere un piccolo bicchiere di soluzione salina anfibio (Tabella 1) sul ghiaccio presso la stazione di dissezione. </li><li> Euthanize salamandra per decapitazione. Hemisect la testa sagitally e midollo attraverso il midollo spinale. Posizionare la metà della testa su un pezzo di cotone imbevuto di soluzione salina anfibio in cima a un blocco di linoleum. L&#39;altra metà della testa può essere avvolta con un tovagliolo di carta umida e conservato a 4 ° C per uso nel corso della giornata. </li><li> Enucleare l&#39;occhio. Utilizzando piccoli Vännäs forbici, tagliare la pelle che collega l&#39;occhio al orbita circostante. Previa separazione della parte anteriore dell&#39;occhio dal tessuto circostante orbitale, tirare l&#39;occhio avanti e far scorrere le forbici sotto l&#39;occhio per tagliare i muscoli oculari e nervo ottico, liberando l&#39;occhio dall&#39;orbita. </li><li> Posizionare l&#39;occhio enucleato su un letto di cotone sullablocco di linoleum. Gettare la mezza testa. Tagliare l&#39;eccesso di grasso orbitale dal posteriore dell&#39;occhio. </li><li> Fare una piccola incisione nel centro della cornea con una lama chirurgica tagliente. Rimuovere la cornea facendo scorrere Vännäs sottili forbici nell&#39;incisione e l&#39;estensione del taglio radialmente verso di serrata. Tagliare tutto attorno alla serrata ruotando il blocco di linoleum o il cotone tra i tagli. </li><li> Dopo il taglio tutto intorno all&#39;occhio, rimuovere la cornea e la lente estraendole dal lato dell&#39;oculare. Spostare il paraocchi risultante su una superficie dura del blocco linoleum inumidito con soluzione fisiologica anfibio. Tagliarlo a terzi con una lama di rasoio affilato, con un movimento di taglio sottile per assicurare che avete tagliato tutto il percorso attraverso la sclera. </li><li> Inserire uno o due pezzi di conchiglia oculare sulla membrana di nitrocellulosa con la superficie retinica rivolta verso il basso. Immergere i pezzi rimanenti con ulteriore soluzione salina e metterli in frigorifero a 4 ° C. ~ </li><li> Gepremere grado di valorizzare il pezzo di conchiglia oculare contro la membrana di nitrocellulosa con una pinza sottile. Immergere la membrana di nitrocellulosa e pezzo oculare con alcune gocce di soluzione salina fredda anfibi e macchia ai bordi con KimWipe per aiutare la retina di aderire. Ancora una volta, immergere il paraocchi e membrana di nitrocellulosa con alcune gocce di soluzione salina anfibio freddo e staccarsi la sclera / coroide / pigmentato retinico per isolare la retina (che può apparire rosa per la presenza di greggi rodopsina). Se necessario, tagliare il nervo ottico per liberare la retina. </li><li> Se la retina non abbia aderito strettamente, defluire la soluzione salina con un KimWipe per tirare la retina più saldamente giù sulla membrana di nitrocellulosa. Sostituire la soluzione salina. Ripetere, se necessario. </li><li> Riempire la camera con soluzione fisiologica fredda anfibio e trasferirlo alla fase della affettatrice tessuto. Affettare la retina e membrana di nitrocellulosa in strisce sottili, lavorando da un&#39;estremità all&#39;altra ruotando il micrometro nonioin 125 incrementi micron. Premere la lama di un rasoio delicatamente ma con fermezza attraverso la retina e la membrana di nitrocellulosa. </li><li> Trasferire le fettine di retina spostando strisce di membrana di nitrocellulosa al canale principale della camera di registrazione. Sollevare una striscia di membrana libera e poi tenerlo in posizione mentre si muove la camera di sotto di esso, avendo cura di tenere le fette sommersi. Incorporare i bordi della membrana di nitrocellulosa nelle strisce di grasso per vuoto, ruotando di 90 gradi per visualizzare gli strati retinici. </li><li> Premere la membrana di nitrocellulosa piatta contro la superficie di vetro. Anche se non c&#39;è retina su ogni pezzo, posto strisce di membrana di nitrocellulosa a intervalli regolari (~ 1 mm fra) lungo l&#39;intera lunghezza del canale di perfusione per contribuire a spezzare la tensione superficiale e migliorare il flusso di fluido. </li></ol> 2. Registrazioni Whole-cell accoppiati <ol><li> Dopo che tutte le fette sono stati trasferiti, spostare la camera di registrazione alla fase di un montante, fissomicroscopio palco e attaccare l&#39;elettrodo di riferimento di piombo. Focus sulle fette utilizzando una distanza lunga lavorazione, immersione in acqua, 40-60X obiettivo. Il microscopio deve essere posto su una tavola di aria per smorzare le vibrazioni e racchiuso in una gabbia di Faraday per ridurre le interferenze elettriche. </li><li> Superfuse le fette continuo ad una velocità di 1 ml / min con soluzione fisiologica anfibio gorgogliare 100% O 2. Collegare l&#39;aspirazione, facendo in modo che l&#39;afflusso e deflusso sono bilanciati. Deflusso può essere regolata ruotando l&#39;estremità smussata dell&#39;ago di aspirazione o spostando il KimWipe alla fine della camera più vicino o più lontano dall&#39;ago deflusso. Il preparato può essere conservato a temperatura ambiente o raffreddata con un dispositivo di Peltier o semplicemente impostando un pacco di ghiaccio sul palco microscopio. </li><li> Esaminare le fette con luce debole o infrarossi e identificare una coppia di celle - un fotorecettore (asta o cono) e la vicina cella orizzontale o bipolare - a bersaglio per la registrazione a cellula intera. Aste possono essere identified dai loro grandi corpi cellulari e ad asta segmenti esterni di rilievo (Figura 2A). I coni sono più piccolo di aste e avere piccoli segmenti esterni conici. Bipolare cellulare e somas cellule orizzontali sono nella fila più esterna di corpi cellulari nello strato nucleare interno (INL; Figure 2B e 2C). </li><li> Prima di preparare le fette, usare un estrattore pipetta per la fabbricazione micropipette di vetro borosilicato (1,2 diametro esterno mm, da 0,95 mm di diametro interno, con un filamento di vetro). La punta di ogni micropipetta dovrebbe essere ~ 1-2 micron di diametro. </li><li> Utilizzando un ago di riempimento non metallico (ad esempio, un prodotto con una siringa da 1 cc o una Microfil), riempire pipette con la soluzione intracellulare (Tabella 1) e fissare al supporto dell&#39;elettrodo. </li><li> Elevare leggermente l&#39;obiettivo microscopio. Posizionare la pipetta fotorecettore sotto l&#39;obiettivo e poi abbassarlo modo che la punta è posizionata appena sopra le fette. Ripetere con tegli seconda pipetta. </li><li> Regolare lo scostamento del livello corrente di base dell&#39;amplificatore. Controllare la resistenza pipetta con un 5-10 mV impulso depolarizzante. Usiamo tipicamente pipette che vanno dal 10-15 MW, il risultato della lunga conicità dell&#39;albero e bassa osmolarità delle soluzioni anfibi pipetta. Con le soluzioni di mammiferi superiori osmolarità, queste stesse pipette presentano valori di resistenza di ~ 8-12 MW. Mentre abbiamo utilizzato diametri punta più grandi, con valori di resistenza di 3-4 MW in soluzioni di anfibi, i vantaggi forniti da una resistenza di accesso più basso sono compensati da una maggiore difficoltà di tenuta sulle membrane cellulari e una più rapida carrellata delle correnti di calcio e di altri secondo messaggero risposte e minuscole. </li><li> Applicando una pressione leggera, posizione positiva la pipetta post-sinaptica in modo che viene a contatto con il corpo cellulare orizzontale o bipolare. Poi posizionare la pipetta presinaptica in modo che viene a contatto con il corpo cellulare di un fotorecettore asta o cono. Registrazioni APPEar di essere più stabile quando puntali contattare il segmento interno piuttosto che il soma, soprattutto in coni. </li><li> Se il controllo della resistenza, rilasciare la pressione positiva sulla pipetta postsinaptico. Talvolta, il rilascio di pressione positiva è sufficiente a formare un sigillo gigaohm. Se non, applicare aspirazione delicata con una siringa da 1 ml o per bocca. Dopo la resistenza di punta è cresciuta fino a&gt; 100 MW, applicare un potenziale di -60 mV tenuta. Dopo aver ottenuto un sigillo gigaohm, null eventuali transienti di capacità pipetta e ripetere la procedura di tenuta per il fotorecettore pipetta, applicando un potenziale di -70 mV tenuta. </li><li> Rupture la patch utilizzando la bocca o una siringa per applicare l&#39;aspirazione a ciascuna cella, a sua volta. Rods, coni, e le cellule bipolari volontà tipicamente rottura con aspirazione delicata. Ottenimento cellula intera configurazione con una cella orizzontale può richiedere un maggiore aspirazione (cioè con una siringa da 3 cc) in combinazione con forti impulsi di tensione veloci annesse &quot;zapping&quot; feature dell&#39;amplificatore patch clamp. Rottura della membrana e la creazione di cellula intera configurazione sarà evidente dalla comparsa di transienti di capacità di cellule intere. </li><li> Confermare l&#39;identità della cellula post-sinaptica fisiologicamente applicando una luce flash e fornire una serie di gradini di tensione da -120 a +40 mV a incrementi di 20 mV (figure 3 e 4). </li><li> Per valutare se la coppia di cellule sono sinapticamente collegato, fornire una breve (25-100 ms), 60 mV passo depolarizzazione del fotorecettore (a -10 mV, vicino al picco del L-tipo corrente di calcio voltaggio-dipendenti) e guardare per correnti post-sinaptici della neurone secondo ordine (Figura 5). Un forte passo depolarizzante deve evocare una veloce, transitoria verso l&#39;interno corrente post-sinaptica nel post-sinaptica orizzontale o OFF cellula bipolare causato da una raffica di rilascio delle vescicole dal cono (Figura 5). </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La preparazione fetta retina è dimostrato molto utile per analizzare la circuiteria e meccanismi impiegati dalla retina per elaborare informazioni visive. La possibilità di ottenere registrazioni integrali cellulari contemporaneamente da neuroni pre-e post-sinaptica è stata particolarmente utile in questo sforzo. Accoppiati registrazioni integrali delle cellule sono molto più facili da realizzare con fette che con le preparazioni retina piana di montaggio, perché i diversi strati della retina sono esposti. Inoltre, a causa delle loro grandi neuroni della retina, salamandre hanno una lunga storia come preparazione della retina e quindi forniscono un modello di sistema particolarmente ben caratterizzati. Con la pratica, fette sani di salamandra retina possono essere preparati regolarmente. A pochi passi chiave possono fare la differenza tra successo e fallimento. 1) Assicurarsi che la lama di un rasoio è montato sul affettatrice tessuto in modo che adagiata contro la superficie del vetro e fette pulito anche se sia il tessuto e underlying membrana di nitrocellulosa. Se hai fatto un taglio netto attraverso la membrana di nitrocellulosa, si dovrebbe sentire un lieve scatto come la lama di un rasoio colpisce la superficie del vetrino. 2) Assicurarsi che la retina ha aderito alla membrana di nitrocellulosa. Altrimenti, la retina può galleggiare lontano dalla membrana durante qualsiasi fase delle procedure. 3) Non esporre le fette tagliate per aria, per non danneggiare molte delle cellule superficiali. 4) Verificare che le fette e la membrana di nitrocellulosa piatte contro il vetrino in modo che gli strati della retina sono evidenti sotto il microscopio da dissezione. 5) Bilanciare i tassi di afflusso e deflusso superfusate al fine di evitare di eccedere la camera di registrazione. Questo impedisce improvvisi cambiamenti nei livelli di soluzione, che possono causare movimenti bruschi tissutali. 6) Selezionare una coppia sana di cellule vicine l&#39;una all&#39;altra. Le cellule con citoplasma lisci sono più sani di cellule con citoplasma granuloso. Le cellule più profonde nella fetta hanno più probabilità di conservare intatto sinaptica concontatti. 7) Assicurarsi che la punta della pipetta non si è rotto o sfiorato altro tessuto o detriti sulla strada giù per le cellule. 8) Controllare la resistenza pipetta per assicurare che non sia ostruito da detriti o una bolla, entrambi i quali possono rendere difficile ottenere una registrazione cellula intera qualità. Invece di fissare la retina di carta da filtro di nitrocellulosa, alcuni ricercatori incorporare retine in un blocco di agar e utilizzano un vibratome per tagliare fette retiniche. Anche se non abbiamo provato questo approccio, Kim et al. Dell&#39;11 discutere i vantaggi di entrambi gli approcci. Nella loro esperienza, l&#39;approccio di agar-based offre una resa più coerente di fette piane con strati retinici ben delineati, ma l&#39;approccio del filtro di carta a base di rendimenti fotorecettori sane. Coni e bastoncelli sono responsabili della trasduzione luce in variazioni di potenziale di membrana. Con le registrazioni appaiate il potenziale di membrana di aste o coni può essere MANIPULAted direttamente e quindi la capacità di generare risposte leggeri, mentre utile per identificare i tipi di cellule, non può essere essenziale. Abbiamo quindi spesso prepariamo fettine in luce bianca. Tuttavia, anche se preparato sotto illuminazione brillante, salamandra neuroni retinici possono generare grandi risposte leggeri come illustrato dalle risposte in fig. 3. Ciò è dovuto in parte relativamente grande serbatoio di cromoforo nella grande volume segmento esterno ma può anche riflettere la capacità delle cellule di rigenerare Müller 11-cis-retinale per coni 12. Per ottenere risposte completamente chiari scuri adatti, si possono preparare le fettine sotto illuminazione a infrarossi. Per dissezioni sotto la luce a infrarossi, attribuiamo GenIII immagine intensificatori (Nitemate NAV3, Litton Industries, Tempe, AZ) per gli oculari del microscopio da dissezione e illuminare il tessuto con una torcia LED a infrarossi. Per accorciare e altre procedure che non sono condotte sotto il microscopio da dissezione, ci avvaliamo di un ima da testage intensificatore. Per il posizionamento delle pipette di patch, visualizziamo le fette con una telecamera CCD a raggi infrarossi sensibile (ad es Watec 502H, Watec Inc., Middletown, NY) montato sul montante, microscopio fisso stadi. Con queste precauzioni, si possono ottenere risposte asta espositrici sensibilità singola fotone 6, 13. Una limitazione di lavorare in fette retina è che lunghi processi cellulari di grande campo neuroni retinici possono perdere molti dei loro dendriti durante la procedura di affettatura. Fettine retina sono quindi più utili per studiare la fisiologia delle cellule in cui i contatti sinaptici coinvolgono processi vicino al corpo cellulare. Retine di anfibi e mammiferi condividono molti degli stessi tipi cellulari e utilizzano meccanismi fisiologici simili 14-16. Mentre salamandra retina è un buon modello per molti aspetti della retina dei mammiferi, una differenza importante sembra essere la presenza di un percorso dedicato asta nei mammiferi che involves contatti specializzati rod cellule bipolari sul IAI amacrine 14. Un&#39;ulteriore limitazione della retina salamandra è il piccolo numero di strumenti genetici sviluppati appositamente per questa specie. Tuttavia, gli anticorpi e reagenti shRNA che colpiscono regioni ben conservate in altre specie possono essere utilizzati con successo in salamandra, come tante piccole molecole inibitrici e reagenti peptidici. Inoltre, con alcune modifiche nella tecnica, le fette della retina possono essere preparati da altre specie, in cui alcuni di questi strumenti sono più facilmente disponibili. Oltre la sua utilità per la registrazione a cellula intera accoppiato, la retina preparazione fetta salamandra è anche soggetto a una varietà di altri approcci. Come discusso sopra, le fette retina possono essere utilizzati per studiare le risposte di luce in combinazione con diversi protocolli di voltage clamp 17. Neuroni della retina possono essere caricati anche con coloranti fluorescenti sensibili al Ca 2 +, Cl - o Na+ Introdotta attraverso la pipetta di patch o con vasca-applicazione 15,18-20. Un peptide fluorescente che si lega al nastro sinaptica 21 può essere introdotto attraverso la pipetta di patch e utilizzata per l&#39;imaging del nastro 10 o, se coniugato a fluoresceina, per acutamente e selettivamente danneggiare il nastro 22. Abbiamo anche utilizzato le fette della retina in combinazione con punti quantici di monitorare i movimenti dei singoli canali del calcio in asta e cono terminali sinaptici 23. Così, la fetta retinica verticale è un preparato sperimentale versatile per studiare i meccanismi sinaptici di base e le funzioni di trattamento uniche eseguite alla prima sinapsi in via di segnalazione visiva.

<table><tbody><tr><td>Affettatrice per tessuti</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td></td></tr><tr><td>Lamette da barba a doppio taglio</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Membrane in nitrocellulosa</td><td>Millipore</td><td>AAWP02500</td><td>Tipo AAWP Pori da 0,8 mm</td></tr><tr><td>Pipette in vetro borosilicato World</td><td>Precision Instruments</td><td>TW120F-4</td><td>1,2 mm OD 0,95 mm ID</td></tr><tr><td>Ag/AgCl pellet</td><td>Warner</td><td>E206</td><td></td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>calibro 34 ago di riempimento, lunghezza 67 mm</td></tr></tbody></table>

registrazioni simultanee a cellule di fotorecettori e dei neuroni di secondo ordine in un anfibio retinal fetta preparazione

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Uno dei compiti centrali nella retina neuroscienze è capire la circuiteria di neuroni retinici e come tali connessioni sono responsabili per sagomare i segnali trasmessi al cervello. I fotoni sono rilevati nella retina da coni e bastoncelli fotorecettori, che convertono l&#39;energia in un segnale elettrico, la trasmissione ad altri neuroni della retina, dove viene trasformato e comunicato agli obiettivi centrali del cervello attraverso il nervo ottico. Importanti prime intuizioni circuiteria retinica e l&#39;elaborazione visiva provenivano dagli studi istologici di 1,2 Cajal e, più tardi, da registrazioni elettrofisiologiche dell&#39;attività chiodare delle cellule gangliari della retina - le cellule della retina 3,4 uscita. Una comprensione dettagliata dell&#39;elaborazione visiva nella retina richiede una comprensione della segnalazione ad ogni passo nella via da fotorecettore alle cellule gangliari retiniche. Tuttavia, molti tipi di cellule retiniche sono buried profondità nel tessuto e quindi relativamente inaccessibile per registrazione elettrofisiologica. Questa limitazione può essere superata lavorando con fette verticali, in cui cellule che risiedono all&#39;interno di ciascuno degli strati retinici sono chiaramente visibili ed accessibili per la registrazione elettrofisiologica. Qui, descriviamo un metodo per rendere le sezioni verticali di retine da larvale salamandre tigre (Ambystoma tigrinum). Mentre questa preparazione è stato originariamente sviluppato per le registrazioni con microelettrodi taglienti 5,6, si descrive un metodo per la doppia tensione registrazioni clamp whole-cell da fotorecettori e cellule orizzontali e bipolari di secondo ordine in cui manipoliamo potenziale di membrana del fotorecettore e contemporaneamente registrazione post- risposte sinaptiche nelle cellule orizzontali o bipolare. I fotorecettori della salamandra tigre sono considerevolmente più grandi di quelli delle specie di mammiferi, rendendo questa una preparazione ideale in cui intraprendere til suo approccio sperimentale tecnicamente impegnativo. Questi esperimenti sono descritti con un occhio verso sondare le proprietà di segnalazione del nastro sinaptica - una struttura sinaptica specializzata trovato in una solo una manciata di neuroni, tra coni e bastoncelli fotorecettori, che è adatto per il mantenimento di un alto tasso di tonico rilascio di neurotrasmettitori 7 , 8 - e come esso contribuisce alle proprietà uniche di segnalazione di questa prima sinapsi retina.

Tracce rappresentativi di risposte luce da neuroni in fettine verticali di retina salamandra sono mostrati in Figura 3. Il cono, cellula orizzontale e OFF cellule bipolari tutti mostrano una corrente verso l&#39;esterno in risposta alla comparsa della luce. Il prominente corrente verso l&#39;interno seguendo la luce del flash nelle registrazioni delle cellule orizzontali e bipolare è causato dalla maggiore rilascio di glutammato da fotorecettori come depolarizzano all&#39;offset luce. L&#39;ON cellula bipolare risponde con una corrente interna all&#39;esordio luce derivante da un metabotropici segno invertente glutammato recettore cascata di segnalazione e l&#39;attivazione di canali TRPM1 9. Cellule orizzontali e cellule bipolari possono essere distinti l&#39;uno dall&#39;altro dalla loro relazioni IV (Figura 4). Cellule orizzontali in genere hanno una resistenza di ingresso lineare o interiormente rettificazione IV e bassa (&lt;500 MW; Figura 4A), mentre le cellule bipolari hanno una elevata resistenza di ingresso(0,5-2 GΩ) e verso l&#39;esterno-rettifica I - V (Figura 4B) La Figura 5 mostra i risultati rappresentativi di registrazioni di una coppia di celle di cono orizzontale (Figura 5A) e cono-OFF coppia cellule bipolari (Figura 5B).. In ciascuna, depolarizzante il cono a -10 mV da un potenziale di -70 mV possesso evocato una corrente nel cono e veloce EPSC verso l&#39;interno nella cella orizzontale o bipolare calcio voltaggio-dipendenti. Questa forte stimolo è sufficiente per svuotare la piscina facilmente riapribile di ~ 20 vescicole da ciascun nastro sinaptica, causando una EPSC di ~ 47 pA / nastro 10. L&#39;EPSC cella orizzontale in figura 5A era 232 pA, suggerendo che essa ha ricevuto 5 contatti a nastro dal cono presinaptica. Una stima simile dal 178 pA EPSC nella cellula bipolare off (Figura 5B) suggerisce che essa ha ricevuto 4 contatti a nastro dal cono presinaptica. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; Anfibio salina </td><td> Pipetta presinaptica </td><td> Pipetta postsinaptica </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 116 mm </td><td> 3,5 mm </td><td> 3,5 mm </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mm </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1.8 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cs-glutammato * </td><td></td><td> 40 MM </td><td></td></tr><tr><td> Cs-gluconato ** </td><td></td><td> 50 mM </td><td> 90 MM </td></tr><tr><td> Tetraethylammonium Chloride </td><td></td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr&gt; <td> ATP-Mg </td><td></td><td> 9 mm </td><td> 9 mm </td></tr><tr><td> GTP </td><td></td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td> 5 mM </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH *** </td><td> 7.8 </td><td> 7.2 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> Osmolarità **** </td><td> 245 mOsm </td><td> 240 mOsm </td><td> 240 mOsm </td></tr></tbody></table> * Cs-glutammato è fatto neutralizzando 40 mM di acido L-glutammico con 40 mM CsOH nella soluzione pipetta. ** A 1 m stock di Cs-gluconato è fatto neutralizzando una soluzione di CsOH con il 45-50% di acido D-gluconico. *** Il pH deve essere regolato con NaOH per la soluzione extracellulare e CsOH per le soluzioni pipetta. **** Mantenendo l&#39;osmolarità delle soluzioni pipetta appena sotto quella della soluzione extracellulare impedisce il rigonfiamento delle cellule e migliorando la longevità della registrazione. Tavolo1. Componenti e dei parametri per le soluzioni intracellulari ed extracellulari standard utilizzati in questo protocollo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1.jpg" /> Figura 1. Disegno della camera di registrazione. (AC) superiore, laterale, e viste in sezione della camera di registrazione che mostra dimensioni. La camera è ricavato da un pezzo di spessore di 2 mm di acrilico. (D) camera assemblato. Superfusate entra nella camera attraverso un cm di lunghezza 10 di tubo in Teflon (tubo di afflusso; tipo 24LW). Superfusate è rimosso applicando leggera aspirazione ad una smussato calibro 20 tubo metallico all&#39;altro lato della camera. Adiacente a questo tubo di uscita è un elettrodo di riferimento pellet Ag / AgCl. Il piombo da questo elettrodo di riferimento è collegato all&#39;ingresso di riferimento del headstage. Un piccolo triangolo di KimWipeviene posto sopra l&#39;elettrodo di riferimento per mantenerla in contatto con la soluzione e regolare il flusso della soluzione nel tubo di efflusso. La base della camera è formata ponendo un vetrino per microscopio nei bordi incassati della camera. La slitta è tenuta in posizione con una goccia di grasso per vuoto. Strisce di membrana di nitrocellulosa con fette retiniche sono inseriti in perline di grasso per vuoto che formano un canale per soluzione di fluire. Prima di procedere a fette, un x 10 mm pezzo di membrana di nitrocellulosa 5 è fissata alla camera con due piccole perle di grasso per vuoto. Un pezzo di conchiglia oculare è posizionato lato vitreale giù su questa membrana di nitrocellulosa e sollevò via una volta che le aderisce retina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50007/50007fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig2.jpg" /> Figura 2. Coppie di celle dye-riempita in vepreparazione fetta rtical. A) Immagini di un bastone e cella orizzontale sinapticamente-accoppiata che erano pieni di contrasto coloranti fluorescenti introdotte tramite la pipetta di patch durante la registrazione a cellula intera simultanea. Lucifer giallo (2 mg / ml) è stato incluso nella soluzione asta pipetta (giallo) e B sulfarhodamine (1 mg / ml) è stato incluso nella soluzione di pipetta cella orizzontale (viola). Immagini fluorescenti sono state catturate utilizzando un disco di filatura microscopio confocale (Perkin Elmer Ultraview LCI) equipaggiato con una camera CCD raffreddata (Orca ER) e montato al microscopio palco fisso (Nikon E600 FN con 60X, 1.0 NA obiettivo immersione in acqua). Queste immagini sono state sovrapposte immagini in campo chiaro delle corrispondenti sezioni della retina utilizzando Adobe Photoshop. B) Immagini di un cono e sinapticamente-accoppiati OFF cellule bipolari. Il terminale assone delle cellule bipolari ramifica in più esterno (S1) sublamina dello strato plessiforme interno, vicino al confine con lo strato nucleare interno. <strong&gt; C) Immagini di un cono e cellula orizzontale sinapticamente-accoppiato. Si noti che i morsetti del cono sono considerevolmente più grande del terminale assone dell&#39;asta. Sebbene le cellule orizzontali possono essere identificati dal loro forma oblunga corpi cellulari, corpi cellulari di ON-OFF e cellule bipolari di tipo nel INL non possono essere facilmente distinguibili prima della registrazione. Tuttavia, si può bersaglio sfollati cono-driven OFF cellule bipolari che hanno corpi cellulari nel ONL e può essere distinto dal Coni per l&#39;assenza di segmenti interni ed esterni. La barra della scala è di 20 micron. <img alt="Figura 3" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3.jpg" /> Figura 3. Correnti registrate sotto morsetto di tensione tra quattro diversi neuroni della retina in risposta ad un luminoso 500 msec lampo di luce bianca luce evocata. Il cono (A), cellula orizzontale <strong&gt; (B), e al largo delle cellule bipolari (C) tutti hanno risposto alla luce con una corrente verso l&#39;esterno. (D) L&#39;on cellula bipolare ha risposto allo stesso stimolo luce con una corrente verso l&#39;interno. Il rumore di fondo esposto dalla cellula bipolare off (C) riflette un rilascio continuo di vescicole sinaptiche nel buio che diminuisce quando fotorecettori iperpolarizzare in luce. Risposte da questi quattro cellule sono state ottenute in registrazioni separati utilizzando fette preparate sotto la luce bianca. L&#39;intensità dello stimolo luminoso bianco utilizzato in questi esempi risposte prodotta in cellule orizzontali e bipolari equivalenti a 580 nm flusso di fotoni di 1 x 10 5 fotoni / sec / 2 micron. <img alt="Figura 4" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4.jpg" /> Figura 4. Corrente-tensione (IV) rapporti di hcellule bipolari e orizzontali off. (A) Pannello superiore, correnti di membrana evocati da una serie di 150 msec di tensione passi da -120 a +40 mV applicata in incrementi di 20 mV (pannello inferiore) a una cella orizzontale. Cellule orizzontali hanno tipicamente una bassa resistenza di ingresso e relazioni lineari o interiormente rettificazione IV. (B) IV rapporto di una cella bipolare off in risposta ad una serie di gradini di tensione. Cellule bipolari hanno una maggiore resistenza di ingresso e un IV esteriormente rettifica, dovuto all&#39;attivazione di correnti di potassio voltaggio-dipendenti. <img alt="Figura 5" fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5.jpg" /> Figura 5. Esempi di registrazione dei dati appaiati. (A) Registrazione della corrente di calcio voltaggio-dipendenti cono (Cone I Ca </sub&gt;) in risposta ad una fase 100 msec a -10 mV da un potenziale di -70 mV (Cone V m) azienda. Tenuta e capacitanza transienti sono stati sottratti utilizzando una perdita sottrazione protocollo P / 8. Un veloce corrente eccitatorio postsinaptico (EPSC; HC PSC) è stata registrata contemporaneamente da una cellula orizzontale, mostrando che queste due cellule sono sinapticamente accoppiati (B) L&#39;EPSC è stato registrato in una cella bipolare off in risposta allo stesso stimolo in un altro. cono.

Descriviamo la preparazione di sottili fettine di retina da acquatico salamandre tigre (<em&gt; Ambystoma tigrinum</em&gt;) E spiegare come utilizziamo queste fette di studiare l&#39;elaborazione sinaptica nella retina ottenendo doppia tensione registrazioni clamp whole-cell da fotorecettori e cellule orizzontali e bipolari di secondo ordine.

Registrazioni simultanee a cellule di fotorecettori e dei neuroni di secondo ordine in un anfibio Retinal Fetta Preparazione

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare sottili fette di tessuto dalla retina della salamandra tigre acquatica e utilizzarle per registrazioni simultanee di blocchi di tensione di intere cellule da fotorecettori e cellule orizzontali e bipolari di secondo ordine. Ciò si ottiene sezionando prima l'occhio di una salamandra e isolando la retina su un pezzo di membrana di nitrocellulosa. Il secondo passo consiste nel tagliare sottili fette di retina e posizionarle nella camera di registrazione.Successivamente, la camera viene posizionata su un microscopio verticale a tavolino fisso e le pipette per cerotti vengono posizionate sopra le fette di retina. Il passo finale consiste nell'ottenere registrazioni di intere cellule da una cellula presinaptica, fotorecettrice e postsinaptica orizzontale o bipolare. In definitiva, le registrazioni di intere cellule accoppiate possono essere utilizzate per manipolare il rilascio sinaptico e studiare le interazioni tra le cellule della retina.La preparazione della fetta di retina è stata originariamente sviluppata nei laboratori di Frank Werblin e Sam Wu.A differenza delle preparazioni a singola cellula, le preparazioni a fetta hanno mantenuto intatto il contatto ntico e, a differenza delle preparazioni di retina a montatura intera, l'affettatura della retina espone vari strati retinici, consentendo un facile accesso a tutti i diversi tipi di cellule. Nella retina Fetta. Le preparazioni possono essere utilizzate per registrazioni elettrofisiologiche, compresa la registrazione simultanea per più cellule e per esperimenti di imaging.Questo preparato si è dimostrato estremamente prezioso per lo studio delle interazioni sinaptiche tra i neuroni retinici. In questo video, descriviamo la preparazione delle fette utilizzando la retina della salamandra tigre e sottolineiamo alcuni dei piccoli dettagli che possono fare la differenza tra successo e fallimento. Iniziare questa procedura assemblando la camera.Posizionare due perle di grasso sottovuoto distanziate da otto a 10 millimetri l'una dall'altra attraverso la camera di registrazione per formare un canale per la super fase e per incorporare le fette di retinolo a un secondo battito di grasso, pochi millimetri oltre ciascuna di queste due perle di grasso per fungere da prelievo per limitare la fuoriuscita. Quindi posizionare un piccolo pezzo triangolare di salvietta Kim all'estremità della camera per garantire il contatto del fluido con l'elettrodo di riferimento. Dopodiché, premere un pezzo di membrana di nitrocellulosa contro il microscopio di vetro.Far scivolare su due piccole perle di grasso per vuoto. Per preparare l'affettatrice. Rompi una lama di rasoio a doppio taglio in quattro pezzi.Quindi attacca uno di essi al braccio per affettare. Assicurarsi che il tagliente della lama del rasoio sia piatto contro la camera di registrazione tagliando una sottile fetta di carta da filtro alla nitrocellulosa. Successivamente, dopo aver soppresso una salamandra per decapitazione, nucleare l'occhio usando un paio di piccole forbici di Venezia al microscopio, tagliare la pelle che collega l'occhio all'orbita circostante.Quindi tirare l'occhio in avanti e far scorrere le forbici sotto di esso per tagliare i muscoli oculari e il nervo ottico. Successivamente, posiziona l'occhio enucleato su un letto di cotone su un blocco di linoleum. Ora fai una piccola incisione al centro della cornea con una lama chirurgica affilata.Rimuovere la cornea facendo scorrere le sottili forbici di Venezia nell'incisione ed estendendo il taglio radialmente verso l'esterno verso l'aura serrata. Quindi tagliare circonferenzialmente attorno all'aura serrata ruotando il blocco di linoleum o il cotone tra i tagli. Dopo aver tagliato tutto il giro dell'occhio, rimuovere la cornea e il cristallino estraendoli dal lato della conchiglia oculare.Trasferire l'oculare rimanente su una superficie dura del blocco di linoleum inumidito con soluzione salina di anfibio. Taglialo in terzi con una lama di rasoio affilata con un movimento di segatura fine per assicurarti che tagli fino in fondo la sclera. Quindi posizionare uno o due pezzi di IUP sulla membrana di nitrocellulosa con la superficie retinica rivolta verso il basso.Immergere i pezzi rimanenti con altra soluzione salina. Dopodiché, mettetele in frigorifero nel caso in cui vengano tagliate altre fette in seguito. Ora, premi delicatamente il pezzo di IUP contro la membrana di nitrocellulosa con un paio di pinze sottili.Immergere la membrana in nitrocellulosa e il pezzo di IUP con diverse gocce di soluzione salina fredda di anfibio. Quindi scolare la soluzione salina toccando un pezzo di Kim wipe ai bordi della membrana di nitrocellulosa e iup. Successivamente, immergere l'IUP nella membrana di nitrocellulosa con diverse gocce di soluzione salina fredda di anfibio.Ancora una volta, successivamente staccare l'epitelio pigmentato retinico coroideo della sclera per isolare la retina. Se la retina non ha aderito saldamente, drenare la soluzione salina con una salvietta kim. Per tirare più saldamente la retina sulla membrana di nitrocellulosa, sostituire la soluzione salina e ripetere la procedura se necessario.Quindi, riempi la camera con soluzione salina fredda per anfibi. Trasferirlo sul tavolino dell'affetta fazzoletti. Quindi tagliare la retina e la membrana di nitrocellulosa in strisce sottili da 125 micron premendo delicatamente ma con decisione la lama del rasoio attraverso di esse.Dopo aver tagliato l'intera retina a fette, trasferire le fette di retina una ad una nel canale principale della camera di registrazione. Per trasferire una fetta, tenere in posizione una striscia di membrana mentre si fa scorrere la camera sotto di essa. Assicurati di tenere la fetta sommersa quando si trova sopra la parte centrale della camera.Incorporare i bordi della membrana di nitrocellulosa nelle strisce di grasso sottovuoto e ruotarla di 90 gradi. Per visualizzare gli strati retinici, premere la membrana di nitrocellulosa contro la superficie del vetro, anche se non c'è retina su ogni pezzo. Posizionare strisce di membrana in nitrocellulosa a intervalli regolari di circa un millimetro per aiutare a rompere la tensione superficiale e quindi migliorare il flusso del fluido.Continuare a trasferire le fette una ad una fino a quando le fette non sono state posizionate lungo l'intera lunghezza del canale di perfusione. Dopo che tutte le fette sono state trasferite, spostare la camera di registrazione sul tavolino di un microscopio verticale a tavolino fisso. Collegare il cavo dell'elettrodo di riferimento a un filo di terra sullo stadio della testa dell'amplificatore.Mettere a fuoco le fette utilizzando un obiettivo a lunga distanza di lavoro in acqua da 40 a 60 x. Prossimo super. Fondere le fette a una velocità di un millimetro al minuto con una soluzione salina di anfibio fatta gorgogliare con ossigeno.Collegare la linea di aspirazione alla linea di uscita della camera. Quindi regolare il deflusso per bilanciare l'afflusso ruotando l'estremità smussata dell'ago di aspirazione o avvicinando o allontanando la salvietta kim all'estremità della camera dall'apertura sulla punta dell'ago di uscita. Esamina le fette sotto una luce fioca o a infrarossi.Successivamente, identifica una coppia di cellule, un fotorecettore e una cellula orizzontale o bipolare vicina per la vendita all'ingrosso. Pipetta Philip di registrazione preparata prima degli esperimenti con la soluzione intracellulare, montarla sul portaelettrodo. Quindi, sollevare leggermente l'obiettivo del microscopio.Posizionare la pipetta fotorecettore sotto l'obiettivo. Quindi abbassalo in modo che la punta sia posizionata appena sopra la fetta e regola contemporaneamente la messa a fuoco. Per evitare di andare troppo lontano.Ripetere questa procedura con la seconda pipetta. Quindi, controllare la resistenza della pipetta con un impulso di depolarizzazione da cinque a 10 millivolt. Regolare qualsiasi offset nel livello di corrente di base sull'amplificatore.Successivamente, applicare una leggera pressione positiva e, nel frattempo, posizionare la pipetta postsinaptica in modo che entri in contatto con il corpo cellulare orizzontale o bipolare. Quindi posizionare la pipetta presinaptica in modo che entri in contatto con il corpo cellulare di un fotorecettore a bastoncello o cono. Durante il monitoraggio del rilascio della resistenza, la pressione positiva sulla pipetta postsinaptica, a volte il rilascio della pressione positiva è sufficiente per formare una tenuta giga ohm.Dopo che la resistenza della punta è aumentata a più di 100 mega ohm, applicare un potenziale di tenuta di meno 60 millivolt. Quindi, quando si ottiene una tenuta giga om, annullare il transitorio di capacità della pipetta. Utilizzando il circuito di compensazione della capacità dell'amplificatore patch clamp, ripetere la procedura a soffitto con la pipetta del fotorecettore, applicando un potenziale di mantenimento di meno 70 millivolt e annullare la capacità della pipetta.Transitorio, quindi rompere il cerotto applicando l'aspirazione a ciascuna cellula. La rottura della patch è evidente dalla comparsa di un transitorio di capacità dell'intera cella. Ora, confermate l'identità fisiologica della cellula postsinaptica applicando un lampo di luce e fornendo una serie di gradini di tensione da meno 120 a più 40 millivolt con incrementi di 20 millivolt.Per valutare se le celle sono collegate sinapticamente, erogare una tensione da 25 a 100 millisecondi da 60 millivolt. Depolarizzazione graduale al fotorecettore e ricerca di correnti post-sinaptiche. Nel neurone del secondo ordine, ecco le tracce rappresentative delle risposte alla luce dai neuroni in fette verticali della retina della salamandra.La cella orizzontale a cono e la cella bipolare disattivata mostrano tutte una corrente verso l'esterno in risposta all'inizio della luce. La prominente corrente verso l'interno che segue il lampo di luce nelle registrazioni cellulari orizzontali e bipolari è causata dall'aumento del rilascio di glutammato dai fotorecettori mentre si depolarizzano all'offset della luce. La cellula bipolare risponde con una corrente verso l'interno all'inizio della luce, che deriva da un segno che inverte la cascata di segnalazione del recettore metabotropico del glutammato e dall'attivazione dei canali tripm one.Le celle orizzontali e le celle bipolari possono essere distinte l'una dall'altra per le loro relazioni di tensione corrente. Le celle orizzontali hanno tipicamente relazioni di tensione di corrente lineari o raddrizzatori verso l'interno con una resistenza di ingresso inferiore a 500 mega ohm, le celle bipolari hanno una relazione di tensione di corrente raddrizzante verso l'esterno e una resistenza di ingresso più elevata tra 0,5 e due giga ohm. Questa figura mostra i risultati rappresentativi delle registrazioni di una coppia di celle orizzontali a cono e di una coppia di celle bipolari a cono.In ogni caso, la depolarizzazione del cono a meno 10 millivolt da un potenziale di mantenimento di meno 70 millivolt ha evocato una corrente di calcio voltaggio-dipendente nel cono e una rapida postsinaptica verso l'interno. Corrente nella cellula orizzontale o bipolare Fetta di retina. I preparati sono stati utilizzati in centinaia di studi sull'anatomia e la fisiologia della retina.Sono particolarmente vantaggiosi per esaminare le risposte di più cellule contemporaneamente poiché facilitano la registrazione e l'imaging da più cellule contemporaneamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare la retina, tagliare sottili fette di retina, posizionarle nella camera di registrazione e ottenere registrazioni all'ingrosso da coppie di sé sinapticamente connessi.

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