Name: Super-risoluzione Imaging della Divisione Macchine batterica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Impara l'imaging super-risoluzione con microscopia PALM per studiare l'anello FtsZ di E. coli. Questa tecnica computazionale consente di visualizzare molecole singole con precisione nanometrica e analizzare la divisione cellulare batterica.

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Grant: 5RO1GM086447-02.

1. Preparazione del campione <ol><li> Inoculare i terreni LB con una singola colonia di ceppo JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Crescere durante la notte in uno shaker a 37 ° C. </li><li> Diluire la cultura 1:1000 in M9 + minimi di media [Sali M9, 0,4% di glucosio, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl 2, Acidi MEM aminoacidi e vitamine] e crescere fino a metà-log fase (OD 600 = 0,2-0,3) in presenza di cloramfenicolo (150 mcg / ml) a temperatura ambiente (RT). </li><li> Indurre la cultura con 20 mM IPTG per 2 ore (vedi nota n ° 1). </li><li> Cultura pellet in microcentrifuga (8000 rpm, 1 min) e risospendere in un volume uguale di M9 +; ripetizione. Dopo la risospensione secondi, continuare la crescita a temperatura ambiente per 2 h. </li><li> Fissare cultura indotta con 4% paraformaldeide in PBS (pH = 7,4) a temperatura ambiente per 40 min. Cultura pellet e risospendere in un volume uguale di PBS; repeat. Se le cellule di imaging in diretta, saltare fissazione, cultura pellet e risospendere con un volume ugualedi M9 - [Sali M9, 0,4% di glucosio, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl 2, Acidi MEM Amino]; ripetere. </li><li> Diluire perle oro 01:10 con la cultura sedimento. Applicare il campione alla camera di imaging preparato (vedi punto 2.4). </li></ol> [1] Nota: Il protocollo di induzione al di sopra (passi 1,1-1,3) è stato ottimizzato per il sistema di espressione del ceppo JB281. Condizioni di induzione dettagliate possono variare per altri sistemi di espressione o di proteine ​​di interesse. 2. Assemblea della Camera Imaging <ol><li> Fare una soluzione al 3% (w / v) in agarosio M9 -. Melt agarosio a 70 ° C in un banco blocco termico per 40min. Conservare agarosio fuso a 50 ° C per 5 h. </li><li> Collocare un vetrino pulito microaqueduct nella metà superiore della camera di imaging con gli elettrodi rivolti verso il basso. Allineare la guarnizione inferiore sul vetrino microaqueduct modo da coprire i canali di perfusione. </li><li> Applicare ~ 50 microlitri del fuso agarosio al centro del vetrodiapositiva. Immediatamente sopra la goccia di gel di agarosio con un panno pulito, asciutto coprioggetto. Permettere al gel di solidificare a temperatura ambiente per 30 min. <ol><li> Per pulire coprioggetti: organizzare vetrini in un supporto in ceramica e ultrasuoni per 20 minuti nella rotazione bagni di acetone, etanolo e KOH 1M in barattoli di vetro. Ripetere il ciclo per tre volte, per un totale di 9 sonications, seguito da un singolo sonicazione in dH 2 O. Conservare i coprioggetti puliti fresco dH 2 O. Prima dell&#39;uso, soffiare coprioggetto secco con aria filtrata. </li></ol></li><li> Rimuovere accuratamente il vetrino coprioggetto, lasciando cuscinetto di gel sulla diapositiva microaqueduct. Immediatamente aggiungere 1 ml di campione di coltura cellulare (vedi passo 1.6) all&#39;inizio del cuscinetto di gel. Attendere ~ 2 min, consentendo soluzione che deve essere assorbita dal cuscinetto di gel. Top Gel pad con un nuovo pulito, asciutto coprioggetto. Montare la camera tutta di immagini secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 3. Acquisizione di immagini <ol><li> Accendere la fotocamera microscopio, e laser. Aprire MetaMorph morbidoware (Molecular Devices). </li><li> Luogo appropriato di eccitazione / emissione filtri nel percorso di immagini (Figura 1). </li><li> Impostare potenze laser e le impostazioni di acquisizione di conseguenza. <ol><li> 488 nm laser = 15 mW (vedi nota # 2) </li><li> 561-nm laser = 75 mW </li><li> 405-nm laser = 2 mW ± filtro a densità neutra (Vedi nota # 3) </li></ol></li><li> Bloccare camera di imaging nella fase tramite l&#39;adattatore stadio complementare. </li><li> Designare una regione appropriata immagini (100x100 pixel) che è omogeneamente illuminato da tutti e tre i laser. </li><li> Individuare un&#39;area campione che contiene sia cellule e marcatori fiduciali (perle d&#39;oro) nelle immediate vicinanze, ma non sovrapposti. </li><li> Concentrarsi sulla superficie delle cellule più vicini al coprioggetto. Acquisire un&#39;immagine campo chiaro con 50 ms tempo di integrazione e spostare il focus 0,5 micron nel campione (Figura 3Ai). </li><li> Acquisire insieme immagine verde fluorescenza con eccitazione da 488-n<html> m utilizzando un laser di integrazione 50 ms di tempo (Figura 3Aii). </li><li> Acquisire streaming video in canale rosso con illuminazione continua da 405-nm e 561-nm laser. Per cellule fisse, un frame rate 50 ms è utilizzato per un totale di 20.000 frames (~ 17 totale min) con la potenza del laser 405-nm rampa di circa 10% ogni 1.000 fotogrammi (vedi nota # 4). Per cellule vive, un telaio 10 ms rate viene utilizzato per un totale di 3000 frames (~ 30 s totale) alla temperatura costante di 405-nm potenza laser. </li><li> Spostare il fuoco posteriore alla superficie inferiore delle cellule e acquisire un&#39;altra immagine brightfield come al punto 3.7. </li></ol> [2] Nota: L&#39;intensità integrata della fluorescenza verde di una cellula è direttamente proporzionale al numero totale di FtsZ-mEos2 molecole espresse nella cella. Il 488-nm potenza di eccitazione e impostazioni di acquisizione d&#39;insieme fluorescenza deve essere mantenuta costante per tutte le celle in modo che la relativa FtsZ-mEos2 livelli di espressione in cellule differenti possono essere confrontati. ONTENUTO &quot;&gt; [3]. Nota: celle fisse sono ripreso con la densità neutra (ND) filtro (figura 1, componente ottico # 5) in posizione al fine di ottenere una bassa velocità di attivazione in modo che ogni singola molecola può essere identificato con precisione i ND filtro viene rimosso quando l&#39;imaging cellule vive per aumentare il tasso di attivazione, pur mantenendo una bassa probabilità di due molecole di essere attivati ​​simultaneamente in una diffrazione limitata zona. La velocità più applicato alle celle di imaging è necessario per ridurre il tempo totale di acquisizione, in tal modo &quot;congelare&quot; la Z-ring nel tempo e limitare l&#39;effetto del fotodanneggiamento alla cella. [4] Nota: Il numero di fotogrammi acquisiti sono stati ottimizzati per il nostro sistema e dipendono dalla particolare struttura cellulare, etichettatura densità, tasso di attivazione e se esaurire tutto il pool di fluorofori è importante per l&#39;analisi. In cellule vive, è importante per ottenere un numero sufficiente di localizzazioni in un breve periodo di time possibile per evitare la sfocatura dell&#39;immagine dovuta al movimento della struttura cellulare. 4. PALM Immagine Costruzione <ol><li> Determinare la posizione del centroide di ogni punto rilevato. <ol><li> Caricare la pila di immagini in Matlab (The MathWorks, Inc.). </li><li> Ritagliare la serie di immagini in una regione attorno a una cella che esclude tutti i cordoni fiduciali. </li><li> Selezionare una soglia di intensità per il rilevamento punto che è al di sopra del livello di fondo, ma al di sotto della media intensità posto. Abbiamo spiegare la variazione del livello di fondo durante un esperimento calcolando la media corrente di intensità massima utilizzando una finestra cornice 150. La soglia di intensità per ciascun frame viene quindi interpolato dai valori medi. </li><li> Sottrarre la rispettiva soglia di ogni fotogramma. I potenziali punti sono identificati come tre pixel adiacenti con intensità sopra la soglia. </li><li> Montare l&#39;intensità di fluorescenza di ogni punto prospettico ad un bidimensionale Gaussiafunzione n [Equazione # 1] usando un algoritmo non lineare almeno quadrati (Figura 2). La precisione di localizzazione di ciascun punto viene calcolato utilizzando il numero totale di fotoni rilevati [Equazione # 2]. Qualsiasi posto scarsamente in forma con una precisione di localizzazione superiore a 20 nm (cellule fisse) o 45 nm (cellule vive) viene scartato (vedi nota # 5). Qualsiasi punto con un&#39;intensità maggiore di due volte la media intensità, forse a causa di emettitori sovrapposte, anche scartato. </li><li> Per le cellule fisse, rimuovere le osservazioni ripetute della stessa molecola, ignorando qualsiasi punto la cui posizione baricentro si trova a 45 nm di qualsiasi altro posto che l&#39;ha preceduta da 6 fotogrammi o meno. Per le cellule vive, tutti i punti vengono mantenuti. </li></ol></li><li> Calibrare deriva esempio utilizzando movimento fiducial marker. <ol><li> Ritagliare una regione di pixel 10x10 intorno un marcatore fiducial. </li><li> Sottrarre la relativa soglia determinato in 4.1.3 da ogni fotogramma. </li><li> Montare il profilo di intensità in ognitelaio con dei minimi quadrati algoritmo raccordo assumendo una forma bidimensionale gaussiana. </li><li> Calcolare lo spostamento tra le posizioni centroide rispetto al telaio 1. </li></ol></li><li> Correggere la posizione del centroide di ogni molecola unica indicata al punto 4.1 con la deriva campione adeguato calcolato in 4.2. Confrontate le immagini acquisite in campo chiaro 3.7 e 3.10. Se le cellule sono osservate per spostarsi rispetto al marker fiduciali, i dati sono buttato. </li><li> Sovrapporre tutte le posizioni corrette baricentro su una singola immagine composta da pixel 15x15 nm. Tracciare ogni molecola unica come unità-area, bidimensionale profilo gaussiano centrato alla posizione del centroide con una deviazione standard inferiore alla precisione di localizzazione [Equazione # 2]. Ciò si traduce in una mappa di densità di probabilità, in cui l&#39;intensità di un pixel è proporzionale alla probabilità di trovare una molecola di tale pixel (Figura 3Aiv). </li><li> Confrontando le immagini PALM alle immagini d&#39;insieme. <ol><li> Replot il centroposizioni id come in 4.4, ma su un aereo con 150x150 pixel nm e una deviazione standard pari a 250 nm. Questo genera un&#39;immagine PALM che imita un diffrazione limitata dell&#39;immagine, che può essere utilizzata per confrontare la diffrazione limitata, immagine acquisita insieme a 3,8 (Figura 3Aiii). </li><li> Per confermare che le molecole rilevate sono rappresentativi di tutta la popolazione, confrontare l&#39;immagine ricostruita insieme (Figura 3Aiii, passo 4.5.1) con l&#39;immagine di fluorescenza insieme sperimentale (Figura 3Aii, passo 3.8) per verificare che entrambe le immagini mostrano strutture di forma simile , l&#39;orientamento e l&#39;intensità relativa. </li></ol></li></ol> [5] Nota: la precisione di localizzazione minimo richiesto è stato determinato empiricamente per ogni metodo di imaging riportando le precisioni di tutte le molecole per un dato campione e la selezione di un taglio adeguato. 5. PALM Image Analysis <ol><li> Misura Z-Ring widthe diametro. <ol><li> Ruotare l&#39;immagine PALM modo da orientare verticalmente lungo l&#39;asse della cella (Figura 4A). </li><li> Ritaglia la regione contenente il cellulare Z-ring. </li><li> Calcolare l&#39;intensità cumulativa proiettando un profilo di intensità lungo l&#39;asse lungo della cella. </li><li> Montare il profilo di intensità di una distribuzione gaussiana. La larghezza dell&#39;anello è definito come la massima larghezza di mezzo completo (FWHM) della distribuzione gaussiana attrezzata (Figura 4B). </li><li> Proiettare il profilo cumulativo 5.1.2 intensità lungo l&#39;asse corto della cella. Il diametro dell&#39;anello è definita come la lunghezza del profilo di intensità (Figura 4C). </li></ol></li><li> Plotting Densità FtsZ (vedi nota 6). <ol><li> REPLOT le posizioni centroide come in (4.4), ma senza il profilo Gaussiano tale che ogni molecola unica viene dato un valore di 1 e assegnato ad un pixel corrispondente alla posizione centroide. In questo modo, l&#39;intensità di ciascunpixel rappresenta il numero totale di molecole rilevate in quel pixel. L&#39;immagine PALM densità può anche essere visualizzato come una trama di contorno (Figura 5E). </li></ol></li><li> Determinazione della risoluzione spaziale. <ol><li> Teoricamente-realizzabile risoluzione spaziale: creare un PSF rappresentativo per l&#39;intero campione con la precisione media determinata localizzazione di tutte le molecole rilevate e il calcolo della FWHM (equazione # 3). </li><li> Sperimentalmente-raggiunto risoluzione spaziale: calcolare lo spostamento medio tra le osservazioni ripetute della stessa molecola. </li></ol></li></ol> [6] Nota: Abbiamo usato totale PALM riflessione interna (TIR-PALM, Figura 1 e 5) per limitare l&#39;attivazione ed eccitazione di un sottile strato (~ 200 nm) sopra la cella / vetro interfaccia. in modo che soltanto le molecole FtsZ associate con la membrana più vicino al coprioggetto sarà rilevato.

<ol><li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li>
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<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Immagini PALM contengono informazioni sui conteggi molecola e posizioni all&#39;interno di una cella, consente un&#39;analisi dettagliata della distribuzione e la disposizione delle molecole proteiche bersaglio che è difficile da ottenere con altri mezzi. Di seguito si evidenzieranno le precauzioni che dovrebbero essere prese per estrarre informazioni quantitative precise, pur mantenendo la rilevanza biologica delle immagini PALM. Abbiamo anche esplorare le informazioni che possono essere meglio ottenuta utilizzando cel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> 50 x MEM Aminoacidi </td><td> Sigma </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100 x MEM Vitamine </td><td> Sigma </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46-102-RF </td><td></td></tr><tr><td> 16% paraformaldeide </td><td> Electron Micrsocopy Scienze </td><td> 15.710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTG agarosio </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 nm Oro Perle </td><td> Microsfere-Nanosfere </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 Imaging Camera </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fase Adattatore </td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio invertito </td><td> Olimpo </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> NA 1,45, 60x Obiettivo </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCD Camera </td><td> Andor Tecnologia </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488 nm Sapphire Laser </td><td> Coerente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm Sapphire Laser </td><td> Coerente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405-nm Laser CUBE </td><td> Coerente </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-risoluzione imaging della divisione macchine batterica

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Divisione cellulare batterica richiede il montaggio coordinato di più di dieci proteine ​​essenziali alla midcell 1,2. Centrale di questo processo è la formazione di un anello simile sovrastruttura (Z-ring) dalla proteina FtsZ al piano di divisione 3,4. La-Z anello costituito da più singolo filamento protofilamenti FtsZ, e comprendere la disposizione dei protofilamenti all&#39;interno Z-ring fornirà sul meccanismo di Z-ring e la sua funzione di generatore di forza 5,6. Questa informazione è rimasta inafferrabile a causa delle limitazioni attuali convenzionale microscopia a fluorescenza e microscopia elettronica. Microscopia a fluorescenza convenzionale non è in grado di fornire una immagine ad alta risoluzione di Z-ring a causa del limite di diffrazione della luce (~ 200 nm). Electron cryotomographic di imaging ha rilevato sparsi protofilamenti FtsZ in piccole C. cellule crescentus 7, ma è difficile da applicare a grandi cellule qualiE. coli o B. subtilis. Qui si descrive l&#39;applicazione di un metodo di risoluzione super-microscopia a fluorescenza, microscopia localizzazione fotoattivati ​​(PALM), per caratterizzare quantitativamente l&#39;organizzazione strutturale della E. coli Z-ring 8. PALM offre sia immagini alta risoluzione spaziale (~ 35 nm) e un&#39;etichettatura specifica per consentire l&#39;identificazione univoca delle proteine ​​bersaglio. Abbiamo etichettato FtsZ con il mEos2 fotoattivabile proteina fluorescente, che passa da verde a fluorescenza (eccitazione = 488 nm) al rosso fluorescenza (eccitazione = 561 nm) in caso di attivazione a 405 nm 9. Durante un esperimento PALM, singoli FtsZ-mEos2 molecole sono stocasticamente attivati ​​e le corrispondenti posizioni centroide delle singole molecole sono determinati con &lt;20 nm precisione. Un super-risoluzione di immagine di Z-ring viene poi ricostruita sovrapponendo le posizioni centroide di tutti i rilevati FtsZ-mEos2 molecole. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Usando questo metodo, abbiamo trovato che la Z-anello ha una larghezza fissa di circa 100 nm ed è composto da un fascio di allentato protofilamenti FtsZ che si sovrappongono tra loro in tre dimensioni. Questi dati forniscono un trampolino per ulteriori indagini modifiche ciclo cellulare dipendenti della Z-ring 10 e può essere applicata ad altre proteine ​​di interesse.

Illustrato in Figura 3Aiv è bidimensionale, super-risoluzione resa del Z-ring generato dal metodo di imaging PALM descritto sopra. Qui di seguito, riassumiamo informazioni qualitative e quantitative che possono essere ottenuti da esse. Qualitativamente, abbiamo osservato che la Z-ring è una struttura irregolare che adotta più configurazioni (singola banda o arco elicoidale) che non sono distinguibili in tradizionali immagini di fluorescenza (confronta Figura 3A-Dii</...

Descriviamo un super-risoluzione metodo di imaging per sondare l&#39;organizzazione strutturale del batterica FtsZ-ring, un apparecchio essenziale per la divisione cellulare. Questo metodo si basa su analisi quantitative di fotoattivati ​​localizzazione microscopia (PALM) immagini e può essere applicata ad altre proteine ​​batteriche citoscheletro.

Super-risoluzione Imaging della Divisione Macchine batterica

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ottenere informazioni strutturali quantitative sulle proteine di divisione cellulare di e coli nel loro ambiente nativo. Ciò si ottiene esprimendo una proteina di fusione fluorescente fotoattiva in cellule vive e immobilizzando queste cellule su un cuscinetto di gel acro. Le cellule vengono quindi riprodotte tramite streaming video.Mentre i laser di eccitazione e attivazione vengono applicati per visualizzare le posizioni delle singole molecole, i filmati risultanti vengono analizzati computazionalmente per estrarre le posizioni delle molecole con precisione nanometrica e sovrapporle per generare un'immagine a super risoluzione. Questa immagine può quindi essere analizzata mediante una varietà di misurazioni quantitative che descrivono la struttura di interesse, comprese le sue dimensioni e la densità delle molecole. La localizzazione fotoattivata, microscopia o palmare è una tecnica di microscopia a fluorescenza a super risoluzione facilmente implementabile.La strumentazione è semplice, ma è necessaria un'attenta ottimizzazione dell'acquisizione e dell'analisi dei dati per generare risultati affidabili. Un altro passo cruciale è l'estensione della caratterizzazione della proteina di fusione e il livello di espressione per garantire che i risultati siano biologicamente rilevanti. Il seguente protocollo è stato ottimizzato per la proteina FTSZ fusa Muse two e dovrebbe essere adattato alla proteina di interesse.Per iniziare, inoculare il terreno LB con una singola colonia del ceppo di interesse contenente una proteina attaccata in fluorescenza, preparata come descritto nel protocollo scritto. Accompagnando questo video, coltiva durante la notte in uno shaker a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Diluire la coltura da uno a 1000 in M nove più un terreno minimo.Crescere fino alla fase di log medio in presenza di un antibiotico appropriato a temperatura ambiente, quindi indurre la coltura a produrre proteine con IPTG 20 micromolari per due ore. Nel frattempo, assemblare la camera di imaging producendo una soluzione agro al 3% in M nove meno il mezzo. Sciogliere gli agros a 70 gradi Celsius in un blocco termico da banco per 40 minuti.Conservare gli agro fusi a 50 gradi Celsius per un massimo di cinque ore. Posizionare un vetrino per microacquedotto pulito nella metà superiore della camera di imaging con gli elettrodi rivolti verso il basso. Allineare la guarnizione inferiore sulla slitta del microacquedotto in modo da coprire i canali di perfusione.Applicare circa 50 microlitri di aros fuso al centro del bicchiere. Far scorrere immediatamente la goccia di gel Agros con un vetrino coprioggetto pulito e asciutto. Lasciare solidificare il gel a temperatura ambiente per almeno 30 minuti dopo l'induzione delle proteine.Pellettare la coltura in una microcentrifuga. Resus. Sospendere il pellet in un volume uguale di M nove più ripetere la centrifugazione e la sospensione di resus dopo la seconda sospensione di resus. Continuare la crescita a temperatura ambiente per due ore.Successivamente, fissare la coltura indotta aggiungendo aldeide paraforme in PBS per ottenere una concentrazione finale del 4% di aldeide paraformale. Se si esegue l'imaging di cellule vive, vedere il protocollo scritto che accompagna questo video per le variazioni nella procedura, lasciare incubare la coltura a temperatura ambiente per 40 minuti. Pellettare la coltura e risospendere in un volume uguale di PBS.Successivamente, diluire perle d'oro a 50 nanometri, da una a 10 con coltura risospesa. Per applicare il campione alla camera di imaging preparata, rimuovere con cautela il vetrino coprioggetti, lasciando il tampone in gel sul vetrino del microacquedotto. Aggiungere immediatamente un microlitro di campione di coltura cellulare sulla parte superiore del cuscinetto in gel.Attendere circa due minuti affinché la soluzione venga assorbita dal cuscinetto in gel e ricoprire il cuscinetto in gel con un nuovo vetrino coprinte pulito e asciutto. Continuare ad assemblare l'intera camera di imaging secondo le istruzioni del produttore per l'acquisizione delle immagini. Accendi la fotocamera del microscopio e i laser.Software di metamorfo aperto da dispositivi molecolari. Posizionare i filtri di eccitazione ed emissione appropriati nel percorso di imaging come illustrato in questo schema del microscopio, che può essere trovato nella procedura scritta che accompagna questo video. Quindi imposta le potenze del laser e le impostazioni di acquisizione.Bloccare in modo appropriato la camera di imaging nel tavolino tramite l'adattatore per tavolino complementare. Concentrarsi sulla superficie delle celle più vicine al labbro del vetrino. Designare una regione di imaging appropriata che sia illuminata in modo omogeneo da tutti e tre i laser.Identificare un'area del campione che contenga sia le celle che i marcatori fiduciali, che sono le perle d'oro in stretta vicinanza ma non sovrapposte. Acquisisci un'immagine in campo chiaro con un tempo di integrazione di 50 millisecondi e sposta la messa a fuoco di 0,5 micrometri nel campione. Quindi acquisire un'immagine a fluorescenza verde d'insieme con eccitazione dal laser a 488 nanometri utilizzando un tempo di integrazione di 50 millisecondi.Successivamente, acquisisci video in streaming con illuminazione continua da laser a 405 nanometri e 561 nanometri. Per le celle fisse, viene utilizzato un frame rate di 50 millisecondi per un totale di 20.000 fotogrammi. Con la potenza del laser a 405 nanometri aumentata di circa il 10% ogni 1000 fotogrammi, vengono mostrati i primi 500 fotogrammi.Si noti che il numero di frame acquisiti è stato ottimizzato per questo sistema e dipende dalla particolare struttura cellulare. L'etichettatura, il tasso di attivazione della densità e l'esaurimento o meno dell'intero pool di pavimenti sono importanti per l'analisi per eseguire la costruzione dell'immagine. Innanzitutto, identifica i potenziali punti nel flusso di immagini poiché tre pixel adiacenti con intensità superiori a una soglia determinata empiricamente si adattano all'intensità di ciascun potenziale punto a una funzione gaussiana bidimensionale.Per identificare la posizione della molecola e il numero totale di fotoni emessi, calcolare la posizione di localizzazione di ciascun punto utilizzando il numero totale di fotoni rilevati. Successivamente, scartare i punti mal adattati applicando una soglia di precisione di localizzazione e rimuovere le osservazioni ripetute della stessa molecola ignorando qualsiasi punto che si trovi entro 45 nanometri e sei fotogrammi da qualsiasi punto di procedimento corretto per la deriva del campione. Sottraendo lo spostamento dipendente dal fotogramma delle perle d'oro da ciascuna posizione della molecola, ha sovrapposto tutte le posizioni corrette delle molecole su una singola immagine composta da pixel di 15 per 15 nanometri, tracciando ogni molecola unica come un'area unitaria, un profilo gaussiano bidimensionale con una deviazione standard uguale alla precisione di localizzazione.L'immagine risultante è una mappa di densità di probabilità in cui l'intensità di un pixel è proporzionale alla probabilità di trovare una molecola. In quel Pixel illustrato. Ecco un rendering bidimensionale in super risoluzione dello ZR generato dal metodo Palm Imaging.Qualitativamente, è stato osservato che l'anello Z è una struttura irregolare che adotta molteplici configurazioni, come bande singole o archi elicoidali che non sono distinguibili nelle immagini a fluorescenza convenzionali. Osservazioni come queste possono essere utilizzate per determinare la percentuale della popolazione cellulare che mostra una particolare configurazione strutturale. Da questo grafico è possibile misurare anche le dimensioni dello ZR.La larghezza dell'anello è stata determinata in 113 nanometri. Questo valore è più ampio della larghezza prevista di un singolo proto filamento FDSC, che è compresa tra cinque e 10 nanometri in base alla microscopia elettronica in vitro. Qui, il diametro dell'anello è misurato come 1050 nanometri.Questo diametro può essere utilizzato per descrivere quantitativamente il grado di costrizione durante la divisione cellulare. Un altro approccio quantitativo consiste nel calcolare la densità delle molecole contando il numero di molecole localizzate all'interno di una regione definita. Poiché le immagini del palmo sono proiezioni 2D di oggetti 3D, la riflessione interna totale o TIR Palm deve essere impiegata per limitare il piano di rilevamento a un singolo lato dell'anello Z.Poiché le molecole tracciate rappresentano un sottoinsieme della popolazione totale di FDSC, la densità determinata è un limite inferiore della densità effettiva. La densità massima osservata nelle immagini TIR dell'anello Z suggerisce che alcune sezioni contengono proto filamenti sovrapposti. Durante questa procedura, è importante monitorare la morfologia cellulare e il tasso di crescita in modo da garantire che l'espressione della proteina di fusione non influisca sulla vitalità cellulare.Una volta stabilita questa procedura per la proteina di interesse, può essere utilizzata per testare i cambiamenti strutturali associati alla progressione del ciclo cellulare o ulteriormente estesa all'imaging a due colori per confrontare le distribuzioni facciali di più proteine.

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