LeafJ: un plugin per ImageJ semi-automatico di misurazione Leaf Shape

Lo scopo di questa procedura è quello di automatizzare la misurazione della forma delle foglie per esperimenti ad alta produttività. Ciò si ottiene sezionando prima le foglie e visualizzandole con uno scanner piano. Il secondo passo della procedura consiste nell'utilizzare il plug-in J della foglia per rilevare e misurare le foglie.

Il terzo passo consiste nel preparare le foglie per la microscopia e fotografarle utilizzando un microscopio composto. Il passaggio finale consiste nel tracciare le linee di sellout sulle immagini acquisite utilizzando un tablet touchscreen. In definitiva, i risultati possono mostrare differenze nella forma delle foglie, nelle dimensioni e nel numero di cellule attraverso questa combinazione di analisi delle immagini.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è la sua velocità. È circa sei volte più veloce della misurazione manuale. Le persone sapevano che questo metodo poteva avere difficoltà perché il corretto posizionamento delle foglie è fondamentale per l'analisi a valle e perché il montaggio delle foglie sui vetrini può essere tecnicamente impegnativo.

Ho avuto l'idea di questo metodo quando mi sono reso conto che avevamo circa 15.000 foglie da analizzare, e farlo a mano avrebbe richiesto molti mesi e sarebbe stato incredibilmente noioso, dimostrando che la tecnica di dissezione delle piante avrebbe causato neuro zue. Un ricercatore del mio laboratorio Inizia preparando fogli trasparenti da 8,5 x 11 pollici. Ogni foglio deve essere diviso in cornici rettangolari, abbastanza grandi da ospitare le foglie di una pianta, assottigliare il secondo foglio di lucidi al foglio stampato per fungere da copertura per evitare che le foglie si secchino.

Etichetta con la pianta, il genotipo e lo stato di crescita. Seziona le foglie delle piante del 26° dayle. Disponi le foglie sulla trasparenza in ordine tattico dal più giovane al più vecchio.

Posiziona le foglie verticalmente all'interno della cornice senza toccare il bordo o sovrapporre altre foglie. In caso contrario, ne deriveranno problemi Durante l'analisi, è importante che le foglie orientali non si tocchino, incorniciano, non si sovrappongano con le foglie disposte. Inseriscili con il secondo foglio di lucidi vuoto e una griglia per mantenere le foglie piatte.

Quindi genera un'immagine utilizzando uno scanner piano con almeno 600 punti per pollice di risoluzione. Inizia installando il plugin. Scarica l'immagine J e trascina il file jja foglia nella cartella dei plugin dell'immagine J.Quando viene utilizzata l'immagine J, il plug-in J foglia sarà ora disponibile.

Procedi con l'apertura del file immagine foglia nell'immagine J.Assicurati che l'immagine J sia la versione 1.45 s o successiva. Dividi l'immagine in tre canali di colore, rosso, verde e blu, facendo clic sui canali di divisione del colore dell'immagine. Quindi, applica una soglia all'immagine nel canale blu.

Ora seleziona tutte le foglie di una pianta usando lo strumento di selezione rettangolare e quindi seleziona il plug-in J della foglia. Il plugin aprirà ora una casella che consente di impostare le varie condizioni dell'esperimento, come un gruppo sperimentale e un genotipo. Prima di procedere, modificare queste opzioni, quindi selezionare le condizioni per le foglie selezionate nella regione di interesse e fornire un nome descrittivo.

Premi continua e la foglia J delineerà automaticamente ogni foglia con un'immagine ROI unica. Le routine J si adattano in ellisse alla lama e calcolano gli assi maggiore e minore di quell'ellisse, se necessario. Modifica le linee di traccia utilizzando la finestra Gestione ROI.

Per questa procedura può essere utile un tablet touchscreen collegato come monitor esterno. Con i limiti definiti correttamente, eseguire l'analisi premendo. Ok, ora la foglia J emette la lunghezza del petalo e le varie geometrie della lamina fogliare.

Infine, esporta i risultati della misurazione e le informazioni associate in un foglio di calcolo. Dopo aver scansionato le foglie, fissale in F-A-A-F-A. Le foglie fisse possono essere conservate a quattro gradi Celsius per un massimo di sei mesi.

Andando avanti di un'ora o due prima dell'imaging, le foglie eliminano le foglie cambiando il fissativo FAA in soluzione di cloridrato. Una volta eliminate, montare le foglie su vetrini con i tricomi rivolti verso l'alto utilizzando un ingrandimento 40x su un'immagine al microscopio composta, lo strato di mesil al centro di ogni foglia su entrambi i lati della vena principale, evitando le cellule vicino ai tricomi o alle vene. Per evitare difficoltà nell'elaborazione delle immagini, è importante rimuovere tutte le bolle d'aria dalle diapositive durante il montaggio delle foglie e anche ottenere immagini a fuoco nel passaggio successivo.

Dopo aver raccolto le immagini desiderate, aprirne una nell'immagine J e tracciare i contorni delle celle fogliari con lo strumento di gestione JROI dell'immagine con l'aiuto del tablet touchscreen e di uno stilo. Questo non utilizza il plug-in LEAF J. Prima di utilizzare LEAF J per la sperimentazione, l'accuratezza e la velocità del plugin sono state confrontate con quelle di un ricercatore esperto. Grembiule.

La foglia J ha terminato 5,7 più rapidamente rispetto ai calcoli manuali e il confronto dei dati dei due metodi ha mostrato che i risultati erano strettamente correlati per tutti i parametri misurati dei 3.532 confrontati. I punti dati 172 erano valori anomali. Di questi valori anomali, 29 sono stati causati dal plugin LEAF J molto meno dei 143 causati da un errore umano.

Durante la misurazione manuale, l'anta J è stata aggiornata per ridurre ulteriormente il numero di errori. Prendendo confidenza con le misurazioni di LEAF J, è stato utilizzato per saggiare l'evitamento dell'ombra utilizzando un modello a effetti misti. Il trattamento e il numero di foglie erano effetti fissi e la replica era come un effetto casuale.

Molti parametri sono stati influenzati in modo significativo dal trattamento dell'ombra. In alternativa, alcuni parametri non sono stati influenzati in modo significativo dall'ombra. Utilizzando un'analisi con immagini assistite da compresse dei parametri cellulari, sono stati esaminati 67 genotipi di Arabidopsis ANA, per un totale di 8.629 cellule provenienti da 877 foglie di 224 piante.

I genotipi sono stati poi raggruppati in sei classi. La maggior parte dei genotipi ha una dimensione e un numero di cellule normali. Tuttavia, molti avevano celle di dimensioni maggiori con un numero di cellule normale.

Sebbene sia importante tentare questa procedura per utilizzare la randomizzazione e la progettazione sperimentale quando si coltivano le piante, ricorda che lavorare con formaldeide e cloridrato può essere estremamente pericoloso. Pertanto, quando si esegue questa procedura, è necessario prendere precauzioni come indossare guanti e lavorare nella cappa aspirante. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire lo screening ad alto rendimento dei fenotipi di foglie e cellule utilizzando le tue condizioni sperimentali Seguendo questa procedura.

Ulteriori metodi come il sequenziamento dell'RNA possono essere utilizzati per rispondere a domande come quali geni si modellano efficacemente.