Name: Vivo Imaging delle proteine GFP-etichettati in Drosophila Gli oociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Scopri l'imaging in vivo di proteine GFP-etichettate negli oociti di Drosophila. Questo protocollo utilizza la microscopia confocale time-lapse per studiare il movimento proteico e la dinamica cellulare in tempo reale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione GM096076 dal programma AREA NIH.

1. Preparazione mosche per la dissezione <ol><li> Anestetizzare mosche sane del genotipo desiderato (per esempio, esprimendo una GFP-marcato proteina) che sono meno di una settimana fa. Selezionare 10-15 femmine di grandi dimensioni con arrotondati color crema addome. </li><li> Trasferire le mosche selezionati e alcuni (3-5) maschi in una fiala contenente nuovo cibo leggermente yeasted e permettere alle mosche di ingrassare per due giorni a 25 ° C. Fare riferimento a Weil et al. 6 per i dettagli di preparazione Drosophila. Ingrasso le mosche assicura che una serie di fasi, in particolare le fasi 8-12, sarà disponibile per l&#39;imaging. Scarsamente ingrassato o unfattened vola di solito contengono solo nelle primissime fasi (1-6) e mature (stadio 14) ovociti. </li></ol> 2. Preparazione di ovociti per l&#39;imaging utilizzo di un microscopio composto Montante <ol><li> Preparare un vetrino vetro standard apponendo due coprioggetto al vetrino, di circa 1 cm di distanza, utilizzando greas siliconee. Utilizzare solo grasso sufficiente a garantire una buona tenuta tra il coprioggetto e far scorrere. Premere con decisione su ciascuna il coprioggetto si diffonderà il grasso in modo molto sottile. Aggiungete un po &#39;olio Halocarbon 27 (Sigma) alla giunzione tra i coprioggetti e far scorrere. Essi servono come distanziatori per evitare ferimento oociti isolati in fasi successive. No. 1.5 coprioggetti lavorare bene, con uno spessore medio (0,16-,18 mm) che corrisponde a quello di ovociti fase avanzata. </li><li> Posto 2-3 gocce di olio Halocarbon 27 sulla superficie di mm 22 2 coprioggetto. Per ottenere gli ovociti sani possibili, una femmina individuo viene rimosso dal flacone alimenti utilizzando pipette a bocca e delicatamente depositato nella Halocarbon senza anestetizzante prima. </li><li> Utilizzando taglienti dissettore (come Dumont # 5), il pin al volo contro il coprioggetto ed estrarre la punta dell&#39;addome. Rimuovere le ovaie trascinandoli lungo la superficie del vetrino, sotto l&#39;olio. Ciò promuoverà adhesion degli ovociti al coprioggetto. </li><li> Delicatamente prendere in giro a parte le ovaie, alla ricerca di ovociti che sono almeno 10B fase dell&#39;oogenesi. Oociti in questa fase possono essere identificati osservando per camere d&#39;uovo in cui l&#39;ovocita occupa almeno il 50-60% del volume totale della camera uovo. A questo punto oogenesi, le cellule follicolari sovrastanti l&#39;ovocita sono diventati colonnare, e circondano l&#39;ovocita su tutti i lati tranne per una piccola regione dove i collegamenti alle cellule rimangono infermiera. Utilizzare le pinze per rimuovere singoli ovociti dalla guaina ovariole. </li><li> Procedi, con le femmine 1-3, fino al 5-8 ovociti non danneggiati sono stati isolati sul coprioggetto. Rimuovere qualsiasi tessuto inutilizzabile. </li><li> Agitare delicatamente il vetrino contenente gli ovociti sul pre-preparato diapositiva in modo che gli ovociti sono posizionate tra i due distanziatori. Non premere verso il basso sul vetrino invertita a quella danneggiare gli ovociti. Se necessario, aggiungere una piccola quantità di olio Halocarbon per tegli bordi del &quot;sandwich&quot; per garantire lo spazio è riempito. (Opzionale:. Lasciare riposare vetrino per alcuni minuti per consentire la sedimentazione di coprioggetto) Il vetrino è pronto per l&#39;imaging. </li></ol> 3. Preparazione di ovociti per l&#39;imaging utilizzo di un microscopio invertito composto <ol><li> Gli ovociti vengono sezionati essenzialmente come descritto nella sezione 2, eccetto che piccoli piatti di Petri con un inserto in fondo di vetro (MatTek, 35 mm) sono utilizzati al posto di coprioggetti. Non è necessario per coprire il campione, e dopo la dissezione, il tessuto può essere ripreso direttamente nei piatti, ma bisogna fare attenzione a garantire gli ovociti rimangono coperti con olio e non sono autorizzati ad asciugarsi. </li></ol> 4. Vivo Imaging <ol><li> Portare un ovocita a fuoco utilizzando DIC o ottica di contrasto di fase ed esaminare l&#39;ovocita non presenti segni di danni, come ad esempio perdite di citoplasma, o rigonfiamento delle cellule del follicolo. Ovociti unica immagine che appaiono sani e non danneggiati. </li><li> Streaprogrammazione può essere monitorato direttamente senza la necessità di etichettatura GFP, dal tuorlo vescicole nel citoplasma sono autofluorescente 7. Questo segnale può essere catturato nella gamma FITC della portata ma probabilmente richiederà impostazioni di guadagno più elevati rispetto a quelli utilizzati per le proteine ​​marcate con GFP. </li><li> Le migliori immagini di streaming sono ottenute da sezioni ottiche che sono appena sotto la superficie dell&#39;ovocita che tocca la coprioggetto / Petri di vetro vetro. Qui l&#39;ovocita è leggermente appiattito, rendendo per un piano di messa a fuoco migliore. Le immagini possono essere catturate a 200X - 1.000 X. Con la disposizione descritta qui, obiettivi a deve essere utilizzato, in quanto il vetrino forma una barriera tra l&#39;ovocita e obiettivo. Questo è ottimale perché riduce notevolmente la deriva e movimento del campione. </li><li> Una volta che una regione di interesse è a fuoco, spegnere l&#39;ottica brighfield e passare a confocale. Utilizzando il veloce scansione / anteprima funzione del software, la messa a fuoco e di ottenerecome necessario. </li><li> Impostazioni per la cattura variano da microscopio per microscopio, ma i parametri generali sono i seguenti: Utilizzare una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di ~ 488 nm e una lunghezza d&#39;onda di emissione di ~ 515 nm. Impostare asse Z catturare in modo che l&#39;asse Z rimane costante, con un ritardo di 10 secondi tra i frame. Acquisire una sequenza di fotogrammi di prova 5-10 per garantire l&#39;oocita è fermo e il piano di messa a fuoco è appropriato. </li><li> Una tipica sequenza di lasso di tempo di catturare fra 20 - 50 fotogrammi, e può essere rivisto immediatamente dopo il completamento per valutare la qualità del video. Il processo può essere ripetuto per altre celle nella diapositiva o femmine aggiuntivi possono essere sezionati secondo necessità. </li></ol> 5. Risoluzione dei problemi e comune <ol><li> Drift - Quando si utilizza un microscopio in posizione verticale, le cellule possono a volte alla deriva a causa di diffusione di olio. Questo può essere minimizzato utilizzando solo olio sufficiente a coprire l&#39;area sotto il coprioggetto. Se il problema persiste, utilizzare g silicone menorease di distanziali apporre alla diapositiva. </li></ol> Nota: alcuni pacchetti software confocale consentire il monitoraggio delle cellule, ma in generale è meglio abbandonare l&#39;imaging di ovociti alla deriva e di utilizzare invece un altro campione. <ol start="2"><li> Nessun segno di streaming - Se lo streaming non è evidente, è probabile causa di una delle due cause: o il piano di riferimento per l&#39;acquisizione di immagini non è corretta (in genere troppo in profondità verso l&#39;interno dell&#39;ovocita) o l&#39;ovocita è danneggiato. Il tempo e la pratica possono ridurre al minimo sia gli errori. </li></ol>

<ol><li>Becalska, A. N., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lighting+up+mRNA+localization+in+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis.</a> Dev. 136, 2493-2503 (2009).</li>
<li>He, L., Wang, X., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shining+light+on+Drosophila+oogenesis%3A+Live+imaging+of+egg+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Gen.+Dev%22%5BJournal%5D)">Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development.</a> Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).</li>
<li>King, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+RC+%22Ovarian+development+Drosophila+melanogaster%22">Ovarian development Drosophila melanogaster</a>. , Academic Press. New York. (1970).</li>
<li>Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).</li>
<li>Serbus, L. R., Cha, B. -J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+and+the+actin+cytoskeleton+control+kinesin-driven+cytoplasmic+streaming+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes.</a> Dev. 132, 3743-3752 (2005).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+Individual+Drosophila+Egg+Chambers+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (60), e3679(2012).</li>
<li>Theurkauf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+microtubule-dependent+cytoplasmic+streaming+in+cappuccino+and+spire+mutant+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes.</a> Science. 265, 2093-2096 (1998).</li>
<li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> PNAS. 98, 15050-15055 (2001).</li>
<li>Röper, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rtnl1+is+enriched+in+a+specialized+germline+ER+that+associates+with+ribonucleoprotein+granule+components%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components.</a> J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).</li>
<li>Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules%2C+the+ER+and+Exu%3A+New+associations+revealed+by+analysis+of+mini+spindles+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations.</a> Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).</li>
<li>Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+the+Drosophila+chorion.ih+a+chemically+defined+organ+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux%27s+Arch.%2C+Devl.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium.</a> Wilhelm Roux's Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).</li>
<li>ImageJ [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html</a> (2013).</li>
</ol>

Non ho nulla da rivelare.

Ovociti Drosophila sono un sistema modello versatile per affrontare una serie di questioni relative alla funzione e l&#39;organizzazione delle cellule e componenti subcellulari. Una comprensione completa della funzione della proteina richiede il controllo dei due aspetti spaziali e temporali di comportamento proteine. I progressi in entrambi i sistemi di imaging e gli strumenti genetiche disponibili per Drosophilists rendere possibile anche per piccoli laboratori per eseguire esperimenti di imaging di alta qualità in ovociti di vita. Qui delineare un protocollo per analizzare il comportamento di proteine ​​GFP-tag o autofluorescente e strutture durante metà a fine-oogenesi che può essere utilizzato in combinazione con una varietà di contesti genetici per sondare la funzione delle proteine. In questo protocollo I descrivere il processo con cui vengono preparati oociti per l&#39;imaging e le impostazioni di base confocali che consentano l&#39;acquisizione di video lasso di tempo di proteine ​​fluorescenti e strutture. Ulteriori details sulla preparazione ovociti sono descritti da Weil et al. 6 Una varietà di ceppi di mosca esprimono proteine ​​che sono stati contrassegnati con endogenamente esone-trapping sono disponibili 8 e varianti proteiche infinitamente più possono essere progettati e reintrodotti mosche. Nel lavoro con tessuto vivente, la salute degli esemplari è di fondamentale importanza. Camere di uova da 10B stadio possibile completare oogenesi in modo sostanzialmente autonomo 11, che li rende ideali per brevi studi di imaging termine. Si deve prestare attenzione a diversi passaggi chiave per ottenere dati di alta qualità. Durante la dissezione è importante manipolare ovaie e ovociti meno possibile, e per ridurre al minimo la quantità di tempo tra la dissezione e il completamento di imaging. Idealmente, una stazione di dissezione piccola dovrebbe trovarsi nella stessa stanza che ospita il campo di applicazione confocale, e solo un paio di camere d&#39;uovo alla volta deve essere ripreso. Il numero consigliato qui (5-8) Garantisce che il tempo dissezione è minimizzato massimizzando la probabilità di ottenere immagini di buona qualità. Vi consiglio di catturare una breve serie di immagini per valutare la qualità delle immagini e verificare che le impostazioni di cattura sono ottimizzate, prima di catturare più di una sequenza lasso di tempo. Più software consente singoli fotogrammi per essere salvato, e queste immagini possono poi essere analizzati in una varietà di modi utilizzando ImageJ 12 o altro software.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Halocarbon dell&#39;olio 27 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8773-100ML </td><td></td></tr><tr><td> # 5SF Pinze </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11252-00 </td><td></td></tr><tr><td> Grasso al silicone </td><td> Sigma Aldrich </td><td> Z273554-1EA </td><td></td></tr><tr><td> Con fondo di vetro piatti Petri </td><td> MatTek </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr></tbody></table>

vivo imaging delle proteine ​​gfp-etichettati in<em&gt; drosophila</em&gt; gli oociti

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

L&#39;ovocita Drosophila è stata stabilita come un sistema versatile per studiare questioni fondamentali quali la funzione del citoscheletro, l&#39;organizzazione delle cellule, e la struttura e la funzione degli organelli. La disponibilità di diverse proteine ​​GFP-etichetta significa che molti processi cellulari può essere monitorata in cellule viventi nel corso di minuti o ore, e utilizzando questa tecnica, processi come RNP trasporti, morfogenesi epiteliale, e rimodellamento tissutale sono state descritte in dettaglio in 1,2 Drosophila ovociti. La possibilità di eseguire immagini video in combinazione con un ricco repertorio di mutanti permette una grande varietà di geni e dei processi da esaminare in dettaglio incredibile. Un esempio è il processo di streaming ooplasmic, che inizia a metà oogenesi 3,4. Questo vigoroso movimento di vescicole citoplasmatiche è microtubuli e chinesina-dipendente 5 e fornisce un sistema utiletemperatura per indagare la funzione del citoscheletro in queste fasi. Qui presento un protocollo per l&#39;imaging lasso di tempo di ovociti di vita con pressoché qualsiasi configurazione microscopia confocale.

Imaging di proteine ​​marcate con GFP varierà a seconda di come fortemente la proteina marcata è espressa. Un mid-stage ovocita esprime reticulon-simile 1 (Rtnl-1), esone etichettato con GFP 8,9 produce segnale forte. Rtnl-1 sembra co-localizza con i microtubuli lunghi disponibili durante lo streaming ooplasmic 10 (Figura 1A). Rtnl-1 è un buon marcatore per osservare lo streaming, ed è anche un indicatore di organizzazione dei microtubuli in ovociti fase avanzata. Streaming Ooplasmic in una camera di uovo di tipo selvatico è evidente come movimento notevole di vescicole tuorlo autofluorescenti quando si utilizza una velocità di acquisizione di un frame ogni 10 secondi (Figura 1B). Una proiezione massimo di cinque telai possono essere generati per segnare il percorso di vescicole movimento. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50044/50044fig1.jpg" /> Figura 1. Vivo imaging sia autoflstrutture uorescenti e GFP-tagged. A) Un singolo time-lapse immagine di un oocita stadio 11 che esprime Rtnl1-GFP a 400X. Rtnl1-GFP fibre di muoversi con un movimento ondulatorio in ovociti di streaming. B) A cinque sporgenza massima cornice di una camera 10B stadio di uova in cui sono stati ripresi i vescicole autofluorescenti tuorlo ogni 10 secondi per 50 secondi totale, con ingrandimento 400X. Barra della scala = 30 micron

Un protocollo per l&#39;imaging dal vivo di proteine ​​GFP-tagged o strutture autofluorescenti nei singoli<em&gt; Drosophila</em&gt; Ovociti è descritto.

Vivo Imaging delle proteine ​​GFP-etichettati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gli oociti

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

In questo protocollo, le cellule che esprimono proteine marcate con GFP vengono isolate da Drosophila femmine e analizzate mediante imaging per studiare il movimento della proteina all'interno di cellule vive. Per prima cosa, preparare una camera di osservazione fissando due coprivetrini su un vetrino utilizzando grasso siliconico in modo da formare un canale. I lati del canale sono rivestiti con olio al carbonio alogeno.Successivamente, dissezionare le ovaie di una femmina in una goccia di olio al carbonio alogeno su un vetrino coprioggetto. Quindi isolare i singoli citi e capovolgere il vetrino coprioggetto sopra il canale nel vetrino preparato per creare una camera di osservazione. Dopo aver localizzato i citi mediante ottica a campo chiaro o DIC, acquisire immagini digitali a intervalli di tempo prestabiliti utilizzando la microscopia confocale e il software associato.In definitiva, una sequenza in time-lapse delle immagini generate può essere utilizzata per monitorare nel tempo il movimento di proteine o particelle all'interno di cellule vive. Questo metodo può contribuire a indagare aree fondamentali della biologia cellulare e dello sviluppo, come il traffico di proteine e di mRNA, e la formazione della polarità cellulare. Anestetizzare innanzitutto le mosche sane di età inferiore a una settimana e selezionare da 10 a 15 femmine di grandi dimensioni con addomi di colore crema e rotondeggianti.Trasferire le mosche selezionate e alcuni maschi in un'ampolla contenente nuovo alimento leggermente arricchito con lievito. Incubare quindi le mosche per due giorni a 25 gradi Celsius per favorirne l'ingrassamento. L'ingrassamento delle mosche garantisce la disponibilità di una varietà di stadi, in particolare dallo stadio otto al dodici, per l'analisi mediante microscopia; le mosche non ingrassate o scarsamente ingrassate contengono di solito soltanto stadi molto precoci e citi maturi. Utilizzando grasso siliconico.Applicare due coprioggetti a circa un centimetro di distanza su un vetrino standard. Utilizzare solo la quantità di grasso necessaria per garantire una buona tenuta tra il coprioggetto e il vetrino. Premere con fermezza su ciascun coprioggetto per distribuire il grasso in modo sottile e uniforme.Quindi aggiungere un po' di olio di carbonio hallow 27 alla giunzione tra le lamelle e il vetrino per evitare di danneggiare i citi isolati nei passaggi successivi. Ora posizionare due o tre gocce di olio di carbonio 27 sulla superficie di una lamella di 22 millimetri quadrati. Successivamente, aspirare con la pipetta a bocca una singola femmina dalla provetta contenente il terreno di coltura e depositarla delicatamente nell'olio di Caron halo.Utilizzando pinzette anatomiche affilate, fissare la mosca contro il vetrino e staccare l'apice dell'addome. Rimuovere le ovaie trascinandole lungo la superficie del vetrino sotto l'olio per favorire l'adesione dei cisti al vetrino. Ora separare delicatamente le ovaie cercando cisti che siano almeno allo stadio 10 B dell'ovogenesi.Identificare gli oociti a questo stadio cercando camere ovariche in cui l'ocite occupa almeno il 50-60% del volume totale della camera ovarica. Utilizzando pinzette, rimuovere singoli oociti dalla guaina ovarica utilizzando da una a tre femmine.Continuare a isolare da cinque a otto oociti integri sul vetrino da copertura. Quindi rimuovere qualsiasi tessuto non utilizzabile. Capovolgere con attenzione il vetrino da copertura contenente gli oociti sul vetrino preparato in precedenza, in modo che le cellule siano posizionate tra i due distanziatori.E ricordare, non premere sul vetrino coprioggetto poiché potrebbe danneggiare le cellule; se necessario, aggiungere una piccola quantità di olio al carbonio alogenato ai bordi del preparato per assicurare che lo spazio sia completamente riempito. Osservare che in questa fase dell'ovogenesi, le cellule follicolari sovrastanti l'ovocita sono diventate compatte e circondano l'ovocita su tutti i lati, tranne che in una piccola regione in cui permangono i collegamenti con le cellule nutrici. Mettere a fuoco un ovocita utilizzando ottiche a contrasto di fase o a contrasto di interferenza differenziale (DIC).Esaminare l'ovocita alla ricerca di eventuali segni di danno, come fuoriuscita di citoplasma o rigonfiamento delle cellule follicolari. Acquisire immagini solo degli ovociti che appaiono sani e integri. Per monitorare direttamente il flusso citoplasmatico senza etichettatura con GFP.Impostare l'acquisizione di immagini nell'intervallo ZI del microscopio con valori di guadagno più elevati rispetto a quelli utilizzati per le proteine marcate con GFP. Utilizzare obiettivi a immersione d'aria per ridurre al minimo la deriva e il movimento del campione. Ottenere sezioni ottiche appena al di sotto della superficie dell'ovocita.Una volta messo a fuoco una regione di interesse, spegnere l'ottica in campo chiaro e passare all'immagine confocale utilizzando la funzione di anteprima di scansione rapida del software, regolando messa a fuoco e guadagno secondo necessità. Impostare inoltre i parametri per l'eccitazione, la lunghezza d'onda e la lunghezza d'onda di emissione. Per l'acquisizione lungo l'asse Z, selezionare un asse Z costante con un intervallo di 10 secondi tra i fotogrammi.Dopo aver acquisito una sequenza tipica a intervalli di tempo composta tra 20 e 50 fotogrammi, esaminare immediatamente e valutare la qualità del video. Questa singola immagine a intervalli di tempo mostra un oocita allo stadio 11. In questo oocita che esprime la proteina R TNL marcata con GFP si può ottenere un segnale intenso.R TNL uno sembra co-localizzarsi con i lunghi microtubuli presenti durante il flusso citoplasmatico. Tipicamente, il flusso citoplasmatico in una camera ovariaca di tipo selvatico è evidente come un marcato movimento di vescicole autofluorescenti di ylk, come mostrato in una proiezione massima di cinque fotogrammi di una camera ovariaca allo stadio 10B. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare citociti femminili sani che esprimono proteine marcate con GFP, di come preparare campioni per l'immagine in tempo reale e di come acquisire video in time-lapse di proteine e particelle fluorescenti.

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