Name: Arricchimento di serie staminali spermatogoni e cellule progenitrici (SSC) in Cultura per la derivazione di lungo termine Lines topo adulto SSC (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Impara a derivare e mantenere linee cellulari di cellule staminali spermatogoni da topi adulti utilizzando cellule feeder. Questo metodo supporta la ricerca sulla biologia riproduttiva maschile.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal New York State Department of Health (C026878). MS è stato a New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow. Sostenuto in parte da assegno di ricerca n ° 5-FY11-571 dal March of Dimes Foundation.

1. Preparazione di cellule feeder Si noti che tutti i reagenti descritti di seguito devono essere preparati in modo sterile (vedi tavole 1 e 2). Questo protocollo utilizza la linea JK1 cella (Cell Biolabs, Inc., catalogo # CBA-315) come alimentatori che è un derivato trasformata di topo adulto testicolari cellule somatiche ed è stato descritto altrove 3. Si noti inoltre che tutte le procedure di polizia devono essere eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e dei regolamenti. <ol><li> JK1 cellule possono essere mantenute in coltura e usato con successo come alimentatori fino al passaggio 39. Cultura JK1 cellule in un piatto di coltura cellulare 100 mm (BD Falcon, catalogo # 353.003) con 10 ml di mezzo alimentatore sterilizzata a filtro crescita (DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino [FBS], 2 mM L-glutammina e antibiotici). Quando la cultura raggiunge il 95% di confluenza, dividere le celle 1:06 -1:10 rapporto. </li><li> Estrarre il supporto dal confluente JK1 mono alimentatore cellastrato. </li><li> Lavare strato di cellule una volta con PBS senza calcio e magnesio. </li><li> Aggiungi preriscaldato tripsina / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM EDTA; Corning Cellgro, catalogo # 25-051-CI), e incubare a 37 ° C per 5-10 minuti. </li><li> Inattivare la tripsina con un volume uguale di mezzo di crescita alimentatore. Raccogliere le cellule e centrifugare a 300 xg per 5 min. Risospendere le cellule in terreno di crescita alimentatore. </li><li> Pre-coat multi-pozzetti piastre cella aggiungendo abbastanza 0,4% soluzione di gelatina per coprire il bene e togliere dopo 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Piatto ~ 250 cellule per millimetro 2 in gelatina rivestita con piastra di coltura cellulare (ad esempio, in formato a 48 pozzetti o 6-bene). Incubare coltura a 37 ° C per 16 a 24 ore. </li><li> Togliere terreno di coltura da pozzi. ATTENZIONE: Per inattivare crescita cellulare, aggiungere una soluzione fresca di mitomicina-C a 10 ug / ml diluito in DMEM a ciascun pozzetto (200 pl / pozzetto di una piastra da 48 pozzetti). Mitomicina-C è tossico. Maneggiate e smaltite con cura. Incubare a37 ° C per 4 h. </li><li> Rimuovere mitomicina-C soluzione da cellule. Lavare 3 volte con DMEM prima placcatura cellule staminali. </li><li> Rimuovere DMEM dall&#39;alimentatore cellule pozzetti e aggiungere abbastanza cellule staminali media (100 pl / pozzetto di una piastra da 48 pozzetti, vedi Tabella 3) per prevenire l&#39;essiccamento delle mangiatoie durante passaging. Aggiungi CSS lo stesso giorno, come descritto di seguito nelle sezioni 3.1 o 3.4, utilizzando le dimensioni indicate di pozzetti contenenti alimentatori. </li></ol> 2. La dissociazione del tessuto mouse Testicolo ottenere cellule germinali dei donatori <ol><li> Harvest testicoli di topo adulto in modo sterile e memorizzare temporaneamente i testicoli in una capsula di Petri coperto (senza liquido aggiunto). Il piatto deve posto immediatamente in ghiaccio per evitare essiccazione e mantenere la vitalità cellulare. </li><li> Utilizzando una pinza sottile sterili e una forbice fine in una cappa di coltura cellulare, fare una incisione trasversale nella tunica albuginea completamente senza sezionare il testicolo (cioè tagliato ~ ½ - ¾ distanza through) e usare il forcipe per spremere tubuli seminiferi in un angolo della piastra, tunica degli scarti e dei tessuti allegato. Tenere piastra su ghiaccio in tutto per tenere il tessuto fresco, mantenendo così la sua integrità e prevenire l&#39;evaporazione. </li><li> Rapidamente tritare tubuli con le forbici a molla sottili almeno 3 minuti al testicolo, mantenendo piastra su ghiaccio. </li><li> Raccogliere i frammenti di tubuli in un tubo da 50 ml e lavare in ~ 40 ml di siero refrigerati PBS / 1% di albumina bovina. </li><li> Centrifugare a 60 xg per 10 min per separare frammenti tubulari da spermatozoi e detriti. Gettare il surnatante. </li><li> In una provetta conica da 15 ml, risospendere il pellet in 3 ml per testis di pre-riscaldato dissociazione buffer (DMEM, 0,05% tripsina, collagenasi tipo I 0,03%, 80% U / ml di DNasi I e 0,5 albumina di siero bovino; Vedi Tabella 2 per i dettagli più specifici di dissociazione buffer). </li><li> Posizionare il tubo conico orizzontalmente in un rack in un insieme agitatore a 150 rpm a 37 ° C per 15 minuti per massimizzare unagitation. </li><li> Centrifugare a 60 xg per 10 min per separare singole cellule di pezzi non dissociato. </li><li> Salvare i pezzi di pellet contenenti fino alla fase successiva. Raccogliere il supernatante dal passo 2,8 e aggiungere 3 ml DMEM/10% di siero fetale bovino per neutralizzare buffer di dissociazione. Porre la provetta in ghiaccio temporaneamente. </li><li> Ripetere il passaggio 2,6-2,7 con il pellet salvato dal punto 2.9 a ri-digerire pezzi rimanenti dopo la fase 2.8. </li><li> Aggiungere un volume uguale di DMEM/10% FBS per neutralizzare tampone di dissociazione. </li><li> Sospensione ricombinare dal punto 2,11 con sospensione cellulare salvato dal punto 2.9. Centrifugare per 5 minuti a 300 x g. </li><li> Risospendere il pellet in media di cellule staminali in un volume di 16 ml per ogni coppia di testicoli (vedi Tabella 3). </li></ol> 3. Placcatura di sospensione cellulare testicolare <ol><li> Piastra 2 ml di sospensione cellulare per pozzetto in un 6-pure cellule feeder piastra contenente mitoticamente-inattivato con mitomicina-C e posto in un incubatore per colture cellulari a 37 &amp;deg; C in 5% CO 2. </li><li> Dopo 48 ore, mezzo aspirato, aggiungere 2 ml di terreno fresco e tornare alla incubatrice. </li><li> Dopo 48 ore, aggiungere 0,5 ml di terreno fresco di cellule staminali in ciascun pozzetto e tornare alla incubatrice. </li><li> Dopo 48 ore, successivamente nutrire le cellule tre volte alla settimana, successivamente segue come di grandi dimensioni, fino a quando le colonie discrete (&gt; 50 cellule) appaiono (entro 7 a 21 giorni). Per prima e la seconda alimentazione di ogni settimana (ad esempio, Lunedi e Mercoledì) rimuovere circa il 50% del mezzo e aggiungere di nuovo il 50% in volume di terreno fresco. Per l&#39;alimentazione terzo (ad es Venerdì), aspirare tutte di medie e sostituire con 2 ml di terreno fresco. Questo approccio si basa sul razionale che completi evitare cambiamenti medi minimizza le fluttuazioni nelle concentrazioni di segnali paracrini che vengono secrete nel mezzo di coltura 9. </li></ol> 4. Picking Colony per primo passaggio <ol><li> Estrarre il supporto dalle colonie pozzi contenenti da diversi passaggi e aggiungere fresco medio di cellule staminali. </li><li> Identificare le colonie con un obiettivo 10x. Con il microscopio leggermente de-focalizzato, colonie SSC a bordo del pozzo apparirà come macchie luminose omogenee, comprendenti cellule 11-12 micron molti diametro, in cui è difficile o impossibile distinguere i confini delle singole celle, poiché le cellule appaiono fusi insieme (Figura 1A). Non SSC colonie possono apparire più scuro, più granulare, o meno omogeneo, con bordi distinguibili (Figura 1A, nel riquadro). </li><li> Utilizzando una punta di 200 microlitri pipetta, con il set pipetteman a 50 microlitri, togli prima la media dal pozzo ed espellere a bagnare la punta. Poi, delicatamente spostare la colonia con la punta prima di ritirare rapidamente 50 microlitri di terreno di spostare la colonia di aspirazione nella punta (Figura 1B). </li><li> Espellere il supporto contenente la colonia in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti contenenti cellule feeder inattivate con 100 pl di mezzo di cellule staminali (Figura 1C). </li><li> Ripetere il passaggio4.3 e aggiungere fino a 8 colonie per il bene stesso, senza superare 500 microlitri per pozzetto. </li><li> Ripetere i passaggi 4,3-4,5 per preparare pozzi della piastra da 48 pozzetti con passaggio uno colonie SSC. </li><li> Wells sarà pronto a dividere in 7-14 giorni o dopo grandi gruppi di fino a 500 cellule sono emerse (Figura 1D). </li></ol> 5. Successiva espansione e passaging di SSC per triturazione <ol><li> Cellule al passaggio uno dovrebbe essere subcoltura su alimentatori fresche dopo fino a 14 giorni a una rapporto di divisione di 1:2 per i primi 3 passaggi e poi 1:04-01:06 (ogni 7 giorni) successivamente come segue. Delicatamente triturare colonie fuori un semi-confluente pozzetto (es. ~ 300.000 SSC / pozzetto della piastra da 6 pozzetti) con una punta di pipetta 1 ml lavando media tra le celle. Le colonie possono essere visti distacco. Forzare troppo con il flusso di liquido causerà cellule feeder indesiderate a venire fuori troppo. </li><li> Raccogliere cellule triturato in una provetta conica e centrifugare a 300 xg per5 min. Nota: Un passo tripsinizzazione può essere tranquillamente aggiunto qui, a discrezione del ricercatore. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere in mezzo fresco di cellule staminali da fondo pipettando su e giù per distruggere le colonie. </li><li> SSC piastra su cellule di alimentazione preparati al momento inattivati ​​con mitomicina-C, come descritto nella sezione 1. </li><li> Alimentare cellule tre volte alla settimana come segue. Per l&#39;alimentazione prima e la seconda (ad esempio, Lunedi e Mercoledì) aggiungere 50% in volume di terreno fresco. Per l&#39;alimentazione terzo (ad es Venerdì), aspirare tutte di medie e sostituire con 2 ml di terreno fresco. Le piastre saranno confluenti in 7-10 giorni. Le colture devono essere costituiti da cellule germinali&gt; 98% (vale a dire, &lt;1% di cellule somatiche contaminanti) dopo passaggi 5-7, basato su immunocolorazione (ad esempio, utilizzando il murino della cellula germinale marcatore GCNA) per distinguere le cellule germinali a partire da cellule somatiche 10. Nota: Questi metodi sono stati sviluppati in conformità alle norme e ai requisiti stabiliti dall&#39;IstituzioneCura degli animali e al comitato di uso al Weill Cornell Medical College. </li></ol>

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<li>Seandel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+multipotent+adult+stem+cells+from+GPR125%2B+germline+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors.</a> Nature. 449, 346-350 (2007).</li>
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<li>Yeh, J. R., Zhang, X., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+short-term+in+vitro+assay+for+mouse+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Establishment of a short-term in vitro assay for mouse spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 77, 897-904 (2007).</li>
</ol>

MS riceve canoni da Weill Cornell Medical College di attraverso una licenza to Cell Biolabs, Inc. per la distribuzione JK1 cellule.

Questo metodo per derivare SSC adulti con adulti testicolo derivate da cellule di alimentazione è robusto ed è riuscita quando comuni background genetico (ad esempio FVB, C57Bl6 e misti 129SV/C57Bl/6) e diversi ceppi mutanti sono stati impiegati 2,3,7,14. Infatti, il microambiente creato dal sistema di coltura è sufficiente a superare alcune delle barriere genetiche per mantenere SSCs adulti in vivo (ad esempio nel caso di PLZF - / - animali) 7. Mentre impieghiamo JK1 c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Corning </td><td> 10-013 </td><td> Diluente per la dissociazione del buffer </td></tr><tr><td> Tripsina / EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25-051-CI </td><td></td></tr><tr><td> Staminali base medio cellulare (StemPro-34) </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td> Richiede l&#39;integrazione come da Shinohara et al. (2003) * </td></tr><tr><td> Staminali integratori medie cellulari </td><td> vario </td><td> vedi Tabella 3 </td><td> Richiede l&#39;integrazione come da Shinohara et al. (2003) * </td></tr><tr><td> JK1 cellule </td><td> Cella Biolabs, Inc. </td><td> CBA-315 </td><td> Può sostituire con adulti cellule testicolari stromali come da Seandel et al. (2007) </td></tr><tr><td> mitomicina-C (ATTENZIONE) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4287 </td><td> Tossico, Maneggiare con cura. </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890 </td><td> 0,4% soluzione in acqua </td></tr><tr><td> EVOS xl digitale microscopio invertito </td><td> Gruppo Microscopia Avanzata </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Reagenti e attrezzature specifiche. * Vedi Tabella 3 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Corning </td><td> 10-013 </td><td> Diluente per la dissociazione del buffer </td></tr><tr><td> tripsina (1:250) </td><td> Life Technologies </td><td> 27250-018 </td><td> Dissociazione buffer: finale 0,05% peso / vol </td></tr><tr><td> collagenasi di tipo I, 235 U / ml </td><td> Worthington </td><td> CLS1 235 </td><td> Dissociazione buffer: finale 0,03% peso / volume </td></tr><tr><td> DNAsi I </td><td> SIGMa-Aldrich </td><td> DN25 </td><td> Dissociazione buffer: Finale 80 U / ml </td></tr><tr><td> albumina di siero bovino </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE-100g </td><td> Dissociazione buffer: Finale 0,5% peso / volume </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 2. Dissociazione tampone </td></tr><tr><td> StemPro-34 SFM </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> StemPro-34 supplemento nutriente </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> Supplementi aggiuntivi ** </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aminoacidi non essenziali </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> MEM Vitamina soluzione </td><td> Life Technologies </td><td> 11120-052 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> albumina di siero bovino </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE </td><td> 0,50% </td></tr><tr><td> Antibiotico-antimicotica Solution </td><td> Mediatech </td><td> 30-004-CI </td><td> 1X </td></tr><tr><td> D (+) glucosio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8769 </td><td> 6 mg / ml </td></tr><tr><td> β-estradiolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E2758 </td><td> 30 ng / ml </td></tr><tr><td> progesterone </td><td> Calbiochem </td><td> 5341 </td><td> 60 ng / ml </td></tr><tr><td> siero fetale bovino </td><td> variabile </td><td> n / a </td><td> 1% </td></tr><tr><td> bovina olo-transferrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1283 </td><td> 100 pg / ml </td></tr><tr><td> insulina </td><td> Gemini Bio-Prodotti </td><td> 700-112P </td><td> 25 mg / ml </td></tr><tr><td> umano GDNF </td><td> Vita Techndologie </td><td> PHC7041 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> umana bFGF </td><td> Life Technologies </td><td> PHG0023 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> del mouse FEG </td><td> Life Technologies </td><td> PHG0313 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> putrescina </td><td> La ricerca Organics </td><td> 0778P </td><td> 60 pM </td></tr><tr><td> Selenite di sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 nM </td></tr><tr><td> acido piruvico </td><td> Alfa Aesar </td><td> A13875 </td><td> 30 ug / ml </td></tr><tr><td> DL-lattico </td><td> JT Baker </td><td> 0196-04 </td><td> 1 pg / ml </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Life Technologies </td><td> 21985-023 </td><td> 50 pM </td></tr><tr><td> acido ascorbico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4544 </td><td> 100 pM </td></tr><tr> &lt;td&gt; D-biotina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4639 </td><td> 10 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 3. Staminali media cella </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * Nota: Aggiungere i supplementi di seguito prima di utilizzare il terreno. Filtro sterilizzare e mantenere a 4 ° C. Il medium è stabile per almeno 2 settimane. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ** Abbiamo impiegato diversi produttori, formulazioni e / o numeri di lotto di reagenti, senza apparenti effetti deleteri. In generale, i reagenti di grado coltura cellulare dovrebbe essere impiegato. </td></tr></tbody></table>

arricchimento di serie staminali spermatogoni e cellule progenitrici (ssc) in cultura per la derivazione di lungo termine lines topo adulto ssc

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Staminali spermatogoni e cellule progenitrici (SSC) del testicolo rappresentano un classico esempio di cellule staminali di mammifero e preservare la fertilità per quasi tutta la vita dell&#39;animale. Mentre i precisi meccanismi che governano self-renewal e la differenziazione in vivo sono difficili da studio, vari sistemi sono stati sviluppati in precedenza per propagare SSC murini in vitro utilizzando una combinazione di terreni di coltura e le cellule specializzate alimentazione 1-3. La maggior parte in incursioni in vitro sulla biologia della SSC hanno linee cellulari derivate da neonati, probabilmente a causa della difficoltà di ottenere linee di cellule adulte 4. Tuttavia, il testicolo continua a maturare fino a ~ 5 settimane di età in ceppi maggior parte dei mouse. Nel primo periodo post-natale, si verificano cambiamenti drammatici nell&#39;architettura dei testicoli e nella biologia delle cellule somatiche e sia spermatogenesi, incluse alterazioni nei livelli di espressione di cellule staminali numerosi correlatageni. Pertanto, neonatale-derivati ​​linee SSC potrebbero non ricapitolare la biologia della SSC adulti che persistono dopo che il testicolo adulto ha raggiunto uno stato stazionario. Diversi fattori hanno ostacolato la produzione di linee per adulti SSC storicamente. In primo luogo, la proporzione di cellule staminali funzionali può diminuire durante l&#39;età adulta, a causa di fattori intrinseci o estrinseci 5,6. Inoltre, come con altre cellule staminali adulte, è stato difficile per arricchire SSCs sufficientemente da cellule adulte totale testicolari senza utilizzare una combinazione di immunoselezione o altre strategie di smistamento 7. Strategie comunemente impiegati comprendono l&#39;uso di topi criptorchidi come fonte di cellule del donatore a causa di un alto rapporto di cellule staminali per altri tipi di cellule 8. Basata sull&#39;ipotesi che la rimozione di cellule somatiche dalla coltura iniziale interrompe interazioni con la nicchia delle cellule staminali che sono essenziali per la sopravvivenza SSC, abbiamo precedentemente sviluppato metodi per derivare l adultoines che non richiedono immunoselezione o donatori criptorchidi ma piuttosto impiegano arricchimento di serie SSC nella cultura, di seguito denominata SESC 2,3. Il metodo descritto di seguito comporta una semplice procedura per derivare adulti linee SSC dissociandosi adulto donatore tubuli seminiferi, seguito da placcatura su linee di cellule comprendenti una linea di cellule stromali testicolare (JK1) 3. Attraverso seriale passaging, fortemente aderente, contaminando le cellule germinali non sono esaurite dalla coltura con arricchimento concomitante di SSC. Culture prodotti in questo modo contengono una miscela di spermatogoni a diversi stadi di differenziazione, che contengono SSCS, basato su lungo termine capacità di rinnovamento del sé. Il punto cruciale del metodo SESC è che consente CSS per rendere la difficile transizione da self-renewal in vivo a lungo termine di auto-rinnovamento in vitro in un microambiente radicalmente diverso, produce a lungo termine linee SSC, libero di contaminarecellule somatiche, e consentendo in tal modo la successiva manipolazione sperimentale di SSC.

La comparsa di passaggio per lo zero di tipo selvatico, adulti colonie SSC dopo 7 giorni è mostrato in Figura 1. Tridimensionali colonie sono costituiti da uno strato di cellule piatte attaccate agli alimentatori o della matrice extracellulare underling depositati dagli alimentatori con strati multipli di SSCs crescono sopra. Mentre SSCs sani sono luminose e rifrangenti uniformemente 11-12 micron di diametro, i bordi delle celle sono difficili da distinguere e la dimensione delle colonie possono essere ...

Un metodo semplice per ottenere e mantenere spermatogoni staminali e linee di cellule progenitrici da topi adulti è presentato qui. Il metodo utilizza cellule di alimentazione provenienti dal compartimento delle cellule somatiche del testicolo di topo adulto. Questa tecnica è applicabile ai ceppi di topi comuni, tra cui transgenici, knock-out e knock-nei topi.

Arricchimento di serie staminali spermatogoni e cellule progenitrici (SSC) in Cultura per la derivazione di lungo termine Lines topo adulto SSC

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare colture a lungo termine di topi adulti, spermatogoni, cellule staminali e progenitrici o SSC. Ciò si ottiene preparando prima le cellule di alimentazione inattivate tonicamente. Successivamente, viene preparata una sospensione di cellule testicolari mediante dissociazione enzimatica del tessuto testicolare adulto.Quindi le cellule testicolari vengono piastrate sopra le cellule di alimentazione per consentire la formazione di colonie di SSC. Il passaggio finale della procedura consiste nel prelevare manualmente le colonie di SSC putative per la sottocoltura in piccoli pozzi di coltura. In definitiva, il rinnovamento cellulare a lungo termine e l'espansione delle SSC in molti passaggi in vitro possono essere confermati mediante immunocolorazione per marcatori ampiamente espressi di cellule germinali o più specificamente di SSC.E mediante analisi funzionale utilizzando il trapianto di SSC in vivo. Generalmente gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché l'identificazione di piccole colonie di SSC mediante microscopia di fase è estremamente impegnativa. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di selezione delle colonie sono difficili da apprendere perché può essere difficile vedere le colonie di SSC su uno sfondo complesso di altri tipi di cellule presenti nelle prime fasi delle colture.Per iniziare, preparare le cellule di alimentazione coltivando le cellule JK one in una piastra di coltura cellulare da 100 millimetri con 10 millilitri di terreno di coltura sterilizzato con filtro. Quando la coltura raggiunge il 95% di confluenza, dividere le cellule in un rapporto da uno a sei a uno a 10 lavando prima le cellule una volta con PBS senza calcio o magnesio al momento del preriscaldamento. Prova la tripsina EDTA e incuba a 37 gradi Celsius per 5-10 minuti con un volume di crescita uguale dell'alimentatore.Inattivare la tripsina, raccogliere le cellule e centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Quindi risospendere le cellule nella crescita dell'alimentatore. Le piastre per colture cellulari multipozzetto con l'aggiunta di una quantità sufficiente di soluzione di gelatina allo 0,4% per coprire il pozzetto incubano per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi rimuovere la piastra della soluzione in eccesso, circa 250 cellule per millimetro quadrato, nelle piastre rivestite di gelatina e incubarle a 37 gradi Celsius per 16-24 ore. Quindi, rimuovere il terreno di coltura dai pozzetti. Quindi inattivare la crescita cellulare aggiungendo una soluzione fresca di mitomicina C.Incubare a 37 gradi Celsius per quattro ore.Successivamente, rimuovere la soluzione di mitomicina C dalle cellule e lavarle tre volte con DMEM. Dopo aver rimosso il lavaggio DMEM finale, aggiungere una quantità sufficiente di terreno di cellule staminali per evitare l'essiccazione degli alimentatori durante il confezionamento. Aggiungere temporaneamente le SSC lo stesso giorno dopo il prelievo di testicoli di topo adulto in modo sterile.Conservateli in una capsula di Petri coperta e metteteli immediatamente sul ghiaccio per evitare l'essiccazione e mantenere la vitalità cellulare in una cappa di coltura cellulare. Usando una pinza fine sterile e una forbice fine, praticare un'incisione trasversale nella tunica abia senza sezionare completamente i testicoli e utilizzare una pinza per spremere i tubuli seminiferi in un angolo della placca mantenendo la placca sul ghiaccio. Usa le forbici a molla per coniare rapidamente i tubuli per almeno tre minuti per paio di testicoli.Raccogliere i frammenti di tubuli in una provetta conica da 50 millilitri e lavarli in circa 40 millilitri di BSA refrigerato all'1% in centrifuga PBS a 60 volte G per 10 minuti. Per separare i frammenti di tubuli dagli spermatozoi e dai detriti, scartare il surnatante per ogni paio di testicoli. Resus sospende il pellet in tre millilitri di tampone di dissociazione riscaldato libero.Posizionare la provetta conica orizzontalmente in una griglia in uno shaker impostato a 150 giri/min a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Per massimizzare l'agitazione. Ruotare verso il basso a 60 volte G per 10 minuti per separare le singole cellule dai pezzi non associati.Raccogliere il surnatante in una provetta conica separata da 15 millilitri contenente tre millilitri di DMEM 10%FBS per neutralizzare il tampone di dissociazione. Posizionare la provetta sul ghiaccio, sottoporre temporaneamente i pezzi non associati a un altro ciclo di dissociazione, seguito da neutralizzazione, e combinare la prima provetta con la seconda centrifuga per provette per cinque minuti a 300 volte. G resus.Sospendere il pellet in terreno di coltura con cellule staminali a un volume di 16 millilitri per piastra testicolare. Due millilitri di sospensione cellulare per pozzetto in una piastra a sei pozzetti contenente celle di alimentazione. Inattivato mitoticamente con mitomicina C.Incubare a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% dopo 48 ore.Aspirare il terreno. Aggiungere due millilitri di terreno fresco e rimettere i campioni nell'incubatore. 48 ore dopo.Aggiungere 0,5 millilitri di terreno di cellule staminali fresche in ciascun pozzetto e rimettere nell'incubatore dopo altre 48 ore. Nutrire le cellule tre volte alla settimana come segue, fino a quando non compaiono grandi colonie discrete di più di 50 cellule per l'alimentazione di routine e l'alimentazione. Due. Rimuovere circa il 50% del terreno e aggiungere un volume equivalente di terreno fresco per il terzo. Alimentazione.Aspirare tutto il terreno sotto un luogo con due millimetri di terreno fresco. Dopo aver sostituito il terreno con cellule staminali fresche passano il terreno, le cellule utilizzano prima obiettivi 10 x e 20 x per identificare le colonie con il microscopio leggermente sfocato. Le colonie di SSC sul bordo del pozzetto appariranno come grumi luminosi omogenei composti da molte celle di diametro da 11 a 12 micron in cui è difficile o impossibile distinguere i singoli bordi cellulari.Poiché le cellule appaiono fuse insieme, le colonie non SSE possono apparire più scure, più granulari o meno omogenee con bordi distinguibili. Utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri con l'uomo della pipetta inviato a 50 microlitri, prelevare il terreno dal pozzetto ed espellerlo per bagnare il puntale. Quindi, usando la punta, spingere delicatamente la colonia prima di prelevare rapidamente 50 microlitri di terreno per rimuovere la colonia mediante aspirazione nella punta, espellere il terreno contenente la colonia in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti contenente cellule di alimentazione inattivate con 100 microlitri di terreno di cellule staminali.Aggiungere fino a otto colonie allo stesso pozzetto senza superare i 500 microlitri per pozzetto e preparare ulteriori pozzetti della piastra da 48 pozzetti. Con il passaggio di una colonia SSC in sette-14 giorni, o dopo che sono emersi grandi grumi fino a 500, i pozzetti saranno pronti a dividersi per le cellule di subcoltura che passano. Uno su nuovi fader.Utilizzare una punta di pipetta da un millilitro per tatuare le colonie di un pozzetto semi confluente lavando delicatamente il terreno sulle cellule per allentare le colonie senza disturbare le cellule di alimentazione indesiderate. Raccogliere le cellule triturate in una provetta conica e centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in un terreno di coltura staminale fresco pipettando accuratamente su e giù per interrompere le colonie.Piastre SSC su cellule di alimentazione appena preparate inattivate con mitomicina C come descritto in precedenza in questo video, dividendole in un rapporto di uno a due per i primi tre passaggi e poi da uno a quattro a uno a sei. Successivamente, utilizzare il programma di tre poppate a settimana come descritto in precedenza. Le placche dovrebbero diventare confluenti dopo sette-10 giorni dopo cinque o sette passaggi.Le colture devono essere composte da un superiore al 98%Le cellule germinali mostrate qui sono di passaggio. Zero colonie di SSC adulte wild type dopo sette giorni, le colonie tridimensionali sono costituite da uno strato di cellule piatte attaccate agli alimentatori o alla matrice extracellulare sottostante depositata dagli alimentatori con più strati di SSC che crescono in cima. Mentre le SSC sane sono piastrelle rifrangenti e uniformemente da 11 a 12 micron di diametro, i bordi cellulari sono difficili da distinguere e la dimensione delle colonie può essere molto variabile, sia all'interno del pozzetto che tra i pozzetti preparati da topi diversi.Si noti che la morfologia delle cellule di alimentazione cambierà gradualmente dopo il passaggio dal DMEM 10% al terreno di coltura di cellule staminali dopo l'inattivazione con mitomicina C. Qui sono mostrate grandi colonie di più di 50 cellule che vengono trasferite manualmente in un nuovo pozzetto. La struttura nera è la punta della pipetta per il confronto. Le celle di alimentazione JK one inattivate sono mostrate qui.Senza SSC, colonie grandi e strettamente impacchettate saranno presenti prima della sottocoltura di routine, come mostrato in questa immagine, e forse strettamente o debolmente ancorate alla superficie sottostante. Con la pratica, tali colonie possono essere raccolte mediante taping o lavaggio delicato della piastra senza danneggiare gravemente le cellule di alimentazione. Al di sotto delle colonie raccolte le colonie possono essere frantumate meccanicamente pipettando su e giù, o seguendo questa procedura.Altri metodi, come il trapianto di cellule staminali di spermatogoni, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quale frazione di cellule germinali all'interno di un particolare insieme di condizioni di coltura rappresenta autentiche SSC funzionali in vivo. Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione di come identificare visivamente le colonie e stabilire culture a lungo termine.

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