Applicazione locale di farmaci allo studio delle funzioni recettore nicotinico in fettine di cervello del mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la funzione del canale ionico ligando dipendente nei neuroni da fette di cervello preparate in modo acuto derivate da topi adulti. Ciò si ottiene estraendo prima un cervello intatto da un topo adulto che è stato trans Cardi perfuso con liquido spinale cerebrale artificiale specializzato. Il secondo passo consiste nel preparare fette di cervello dalla regione del cervello di interesse nell'orientamento desiderato.

Successivamente, una singola fetta di cervello viene posta in una camera di registrazione al microscopio e i singoli neuroni all'interno della fetta vengono identificati per la registrazione. Il passaggio finale è la registrazione del patch clamp dell'intera cellula di un neurone, seguita dall'applicazione locale di farmaci per attivare i canali ionici ligando dipendenti utilizzando una seconda micropipetta di vetro. In definitiva, questo metodo di studio dei canali ionici ligando-dipendenti viene utilizzato per mostrare le proprietà biofisiche dei recettori nativi sui neuroni vivi.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'applicazione del bagno o la somministrazione di farmaci su YouTube, è che la somministrazione del farmaco al neurone registrato è molto veloce e localizzata. Piccole quantità di farmaco possono essere somministrate e più neuroni possono essere studiati da una singola fetta. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del recettore nicotinico dell'acetilcolina, come la determinazione dei recettori nicotinici nativi coinvolti nelle risposte biofisiche della cellula, biologiche e comportamentali alla nicotina.

In questa procedura, dopo aver sacrificato un topo adulto e aver ottenuto il cervello, tagliare il cervello nell'orientamento desiderato per includere l'area di interesse su una piastra metallica ghiacciata. Quindi, fissare il blocco cerebrale con la super colla sulla superficie asciutta del palco di un'affettatrice vibrante. Quindi immergere il blocco cerebrale in una soluzione di recupero NMDG a quattro gradi Celsius e far bollire continuamente la soluzione con carbogeno.

Successivamente tagliare le fette di 250 micron di spessore ciascuna dall'area cerebrale di interesse. Quindi, estrarre una micropipetta patch standard con una resistenza da quattro a sei mega ohm utilizzando l'estrattore marrone fiammante programmabile. Riempire la micropipetta con una soluzione di registrazione intracellulare adatta.

Quindi trasferire una fetta nella camera di registrazione sul tavolino di un microscopio verticale, fondere continuamente la fetta con una CSF standard gassata a 32 gradi Celsius che registra un CSF da 1,5 a 2,0 millilitri al minuto. Al microscopio, individuare e centrare l'area cerebrale di interesse utilizzando un obiettivo aereo 10x. Successivamente, visualizza i singoli neuroni utilizzando un obiettivo a immersione in acqua 40 x nel vicino infrarosso collegato all'ottica di contrasto di interferenza differenziale IR e un dispositivo accoppiato caricato nel vicino infrarosso ad alta velocità o una videocamera CCD Sotto l'osservazione IR DIC, i neuroni sani mostrano una membrana plasmatica liscia grigio chiaro dopo la visualizzazione cellulare.

Esegui la registrazione di intere cellule utilizzando tecniche convenzionali. Ora estrai un'altra micropipetta patch clamp standard come prima per produrre due puntali gemelli identici dallo stesso pezzo di vetro con una resistenza ottimale di circa cinque mega ohm. Riempire una delle micropipette con la soluzione di farmaco diluita in liquido gassato, registrazione standard A, CSF, puntare la punta verso il basso e far scorrere la micropipetta riempita di farmaco per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate nella micropipetta.

Quindi, montare la micropipetta riempita di farmaco in un portapipette collegato al manipolatore microm. Il supporto della pipetta deve essere collegato con il tubo a un sistema di espulsione della pressione adatto. Espellere manualmente la pressione tre o quattro volte nella micropipetta per creare una pressione adeguata dietro la colonna di fluido.

Quindi abbassare la pipetta del farmaco nella fetta utilizzando il manipolatore microm utilizzando I-R-D-I-C. Osservazione. Posizionare la micropipetta del farmaco sulla superficie della fetta di tessuto. Eseguire un'espulsione a pressione e monitorare le vicinanze del puntale per rilevare il movimento dei detriti relativi all'espulsione e al puntale della micropipetta.

Per qualsiasi segno che il puntale sia ostruito o bloccato, se il puntale è ostruito, ritrarre la pipetta e sostituirla con una nuova. Avvicinati alla cella registrata in diagonale dalla parte superiore della fetta. Quando si trova nella posizione finale, la punta della pipetta riempita di farmaco si trova sullo stesso piano focale della cellula registrata e della punta dell'elettrodo di registrazione e si trova a circa 10-40 micron dalla cella registrata.

Se la punta della pipetta riempita di farmaco si trova al di sopra della cellula registrata, la forza dell'espulsione della pressione potrebbe interrompere la giga tenuta della cellula, quindi registrare le correnti cellulari suscitate da acetilcolina e/o nicotina mantenendo i neuroni in modalità morsetto di tensione. Sebbene la reiezione della pressione possa essere attivata manualmente quando si utilizza un pico spritzer tre per ottenere risultati più riproducibili, è consigliabile attivare la reiezione della pressione utilizzando il sistema di acquisizione e un impulso TTL digitale. Per migliorare l'esperimento, il portapipetta riempito di farmaco può essere montato su un traslatore elettrico pizo a dimensione singola in grado di accettare un ingresso di tensione analogico, che viene poi montato sul micromanipolatore ad alta precisione.

Un traslatore elettrico pizo è utile perché il movimento della pipetta riempita di farmaco dentro e fuori dalla fetta, compresi i tempi e la velocità di entrata, e di uscita, può essere più facilmente controllato e riprodotto da un esperimento all'altro. Quindi, regolare la tensione al suo valore massimo con il potenziometro a controllo manuale sull'amplificatore elettrico a tensione controllata pizo. Utilizzare il micromanipolatore per posizionare la pipetta riempita di farmaco nella fetta.

Ritrarre la pipetta riducendo manualmente la tensione a zero sull'amplificatore controllato in tensione pazo electric utilizzando un segnale di uscita analogico dal sistema di acquisizione della registrazione. Spostare la pipetta riempita di farmaco nella fetta prima che si verifichi l'impulso TTL di espulsione a pressione. Dopo che si è verificato l'impulso, ritrarre la pipetta.

Questa figura mostra la risposta rappresentativa di un neurone dopaminergico a 100 micromolari di acetilcolina applicata localmente, e questa figura mostra la risposta rappresentativa di un altro neurone dopaminergico a 100 micromolari di nicotina applicata localmente. Ecco i potenziali d'azione spontanei di un neurone dopaminergico in una fetta di cervello di topo Alpha sei L nove prime S tenuta in modalità current clamp. L'applicazione di un micromolare di nicotina utilizzando un rifiuto della pressione di 250 millisecondi ha indotto cambiamenti nell'azione, nella potenziale velocità di sparo e nel potenziale di membrana a riposo.

Utilizzando la ricerca di soglia nel software P clamp, è stata derivata la velocità di attivazione istantanea per classificare i neuroni in base ai tipi di risposta all'acetilcolina dei singoli neuroni del colus superiore. In una fetta di cervello di topo Alpha sei L nine primes sono state bloccate in tensione, seguite dall'applicazione locale di una nicotina micromolare tramite espulsione a pressione, i neuroni di tipo uno hanno mostrato un aumento delle IPC. Dopo l'applicazione di nicotina, i neuroni di tipo 2 hanno mostrato grandi correnti verso l'interno e un aumento delle EPC in risposta all'applicazione di nicotina.

Il traslatore elettrico Pizo offre coerenza e protegge dalla fuoriuscita di farmaci. Un neurone dopaminergico VTA in una fetta di cervello di un topo Alpha six L nine prime S è stato registrato in modalità clap di tensione. Durante l'applicazione di un micromolare di nicotina, la pipetta riempita di nicotina è stata manovrata nella posizione finale prima dell'espulsione della pressione e retratta dopo l'espulsione utilizzando un traduttore elettrico pazo.

Una seconda risposta è stata registrata due minuti dopo la prima per dimostrare che non si era verificata alcuna desensibilizzazione N-A-C-H-R. Gli esperimenti sono stati ripetuti con l'applicazione di nicotina 10 micromolari. Anche in questo caso, non è stata osservata alcuna desensibilizzazione nella seconda risposta rispetto alla prima.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in appena tre ore se eseguita correttamente. In alcuni casi, è possibile studiare da 10 a 15 neuroni da una singola fetta di cervello in un giorno Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di posizionare accuratamente la pipetta piena di farmaco per mantenere un equilibrio tra la piena attivazione dei recettori nicotinici di superficie e l'integrità del giga seal.