Registrazioni simultanee a cellule di fotorecettori e dei neuroni di secondo ordine in un anfibio Retinal Fetta Preparazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare sottili fette di tessuto dalla retina della salamandra tigre acquatica e utilizzarle per registrazioni simultanee di blocchi di tensione di intere cellule da fotorecettori e cellule orizzontali e bipolari di secondo ordine. Ciò si ottiene sezionando prima l'occhio di una salamandra e isolando la retina su un pezzo di membrana di nitrocellulosa. Il secondo passo consiste nel tagliare sottili fette di retina e posizionarle nella camera di registrazione.

Successivamente, la camera viene posizionata su un microscopio verticale a tavolino fisso e le pipette per cerotti vengono posizionate sopra le fette di retina. Il passo finale consiste nell'ottenere registrazioni di intere cellule da una cellula presinaptica, fotorecettrice e postsinaptica orizzontale o bipolare. In definitiva, le registrazioni di intere cellule accoppiate possono essere utilizzate per manipolare il rilascio sinaptico e studiare le interazioni tra le cellule della retina.

La preparazione della fetta di retina è stata originariamente sviluppata nei laboratori di Frank Werblin e Sam Wu.A differenza delle preparazioni a singola cellula, le preparazioni a fetta hanno mantenuto intatto il contatto ntico e, a differenza delle preparazioni di retina a montatura intera, l'affettatura della retina espone vari strati retinici, consentendo un facile accesso a tutti i diversi tipi di cellule. Nella retina Fetta. Le preparazioni possono essere utilizzate per registrazioni elettrofisiologiche, compresa la registrazione simultanea per più cellule e per esperimenti di imaging.

Questo preparato si è dimostrato estremamente prezioso per lo studio delle interazioni sinaptiche tra i neuroni retinici. In questo video, descriviamo la preparazione delle fette utilizzando la retina della salamandra tigre e sottolineiamo alcuni dei piccoli dettagli che possono fare la differenza tra successo e fallimento. Iniziare questa procedura assemblando la camera.

Posizionare due perle di grasso sottovuoto distanziate da otto a 10 millimetri l'una dall'altra attraverso la camera di registrazione per formare un canale per la super fase e per incorporare le fette di retinolo a un secondo battito di grasso, pochi millimetri oltre ciascuna di queste due perle di grasso per fungere da prelievo per limitare la fuoriuscita. Quindi posizionare un piccolo pezzo triangolare di salvietta Kim all'estremità della camera per garantire il contatto del fluido con l'elettrodo di riferimento. Dopodiché, premere un pezzo di membrana di nitrocellulosa contro il microscopio di vetro.

Far scivolare su due piccole perle di grasso per vuoto. Per preparare l'affettatrice. Rompi una lama di rasoio a doppio taglio in quattro pezzi.

Quindi attacca uno di essi al braccio per affettare. Assicurarsi che il tagliente della lama del rasoio sia piatto contro la camera di registrazione tagliando una sottile fetta di carta da filtro alla nitrocellulosa. Successivamente, dopo aver soppresso una salamandra per decapitazione, nucleare l'occhio usando un paio di piccole forbici di Venezia al microscopio, tagliare la pelle che collega l'occhio all'orbita circostante.

Quindi tirare l'occhio in avanti e far scorrere le forbici sotto di esso per tagliare i muscoli oculari e il nervo ottico. Successivamente, posiziona l'occhio enucleato su un letto di cotone su un blocco di linoleum. Ora fai una piccola incisione al centro della cornea con una lama chirurgica affilata.

Rimuovere la cornea facendo scorrere le sottili forbici di Venezia nell'incisione ed estendendo il taglio radialmente verso l'esterno verso l'aura serrata. Quindi tagliare circonferenzialmente attorno all'aura serrata ruotando il blocco di linoleum o il cotone tra i tagli. Dopo aver tagliato tutto il giro dell'occhio, rimuovere la cornea e il cristallino estraendoli dal lato della conchiglia oculare.

Trasferire l'oculare rimanente su una superficie dura del blocco di linoleum inumidito con soluzione salina di anfibio. Taglialo in terzi con una lama di rasoio affilata con un movimento di segatura fine per assicurarti che tagli fino in fondo la sclera. Quindi posizionare uno o due pezzi di IUP sulla membrana di nitrocellulosa con la superficie retinica rivolta verso il basso.

Immergere i pezzi rimanenti con altra soluzione salina. Dopodiché, mettetele in frigorifero nel caso in cui vengano tagliate altre fette in seguito. Ora, premi delicatamente il pezzo di IUP contro la membrana di nitrocellulosa con un paio di pinze sottili.

Immergere la membrana in nitrocellulosa e il pezzo di IUP con diverse gocce di soluzione salina fredda di anfibio. Quindi scolare la soluzione salina toccando un pezzo di Kim wipe ai bordi della membrana di nitrocellulosa e iup. Successivamente, immergere l'IUP nella membrana di nitrocellulosa con diverse gocce di soluzione salina fredda di anfibio.

Ancora una volta, successivamente staccare l'epitelio pigmentato retinico coroideo della sclera per isolare la retina. Se la retina non ha aderito saldamente, drenare la soluzione salina con una salvietta kim. Per tirare più saldamente la retina sulla membrana di nitrocellulosa, sostituire la soluzione salina e ripetere la procedura se necessario.

Quindi, riempi la camera con soluzione salina fredda per anfibi. Trasferirlo sul tavolino dell'affetta fazzoletti. Quindi tagliare la retina e la membrana di nitrocellulosa in strisce sottili da 125 micron premendo delicatamente ma con decisione la lama del rasoio attraverso di esse.

Dopo aver tagliato l'intera retina a fette, trasferire le fette di retina una ad una nel canale principale della camera di registrazione. Per trasferire una fetta, tenere in posizione una striscia di membrana mentre si fa scorrere la camera sotto di essa. Assicurati di tenere la fetta sommersa quando si trova sopra la parte centrale della camera.

Incorporare i bordi della membrana di nitrocellulosa nelle strisce di grasso sottovuoto e ruotarla di 90 gradi. Per visualizzare gli strati retinici, premere la membrana di nitrocellulosa contro la superficie del vetro, anche se non c'è retina su ogni pezzo. Posizionare strisce di membrana in nitrocellulosa a intervalli regolari di circa un millimetro per aiutare a rompere la tensione superficiale e quindi migliorare il flusso del fluido.

Continuare a trasferire le fette una ad una fino a quando le fette non sono state posizionate lungo l'intera lunghezza del canale di perfusione. Dopo che tutte le fette sono state trasferite, spostare la camera di registrazione sul tavolino di un microscopio verticale a tavolino fisso. Collegare il cavo dell'elettrodo di riferimento a un filo di terra sullo stadio della testa dell'amplificatore.

Mettere a fuoco le fette utilizzando un obiettivo a lunga distanza di lavoro in acqua da 40 a 60 x. Prossimo super. Fondere le fette a una velocità di un millimetro al minuto con una soluzione salina di anfibio fatta gorgogliare con ossigeno.

Collegare la linea di aspirazione alla linea di uscita della camera. Quindi regolare il deflusso per bilanciare l'afflusso ruotando l'estremità smussata dell'ago di aspirazione o avvicinando o allontanando la salvietta kim all'estremità della camera dall'apertura sulla punta dell'ago di uscita. Esamina le fette sotto una luce fioca o a infrarossi.

Successivamente, identifica una coppia di cellule, un fotorecettore e una cellula orizzontale o bipolare vicina per la vendita all'ingrosso. Pipetta Philip di registrazione preparata prima degli esperimenti con la soluzione intracellulare, montarla sul portaelettrodo. Quindi, sollevare leggermente l'obiettivo del microscopio.

Posizionare la pipetta fotorecettore sotto l'obiettivo. Quindi abbassalo in modo che la punta sia posizionata appena sopra la fetta e regola contemporaneamente la messa a fuoco. Per evitare di andare troppo lontano.

Ripetere questa procedura con la seconda pipetta. Quindi, controllare la resistenza della pipetta con un impulso di depolarizzazione da cinque a 10 millivolt. Regolare qualsiasi offset nel livello di corrente di base sull'amplificatore.

Successivamente, applicare una leggera pressione positiva e, nel frattempo, posizionare la pipetta postsinaptica in modo che entri in contatto con il corpo cellulare orizzontale o bipolare. Quindi posizionare la pipetta presinaptica in modo che entri in contatto con il corpo cellulare di un fotorecettore a bastoncello o cono. Durante il monitoraggio del rilascio della resistenza, la pressione positiva sulla pipetta postsinaptica, a volte il rilascio della pressione positiva è sufficiente per formare una tenuta giga ohm.

Dopo che la resistenza della punta è aumentata a più di 100 mega ohm, applicare un potenziale di tenuta di meno 60 millivolt. Quindi, quando si ottiene una tenuta giga om, annullare il transitorio di capacità della pipetta. Utilizzando il circuito di compensazione della capacità dell'amplificatore patch clamp, ripetere la procedura a soffitto con la pipetta del fotorecettore, applicando un potenziale di mantenimento di meno 70 millivolt e annullare la capacità della pipetta.

Transitorio, quindi rompere il cerotto applicando l'aspirazione a ciascuna cellula. La rottura della patch è evidente dalla comparsa di un transitorio di capacità dell'intera cella. Ora, confermate l'identità fisiologica della cellula postsinaptica applicando un lampo di luce e fornendo una serie di gradini di tensione da meno 120 a più 40 millivolt con incrementi di 20 millivolt.

Per valutare se le celle sono collegate sinapticamente, erogare una tensione da 25 a 100 millisecondi da 60 millivolt. Depolarizzazione graduale al fotorecettore e ricerca di correnti post-sinaptiche. Nel neurone del secondo ordine, ecco le tracce rappresentative delle risposte alla luce dai neuroni in fette verticali della retina della salamandra.

La cella orizzontale a cono e la cella bipolare disattivata mostrano tutte una corrente verso l'esterno in risposta all'inizio della luce. La prominente corrente verso l'interno che segue il lampo di luce nelle registrazioni cellulari orizzontali e bipolari è causata dall'aumento del rilascio di glutammato dai fotorecettori mentre si depolarizzano all'offset della luce. La cellula bipolare risponde con una corrente verso l'interno all'inizio della luce, che deriva da un segno che inverte la cascata di segnalazione del recettore metabotropico del glutammato e dall'attivazione dei canali tripm one.

Le celle orizzontali e le celle bipolari possono essere distinte l'una dall'altra per le loro relazioni di tensione corrente. Le celle orizzontali hanno tipicamente relazioni di tensione di corrente lineari o raddrizzatori verso l'interno con una resistenza di ingresso inferiore a 500 mega ohm, le celle bipolari hanno una relazione di tensione di corrente raddrizzante verso l'esterno e una resistenza di ingresso più elevata tra 0,5 e due giga ohm. Questa figura mostra i risultati rappresentativi delle registrazioni di una coppia di celle orizzontali a cono e di una coppia di celle bipolari a cono.

In ogni caso, la depolarizzazione del cono a meno 10 millivolt da un potenziale di mantenimento di meno 70 millivolt ha evocato una corrente di calcio voltaggio-dipendente nel cono e una rapida postsinaptica verso l'interno. Corrente nella cellula orizzontale o bipolare Fetta di retina. I preparati sono stati utilizzati in centinaia di studi sull'anatomia e la fisiologia della retina.

Sono particolarmente vantaggiosi per esaminare le risposte di più cellule contemporaneamente poiché facilitano la registrazione e l'imaging da più cellule contemporaneamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare la retina, tagliare sottili fette di retina, posizionarle nella camera di registrazione e ottenere registrazioni all'ingrosso da coppie di sé sinapticamente connessi.