Super-risoluzione Imaging della Divisione Macchine batterica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ottenere informazioni strutturali quantitative sulle proteine di divisione cellulare di e coli nel loro ambiente nativo. Ciò si ottiene esprimendo una proteina di fusione fluorescente fotoattiva in cellule vive e immobilizzando queste cellule su un cuscinetto di gel acro. Le cellule vengono quindi riprodotte tramite streaming video.

Mentre i laser di eccitazione e attivazione vengono applicati per visualizzare le posizioni delle singole molecole, i filmati risultanti vengono analizzati computazionalmente per estrarre le posizioni delle molecole con precisione nanometrica e sovrapporle per generare un'immagine a super risoluzione. Questa immagine può quindi essere analizzata mediante una varietà di misurazioni quantitative che descrivono la struttura di interesse, comprese le sue dimensioni e la densità delle molecole. La localizzazione fotoattivata, microscopia o palmare è una tecnica di microscopia a fluorescenza a super risoluzione facilmente implementabile.

La strumentazione è semplice, ma è necessaria un'attenta ottimizzazione dell'acquisizione e dell'analisi dei dati per generare risultati affidabili. Un altro passo cruciale è l'estensione della caratterizzazione della proteina di fusione e il livello di espressione per garantire che i risultati siano biologicamente rilevanti. Il seguente protocollo è stato ottimizzato per la proteina FTSZ fusa Muse two e dovrebbe essere adattato alla proteina di interesse.

Per iniziare, inoculare il terreno LB con una singola colonia del ceppo di interesse contenente una proteina attaccata in fluorescenza, preparata come descritto nel protocollo scritto. Accompagnando questo video, coltiva durante la notte in uno shaker a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Diluire la coltura da uno a 1000 in M nove più un terreno minimo.

Crescere fino alla fase di log medio in presenza di un antibiotico appropriato a temperatura ambiente, quindi indurre la coltura a produrre proteine con IPTG 20 micromolari per due ore. Nel frattempo, assemblare la camera di imaging producendo una soluzione agro al 3% in M nove meno il mezzo. Sciogliere gli agros a 70 gradi Celsius in un blocco termico da banco per 40 minuti.

Conservare gli agro fusi a 50 gradi Celsius per un massimo di cinque ore. Posizionare un vetrino per microacquedotto pulito nella metà superiore della camera di imaging con gli elettrodi rivolti verso il basso. Allineare la guarnizione inferiore sulla slitta del microacquedotto in modo da coprire i canali di perfusione.

Applicare circa 50 microlitri di aros fuso al centro del bicchiere. Far scorrere immediatamente la goccia di gel Agros con un vetrino coprioggetto pulito e asciutto. Lasciare solidificare il gel a temperatura ambiente per almeno 30 minuti dopo l'induzione delle proteine.

Pellettare la coltura in una microcentrifuga. Resus. Sospendere il pellet in un volume uguale di M nove più ripetere la centrifugazione e la sospensione di resus dopo la seconda sospensione di resus. Continuare la crescita a temperatura ambiente per due ore.

Successivamente, fissare la coltura indotta aggiungendo aldeide paraforme in PBS per ottenere una concentrazione finale del 4% di aldeide paraformale. Se si esegue l'imaging di cellule vive, vedere il protocollo scritto che accompagna questo video per le variazioni nella procedura, lasciare incubare la coltura a temperatura ambiente per 40 minuti. Pellettare la coltura e risospendere in un volume uguale di PBS.

Successivamente, diluire perle d'oro a 50 nanometri, da una a 10 con coltura risospesa. Per applicare il campione alla camera di imaging preparata, rimuovere con cautela il vetrino coprioggetti, lasciando il tampone in gel sul vetrino del microacquedotto. Aggiungere immediatamente un microlitro di campione di coltura cellulare sulla parte superiore del cuscinetto in gel.

Attendere circa due minuti affinché la soluzione venga assorbita dal cuscinetto in gel e ricoprire il cuscinetto in gel con un nuovo vetrino coprinte pulito e asciutto. Continuare ad assemblare l'intera camera di imaging secondo le istruzioni del produttore per l'acquisizione delle immagini. Accendi la fotocamera del microscopio e i laser.

Software di metamorfo aperto da dispositivi molecolari. Posizionare i filtri di eccitazione ed emissione appropriati nel percorso di imaging come illustrato in questo schema del microscopio, che può essere trovato nella procedura scritta che accompagna questo video. Quindi imposta le potenze del laser e le impostazioni di acquisizione.

Bloccare in modo appropriato la camera di imaging nel tavolino tramite l'adattatore per tavolino complementare. Concentrarsi sulla superficie delle celle più vicine al labbro del vetrino. Designare una regione di imaging appropriata che sia illuminata in modo omogeneo da tutti e tre i laser.

Identificare un'area del campione che contenga sia le celle che i marcatori fiduciali, che sono le perle d'oro in stretta vicinanza ma non sovrapposte. Acquisisci un'immagine in campo chiaro con un tempo di integrazione di 50 millisecondi e sposta la messa a fuoco di 0,5 micrometri nel campione. Quindi acquisire un'immagine a fluorescenza verde d'insieme con eccitazione dal laser a 488 nanometri utilizzando un tempo di integrazione di 50 millisecondi.

Successivamente, acquisisci video in streaming con illuminazione continua da laser a 405 nanometri e 561 nanometri. Per le celle fisse, viene utilizzato un frame rate di 50 millisecondi per un totale di 20.000 fotogrammi. Con la potenza del laser a 405 nanometri aumentata di circa il 10% ogni 1000 fotogrammi, vengono mostrati i primi 500 fotogrammi.

Si noti che il numero di frame acquisiti è stato ottimizzato per questo sistema e dipende dalla particolare struttura cellulare. L'etichettatura, il tasso di attivazione della densità e l'esaurimento o meno dell'intero pool di pavimenti sono importanti per l'analisi per eseguire la costruzione dell'immagine. Innanzitutto, identifica i potenziali punti nel flusso di immagini poiché tre pixel adiacenti con intensità superiori a una soglia determinata empiricamente si adattano all'intensità di ciascun potenziale punto a una funzione gaussiana bidimensionale.

Per identificare la posizione della molecola e il numero totale di fotoni emessi, calcolare la posizione di localizzazione di ciascun punto utilizzando il numero totale di fotoni rilevati. Successivamente, scartare i punti mal adattati applicando una soglia di precisione di localizzazione e rimuovere le osservazioni ripetute della stessa molecola ignorando qualsiasi punto che si trovi entro 45 nanometri e sei fotogrammi da qualsiasi punto di procedimento corretto per la deriva del campione. Sottraendo lo spostamento dipendente dal fotogramma delle perle d'oro da ciascuna posizione della molecola, ha sovrapposto tutte le posizioni corrette delle molecole su una singola immagine composta da pixel di 15 per 15 nanometri, tracciando ogni molecola unica come un'area unitaria, un profilo gaussiano bidimensionale con una deviazione standard uguale alla precisione di localizzazione.

L'immagine risultante è una mappa di densità di probabilità in cui l'intensità di un pixel è proporzionale alla probabilità di trovare una molecola. In quel Pixel illustrato. Ecco un rendering bidimensionale in super risoluzione dello ZR generato dal metodo Palm Imaging.

Qualitativamente, è stato osservato che l'anello Z è una struttura irregolare che adotta molteplici configurazioni, come bande singole o archi elicoidali che non sono distinguibili nelle immagini a fluorescenza convenzionali. Osservazioni come queste possono essere utilizzate per determinare la percentuale della popolazione cellulare che mostra una particolare configurazione strutturale. Da questo grafico è possibile misurare anche le dimensioni dello ZR.

La larghezza dell'anello è stata determinata in 113 nanometri. Questo valore è più ampio della larghezza prevista di un singolo proto filamento FDSC, che è compresa tra cinque e 10 nanometri in base alla microscopia elettronica in vitro. Qui, il diametro dell'anello è misurato come 1050 nanometri.

Questo diametro può essere utilizzato per descrivere quantitativamente il grado di costrizione durante la divisione cellulare. Un altro approccio quantitativo consiste nel calcolare la densità delle molecole contando il numero di molecole localizzate all'interno di una regione definita. Poiché le immagini del palmo sono proiezioni 2D di oggetti 3D, la riflessione interna totale o TIR Palm deve essere impiegata per limitare il piano di rilevamento a un singolo lato dell'anello Z.

Poiché le molecole tracciate rappresentano un sottoinsieme della popolazione totale di FDSC, la densità determinata è un limite inferiore della densità effettiva. La densità massima osservata nelle immagini TIR dell'anello Z suggerisce che alcune sezioni contengono proto filamenti sovrapposti. Durante questa procedura, è importante monitorare la morfologia cellulare e il tasso di crescita in modo da garantire che l'espressione della proteina di fusione non influisca sulla vitalità cellulare.

Una volta stabilita questa procedura per la proteina di interesse, può essere utilizzata per testare i cambiamenti strutturali associati alla progressione del ciclo cellulare o ulteriormente estesa all'imaging a due colori per confrontare le distribuzioni facciali di più proteine.