Singola molecola di imaging del regolamento Gene In vivo Utilizzo di attivazione Cotranslational da Cleavage (CoTrAC)

Lo scopo di questa procedura è quello di acquisire immagini di fluorescenza time-lapse di colonie di e coli in crescita, esprimendo costrutti di co track per identificare il numero di molecole proteiche di nuova produzione. Ciò si ottiene preparando prima un campione di cellule, coex che esprime una proteina di interesse fusa a un reporter Cora fluorescente e una proteasi che si divide specificamente tra il reporter Cora e la proteina di interesse. Il secondo passo consiste nel preparare un gel di Aris a bassa temperatura di fusione realizzato con M nove media minimi.

Successivamente, viene preparato un tampone in gel AROS per l'uso con una camera di campionamento a temperatura controllata. Le cellule di E coli vengono posizionate sul gel e la camera viene assemblata. Il passaggio finale consiste nel posizionare la camera su un microscopio a fluorescenza e visualizzare diverse colonie cellulari in crescita a intervalli regolari per più generazioni.

Il fotosbiancamento delle molecole del rapporto TRE appena prodotte ad ogni intervallo di tutti i re viene utilizzato per acquisire tracce temporali della produzione di proteine nelle cellule vitali con risoluzione di una singola molecola e di una singola cellula. Il vantaggio di questa tecnica rispetto alle misure di singole cellule che utilizzano la fusione proteica a fluorescenza è che la produzione di qualsiasi cancro di molecole proteiche può essere seguita con la procedura a singola molecola e il risultato influisce sulle funzioni di tali molecole. Per ingegnerizzare il ceppo inserire le sequenze, codificando una sequenza di localizzazione della membrana, una proteina fluorescente a maturazione rapida e una sequenza di riconoscimento della proteasi e terminale a e in frame con una proteina di interesse in questo caso specifico, un fattore di trascrizione o tf.

In questa procedura è stato utilizzato il reporter venoso TSR mirato alla membrana. Il reporter è stato fuso con la sequenza di riconoscimento della proteasi ubiquitina per contare il numero di batteri espressi fago Lambda Repressor, molecole di proteina C one. Dopo aver incorporato il costrutto nel cromosoma e coli, il plasmide codificante della proteasi specifica per la sequenza di riconoscimento viene trasformato in un ceppo che esprime il reporter fluorescente e la proteina di interesse nella fusione traduzionale.

In questo protocollo, è stata utilizzata la proteasi ubiquitina carbossi Hydro one, che si scinde immediatamente dopo il residuo C terminale di ubiquitina. Per iniziare questo protocollo, scegli una colonia di e coli da una piastra di agar appena striata in un millilitro di M nove, terreno minimo integrato con uno x aminoacidi del mezzo essenziale minimo e antibiotici appropriati. Incubazione di un agitatore alla temperatura desiderata abbastanza a lungo da raggiungere una densità ottica a 600 nanometri o OD 600 maggiore di 1,0.

Quindi diluire la coltura in un millilitro di terreno M nine fresco con antibiotici appropriati fino a un OD 600 di 0,02. Incubando un agitatore alla temperatura appropriata, la densità cellulare iniziale può essere aumentata, se necessario, per una crescita a bassa temperatura. Quando l'OD 600 è uguale a 0,2-0,3, iniziare a preparare il tampone in gel ARO pesando da 10 a 20 milligrammi di aros a bassa temperatura di fusione in microprovetta da 1,5 millilitri.

Aggiungere il volume appropriato M nove, terreno minimo senza antibiotici per ottenere una soluzione rosa al 3%. Quindi scaldare la soluzione lievitata per 30 minuti a 70 gradi Celsius per farla sciogliere. Capovolgere il tubo per assicurarsi che la soluzione sia completamente fusa e omogenea.

Per il montaggio del cuscinetto in gel, sciacquare un vetro di copertura pre-pulito e un micro acquedotto Scivolare con acqua sterile. Asciugare il vetro di copertura e farlo scorrere soffiando con aria compressa. Posizionare la guarnizione in gomma sulla guida del microacquedotto in modo che copra gli ingressi e le uscite.

Sul lato in vetro del vetrino, applicare 50 microlitri di soluzione ARO al centro del micro acquedotto. Far scorrere la soluzione ARO con il vetro di copertura pulito e asciutto. Lasciare riposare la soluzione agro a temperatura ambiente per 30 minuti.

Quando le cellule raggiungono un OD 600 compreso tra 0,3 e 0,4, sono pronte per l'imaging. Trasferire un millilitro di coltura incubata in una centrifuga in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri a 10.000 volte G per un minuto in una microcentrifuga da banco. Dopo aver scartato l'agente SUP, aggiungere un millilitro di terreno fresco M nine e risus.

Sospendere il pellet e centrifugare delicatamente la sospensione a 10.000 volte G per un minuto. Quindi ripetere ancora una volta la fase di centrifugazione in ripresa, risospendere delicatamente il pellet in un millilitro di terreno M nine. A questo punto, le cellule possono essere utilizzate per l'imaging al microscopio o diluite da 10 a 100 volte per garantire basse densità cellulari per l'imaging time-lapse.

Per preparare un campione per l'imaging, staccare con cura il vetro di copertura dalla parte superiore del cuscinetto in gel. Aggiungere un microlitro di coltura cellulare lavata sulla parte superiore del cuscinetto in gel. Attendere circa due minuti affinché la coltura venga assorbita dal cuscinetto in gel.

È importante non aspettare così a lungo che il cuscinetto in gel si asciughi eccessivamente. Il tempo ideale varierà con la temperatura e l'umidità durante l'attesa all'asciutto. Un altro vetro di copertura pre-pulito.

Una volta che il campione è asciutto, coprire il campione con il nuovo vetro di copertura assicurandosi che il vetro di copertura e il vetrino del microacquedotto siano ben allineati. Assemblare la camera di crescita a temperatura controllata seguendo le istruzioni del produttore. Ora può essere utilizzato per l'imaging al microscopio.

Per iniziare l'imaging, accendere il laser e il microscopio seguendo le istruzioni del produttore. Bloccare la camera assemblata all'inserto del tavolino sul microscopio. Impostare la temperatura della camera di crescita e del riscaldatore dell'obiettivo a 37 gradi Celsius o a un'altra temperatura di crescita desiderata.

Se si esegue l'imaging a temperatura ambiente, la messa a fuoco o il gel padd di solito si spostano in modo significativo per circa 15 minuti dopo lo spostamento iniziale della temperatura. In pratica. Utilizzare questo tempo per trovare le aree di interesse e modificare gli script di imaging in base alle esigenze.

Per un esperimento. Regola l'intensità dell'eccitazione laser in modo che quasi tutte le molecole fluorescenti fotosbiancano entro sei esposizioni. Trova le cellule al microscopio e centrale all'interno di una regione di imaging predefinita e allineata.

Quindi memorizza la posizione di ogni cella, è possibile visualizzare più di una cella in ogni immagine. La finestra temporale di acquisizione per l'imaging time-lapse su molte generazioni assicura che le cellule dell'immagine siano inizialmente separate dalle altre cellule, ma almeno di qualche centinaio di micron in modo che altre colonie non entrino nella regione di imaging durante la crescita. Utilizzando uno script di imaging automatizzato, acquisisci dati time-lapse utilizzando l'algoritmo descritto in questo flusso di lavoro sperimentale, che può essere trovato nel protocollo di testo che accompagna questo video.

Queste immagini mostrano i tipici dati time lapse di un esperimento di traccia del codice. Le immagini di una singola colonia vengono mostrate a intervalli di 25 minuti. In questo esperimento, i dati sono stati acquisiti ogni cinque minuti da 12 colonie diverse.

Queste immagini rappresentano immagini in campo chiaro e immagini a fluorescenza YFP di Venere con lo sfondo medio sottratto per tenere conto del cambiamento di sfondo dell'intero campo di imaging. Nel corso del tempo, quando le immagini vengono sovrapposte, rivelano la localizzazione polare delle molecole reporter UB venose TSR e l'eterogeneità nel numero di molecole prodotte in finestre temporali di cinque minuti in cellule diverse. Qui vengono mostrati i dati tipici di un singolo punto temporale in un esperimento di code track, immagini a fluorescenza venosa di sei esposizioni di 100 millisecondi che sono state acquisite all'inizio di ogni intervallo di tempo di cinque minuti.

Ciascuna delle sei esposizioni è stata separata da 900 millisecondi per consentire alle molecole venose transitoriamente scure che hanno lampeggiato di diventare fluorescenti per l'analisi. L'immagine sei viene sottratta dall'immagine uno per correggere le molecole non sbiancate e l'autofluorescenza. Le macchie di sfondo in questa immagine sono localizzate in specifiche linee cellulari e quantificate dalla loro intensità di fluorescenza integrata.

La fluorescenza integrata media della colonia viene quindi tracciata su sei immagini adattando questa linea a un decadimento esponenziale. Inoltre, un offset costante fornisce un tempo di decadimento di circa un secondo. In questo esperimento, le molecole venose fotosbiancano molto più rapidamente dell'autofluorescenza cellulare.

Pertanto, circa la metà del numero totale di molecole venose viene fotosbiancata in ogni fotogramma. Per questa procedura, l'analisi di imaging della conducibilità può essere eseguita in altri per creare trics del numero di molecole proteiche prodotte in singole cellule.