Vivo Imaging delle proteine ​​GFP-etichettati in Drosophila Gli oociti

In questo protocollo, i citi che esprimono proteine marcate con GFP vengono sezionati da drosofila femmina e sottoposti a imaging per studiare il movimento della proteina nelle cellule viventi. Per prima cosa, preparare una camera di visualizzazione fissando due vetrini coprioggetto su un vetrino utilizzando grasso siliconico per formare un canale. I lati del canale sono rivestiti con olio di carbonio halo.

Quindi, seziona le ovaie di una femmina in una goccia di olio di carbonio halo su un vetrino coprioggetti. Quindi isolare i singoli citi e capovolgere il vetrino coprioggetto sul canale nel vetrino preparato per creare una camera di visualizzazione. Dopo aver localizzato i citi con ottica in campo chiaro o DIC, acquisire immagini digitali a intervalli di tempo prestabiliti utilizzando la microscopia confocale e il software associato.

In definitiva, una sequenza time-lapse delle immagini generate può essere utilizzata per monitorare il movimento di proteine o particelle nelle cellule viventi nel tempo. Questo metodo può aiutare a studiare aree chiave della biologia cellulare e dello sviluppo, come il traffico di proteine e mRNA e l'instaurazione della polarità cellulare. Per prima cosa anestetizzate le mosche sane che hanno meno di una settimana e selezionate da 10 a 15 femmine grandi con addomi arrotondati color crema.

Trasferire le mosche selezionate e alcuni maschi in una fiala contenente nuovo cibo leggermente lievitato. Quindi incubare le mosche per due giorni a 25 gradi Celsius per ingrassare. L'ingrasso delle mosche garantisce che siano disponibili una varietà di fasi, in particolare le fasi da otto a 12, per l'imaging delle mosche non ingrassate o le mosche scarsamente ingrassate di solito contengono solo stadi molto precoci e citi maturi Utilizzo di grasso al silicone.

Applicare due vetrini coprioggetto a circa un centimetro di distanza l'uno dall'altro su un vetrino standard. Utilizzare solo una quantità di grasso sufficiente per garantire una buona tenuta tra il vetrino coprioggetto e il carrello. Premere con decisione su ciascun vetrino coprioggetti per distribuire il grasso in modo sottile e uniforme.

Quindi aggiungere un po' di olio di carbonio 27 alla giunzione tra i vetrini coprioggetto e il vetrino per evitare di ferire i citi isolati nei passaggi successivi. Ora posiziona due o tre gocce di olio di carbonio 27 sulla superficie di un vetrino coprioggetto da 22 millimetri quadrati. Successivamente, pipettare in bocca una singola femmina dalla fiala di cibo e depositarla delicatamente nell'olio halo Caron.

Usando una pinza da dissezione affilata, inchiodare la mosca contro il vetrino coprioggetti e tirare via la punta dell'addome. Rimuovere le ovaie trascinandole lungo la superficie del vetrino coprioggetti sotto l'olio per favorire l'adesione dei citi al vetrino coprioggetti. Ora separa delicatamente le ovaie alla ricerca di citi che siano almeno allo stadio B 10 dell'ovogenesi.

Identificare gli ovociti in questa fase cercando camere delle uova in cui l'ovocita occupa almeno il 50-60% del volume totale della camera delle uova. Usando il forcipe. Rimuovere i singoli ovociti dalla guaina ovale utilizzando da una a tre femmine.

Continuare a isolare da cinque a otto ovociti non danneggiati sul vetrino coprioggetto. Quindi rimuovere qualsiasi tessuto inutilizzabile. Capovolgere con cautela il vetrino coprioggetto contenente gli ovociti sul vetrino pre-preparato in modo che i citi siano posizionati tra i due distanziatori.

E ricorda, non premere sul vetrino coprioggetti in quanto può danneggiare i citi, se necessario, aggiungi una piccola quantità di olio di carbonio halo ai bordi del sandwich per assicurarti che lo spazio sia riempito. Si noti che a questo punto dell'ovogenesi, le cellule follicolari sovrastanti l'ovocita sono diventate coer e circondano l'ovocita su tutti i lati, ad eccezione di una piccola regione in cui rimangono le connessioni con le cellule nutrici. Mettere a fuoco un ovocita utilizzando DIC o ottica a contrasto di fase.

Esamina l'ovocita alla ricerca di eventuali segni di danno, come perdite di citoplasma o rigonfiamento delle cellule follicolari. Visualizzare solo gli ovociti che appaiono sani e non danneggiati. Per monitorare lo streaming direttamente senza l'etichettatura GFP.

Impostare l'acquisizione delle immagini nell'intervallo ZI dell'oscilloscopio con impostazioni di guadagno più elevate rispetto a quelle utilizzate per le proteine marcate con GFP. Utilizzo di obiettivi ad aria per ridurre notevolmente la deriva e il movimento del campione. Ottenere sezioni ottiche appena sotto la superficie dell'ovocita.

Una volta che una regione di interesse è a fuoco, spegnere l'ottica in campo chiaro e passare all'imaging confocale utilizzando la funzione di anteprima della scansione rapida del software, regolare la messa a fuoco e il guadagno secondo necessità. Inoltre, impostare i parametri per l'eccitazione, la lunghezza d'onda e la lunghezza d'onda di emissione. Per l'acquisizione dell'asse Z, selezionate un asse Z costante con un ritardo di 10 secondi tra i fotogrammi.

Dopo aver catturato una tipica sequenza time lapse compresa tra 20 e 50 fotogrammi, esamina e valuta immediatamente la qualità del video. Questa singola immagine in time lapse mostra un ovocita allo stadio 11. Questo ovocita che esprime la proteina R TNL marcata GFP one può produrre un segnale forte.

R TNL one sembra colocalizzarsi con i lunghi microtubuli presenti durante il flusso op plasmatico. Tipicamente, il flusso op plasmatico in una camera uovo di tipo selvatico è evidente come movimento evidente delle vescicole di ylk autofluorescenti, come mostrato in una proiezione massima di cinque fotogrammi di una camera uovo di stadio 10 B. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i citi femminili sani che esprimono proteine marcate con GFP, come preparare i campioni per l'imaging dal vivo e come realizzare video time lapse di proteine e particelle fluorescenti.