Name: Il saggio danneggiare il DNA in neuroni ippocampali Utilizzo del Comet Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Impara a misurare i danni al DNA nei neuroni ippocampali utilizzando il Comet Assay. Questa tecnica sensibile consente di quantificare rotture a singolo e doppio filamento mediante elettroforesi e microscopia a fluorescenza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dal Premio IMPACT del Dipartimento di Radioterapia Oncologica, University of Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, Cancer Foundation i bambini da combattimento, e la Gabrielle Angelo Foundation (a ESY.).

1. Colture Cellulari <ol><li> Cellule Cultura neuronali e trattarli come necessario. </li><li> Cellule Harvest in provette da 15 ml: i media aspirato, sciacquare con tampone fosfato salino (PBS, calcio e magnesio libero), aggiungere tripsina, raccogliere in provette da 15 ml e neutralizzare tripsina con appropriati mezzi di siero contenenti. </li><li> Centrifugare a 1.000 xg per 5 min. </li><li> Aspirare media. </li><li> Risospendere le cellule in PBS. </li><li> Centrifugare a 1.000 xg per 5 min. </li><li> Aspirare media e Risospendere le cellule in PBS fresco. </li><li> Contare le celle utilizzando un emocitometro o il vostro contatore di cellule preferito. </li><li> Campioni cellulari dovrebbe essere preparata immediatamente prima di iniziare il test. </li><li> Tutti i campioni devono essere trattati alla luce scura o gialla per evitare danni del DNA dalla luce ultravioletta. </li></ol> 2. Comet Assay 1. Preparazione del vetrino <ol><li> Sciogliere 1% agarosio (1 g / 100 ml in 1X Tris base, acido borico, EDTA, TBE) in un microonde per 3 min finché tutti granuli scompaiono. </li><li> Immergere i vetrini nella agarosio fuso e pulire un lato pulire con un Kimwipe. Permettono l&#39;agarosio al aria-secco ad un film trasparente. Questo può essere fatto in anticipo e vetrini possono essere conservati. </li></ol> 2. Comet Assay Neutral <ol><li> Freddo soluzione di lisi (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% sarcosinato di sodio lauril, e 1% Triton X-100, pH 10) a 4 ° C per almeno 1 ora prima dell&#39;uso. </li><li> 2.2.2. Fondere 1% basso punto di fusione agarosio (1 g / 100 ml in 1X Tris Base, acido borico, EDTA) in un forno a microonde per 3 min finché tutti i granuli scompaiono. L&#39;agarosio bisogno di essere raffreddato a 37 ° C in un bagno acqua per evitare induzione artificiale di tail cometa. Idealmente, l&#39;agarosio bisogno di essere raffreddato per mezz&#39;ora prima dell&#39;uso. </li><li> 2.2.3. Diluire la sospensione cellulare in modo che vi sono 100.000 cellule per ml. Combinare la sospensione cellulare con il punto di agarosio a bassa fusione (a 37 ° C) aun rapporto di 01:10 (v / v), brevemente vortice, e subito pipettare 50 pl nella diapositiva Comet. Utilizzare il lato della punta della pipetta per diffondere la sospensione cellulare uniformemente sulla superficie del campione. Ogni gruppo di trattamento deve essere almeno in triplicato. </li><li> Posto scorre appartamento in frigorifero per 30 minuti fino a un cerchio appare nella periferia della slitta. </li><li> Prechill la soluzione di lisi e Immergere vetrini in questa soluzione per 30 minuti al buio a 4 ° C (o in frigorifero). </li><li> Versare o aspirare la soluzione di lisi e aggiungere 1X tampone neutro elettroforesi (Tris base, acido borico, EDTA, 1X TBE). Lasciare vetrini in questo buffer per una mezz&#39;ora in frigorifero. </li><li> Aggiungi prechilled tampone di 1X per elettroforesi Neutral (TBE) nella camera elettroforesi, porre i vetrini in vassoio di elettroforesi diapositiva. Allineare diapositive in modo che siano equidistanti da elettrodi. </li><li> Versare 1X elettroforesi neutro buffer fino a 0,2 cm sopra le diapositive. Tampone in eccesso potrebbe, traFere con elettroforesi. </li><li> Impostare la tensione di alimentazione 1 V per cm (misurata elettrodo per elettrodo) e correre per 30 min a 4 ° C (o cella) al buio. </li></ol> 3. Comet Assay alcalino <ol><li> Freddo soluzione di lisi (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% sarcosinato di sodio lauril, e 1% Triton X-100, pH 10) a 4 ° C per almeno 1 ora prima dell&#39;uso. </li><li> Fondere 1% basso punto di fusione agarosio (1 g / 100 ml in 1X Tris Base, acido borico, EDTA) in un forno a microonde per 3 min finché tutti i granuli scompaiono. Poi raffreddare in un bagno di acqua 37 ° C per almeno 30 min. </li><li> Combinare celle a 1 x 105 / ml con fuso punto agarosio low melting (a 37 ° C) ad un rapporto di 01:10 (v / v), brevemente vortice, e subito pipettare 50 pl nella diapositiva Comet. Utilizzare il lato della punta della pipetta per diffondere la sospensione cellulare uniformemente sulla superficie del campione. Ogni gruppo di trattamento deve essere almeno in triplicato. </li><li> Luogo scivolòes appartamento in frigorifero per 30 minuti fino a un cerchio appare nella periferia della slitta. </li><li> Immergere i vetrini in una soluzione di lisi prechilled e lasciare a 4 ° C per 1 ora per una notte al buio. </li><li> Rimuovere i vetrini dalla soluzione di lisi, drenare i vetrini e sciacquarli una volta con tampone di neutralizzazione fredda per 5 minuti per rimuovere detersivo residuo e sali prima alcali-svolgitore passo. </li><li> I vetrini in una camera riempita con elettroforesi su gel elettroforesi prechilled tampone appena fatto (300 mM NaOH, 1 mM EDTA,&gt; 13 pH) non superiore a 0,5 cm sopra le diapositive. Allineare diapositive in modo che siano equidistanti da elettrodi. </li><li> Lasciate diapositive sedersi in tampone alcalino per 30 minuti al buio per consentire lo svolgimento del DNA e l&#39;espressione di alcali-responsabili danni. </li><li> Impostare la tensione di alimentazione 1 V per cm (misurata elettrodo per elettrodo) e correre per 30 min a 4 ° C (o cella). </li></ol> 4. Di fissaggio e StaCellule ra zione <ol><li> Scolare il tampone in eccesso elettroforesi </li><li> Immergere i vetrini in pre-refrigerata acqua distillata per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Immergere i vetrini in pre-refrigerati etanolo al 70% per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Campioni a secco durante la notte. Non esporre i vetrini ad una luce forte. I campioni possono essere conservati per mesi a temperatura ambiente prima di segnare in questa fase. </li><li> Colorare i vetrini immergendoli in SYBR Green (1X diluito in PBS) per 20 minuti in frigorifero. </li><li> Estrarre i vetrini e permettere loro di asciugare completamente al buio. L&#39;agarosio diventerà trasparente quando è completamente asciutto. </li></ol> 4. Acquisizione di immagini e analisi <ol><li> Acquisire immagini con microscopio a fluorescenza impostato il filtro verde (Zeiss AxioVision) e analizzare con il software Comet Assay (Strumenti percettive). </li><li> Clicca sulla &quot;testa cometa&quot; (il nucleo) e il software calcola i parametri compreso il momento coda media e la quantità di DNA nelnucleo. </li><li> Analizzare almeno 200 cellule per il trattamento. </li><li> Esportare i dati in Microsoft Excel. </li><li> Calcola media momento coda per ogni gruppo di trattamento e dati del diagramma a seconda dei casi. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Un esempio di analisi Comet assay sul neuronali è mostrato in Figura 2 e Figura 3. In questo caso, l&#39;irradiazione delle cellule neuronali induce danno al DNA. Come le cellule vengono sottoposto al campo elettrico, l&#39;DNA migra a tassi differenti a causa di differenze di dimensioni che viene successivamente analizzati utilizzando il software Assay Comet. Più il danno al DNA, più lontano il DNA migra dal nucleo. Questo diminuisce l&#39;intensità fluorescente nel nucleo che viene successivamente raccolto dal software e risultati in momento coda superiore. Tabella 1 illustra una tabella rappresentante analisi cometa dosaggio e la Figura 4 mostra un rappresentantegraph sentante confrontando danno del DNA in cellule neuronali seguendo radiazione misurata dal test della cometa. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Diagramma di flusso del test della cometa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Immagini rappresentative di cellule neuronali (A) senza e (B) con la coda della cometa. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Comet l&#39;analisi prova svolta utilizzando Assay il software Comet. (A) colpi di rappresentativi dello schermo di immagine acquisita utilizzando Carl microscopio a fluorescenza Zeiss e analizzati utilizzando CometAssay software. (B) Cliccando sul nucleo o la &quot;testa cometa&quot; (cerchiato in verde) genera una mappa fluorescente e grafico (cerchiato in giallo) e una (C) tabella di dati (cerchiato in rosso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Grafico rappresentativa ottenuta riportando il momento medio di coda ottenuto analizzando danno al DNA in cellule neuronali irradiati e non irradiati mediante saggio neutro cometa. Come previsto, le radiazioni 3GY (x-ray) induce danno del DNA come illustrato dal momento media superiore coda nelle cellule irradiate neuronali. Mostrato è il momento coda media (+ / - errore standard), ** P &lt;0.01. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049table1.jpg" alt="Tabella 1"/> Tabella 1. </strong&gt; tabella di rappresentativa ottenuta con l&#39;analisi assay cometa su cellule neuronali irradiate e non-irradiati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049table1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere più grande figura</a> .

<ol><li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li>
<li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay.+An+overview+of+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet assay. An overview of techniques.</a> Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+damage+in+individual+cells+by+analysis+of+histone+H2AX+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation.</a> Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+comet+assay+in+radiobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of the comet assay in radiobiology.</a> Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+H2AX+phosphorylation+after+exposure+to+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+B+Clin.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin.</a> Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).</li>
<li>Olive, P. L., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+DNA+damage+using+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in DNA damage using the comet assay.</a> Cytometry A. 66, 1-8 (2005).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair.</a> Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).</li>
<li>Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Genetic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a comprehensive review.</a> Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).</li>
<li>Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+kinase+3B+inhibition+enhances+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+irradiated+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons.</a> Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).</li>
<li>Yang, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium-mediated+protection+of+hippocampal+cells+involves+enhancement+of+DNA-PK+dependent+repair+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice.</a> The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).</li>
<li>Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+modulation+of+DNA+repair+in+a+human+intervention+study%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study.</a> Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).</li>
<li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li>
<li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+hOGG1%2C+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li>
<li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4(2010).</li>
<li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+sensitivity%2C+H2AX+phosphorylation%2C+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li>
<li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5DH2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).</li>
<li>Finney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+Field+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Pulsed Field Gel Electrophoresis.</a> Current protocols in molecular biology. , (2000).</li>
<li>Electrophoresis, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElectrophoresis%2C+FI+%22Pulsed-field+gel+electrophoresis%22">Pulsed-field gel electrophoresis</a>. , (2000).</li>
<li>Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il test della cometa ha la capacità unica di analizzare cellule singole. Ciò è vantaggioso in identificazione di sottopopolazioni di cellule che dimostrano risposta differenziale ad agenti citotossici. Alcune limitazioni pratiche devono essere presi in considerazione. Il numero di celle che possono essere valutati singolarmente possono variare a seconda dell&#39;individuo. La dimensione del campione deve essere aumentato se vi sono variazioni nei danni al DNA all&#39;interno di una popolazione. Vitale cella singola sosp...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> 1,5 ml provette </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc </td><td> Sc-200271 </td><td></td></tr><tr><td> 10X TBE (Tris base, acido borico, EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP13331 </td><td></td></tr><tr><td> Provetta da 15 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0553851 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> Alluminio foil </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01213101 </td><td></td></tr><tr><td> Coppa </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB102300 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004261PR </td><td></td></tr><tr><td> Comet Assay software </td><td> Comet Assay IV System Image Analysis </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cilindro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08555F </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 15575 </td><td></td></tr><tr><td> Elettroforesi camera di </td><td> Thermo Scientific </td><td> 09528101 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> A407P4 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Zeiss Axio Vision </td><td></td><td> Ogni microscopio a fluorescenza con filtro verde sarà sufficiente </td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0267152 </td><td></td></tr><tr><td> Basso punto di fusione agarosio </td><td> Promega </td><td> V2111 </td><td></td></tr><tr><td> Microonda </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato, calcio libero, magnesio libero </td><td> HyClone </td><td> SH3025601 </td><td></td></tr><tr><td> Alimentazione </td><td> BioRad </td><td> 1645050 </td><td></td></tr><tr><td> Frigorifero </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Righello </td><td> Staples </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Scorrere </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12550143 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> Soda caustica </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio lauril sarcosinato </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7585 </td><td></td></tr><tr><td> Vassoio </td><td> Fisla scientifica </td><td> 15242B </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> HyClone </td><td> SH3023601 </td><td></td></tr><tr><td> Vortice </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02216108 </td><td></td></tr><tr><td> Bagnomaria </td><td> Fisher Scientific </td><td> 154622Q </td><td></td></tr></tbody></table>

il saggio danneggiare il dna in neuroni ippocampali utilizzo del comet assay

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Un certo numero di farmaci indirizzare i percorsi di riparazione del DNA e indurre cellule uccidere con la creazione di danno al DNA. Così, i processi per misurare direttamente il danno al DNA sono stati ampiamente valutati. I metodi tradizionali sono in termini di tempo, costosa, molte risorse e richiedono cellule replica. In contrasto, il test della cometa, un unico gel test cellulare elettroforesi, è più veloce, non invasivo, economico, misura diretta e sensibile di danno e riparazione del DNA. Tutte le forme di danno al DNA e riparazione del DNA possono essere visualizzate a livello di singola cellula utilizzando questa tecnica potente. Il principio alla base del test della cometa è che il DNA intatto è altamente ordinato che i danni del DNA sconvolge questa organizzazione. Le sorgenti di DNA danneggiato nella matrice di agarosio e quando sottoposto ad un campo elettrico, il DNA carico negativamente migra verso il catodo, che è caricato positivamente. Le grandi filamenti di DNA non danneggiati non sono in grado di migrare lontano dal nucleo. Danno al DNAcrea frammenti di DNA più piccole che viaggiano oltre la DNA intatto. Comet Assay, un software di analisi delle immagini, misure e confronta l&#39;intensità complessiva fluorescente del DNA nel nucleo con il DNA che è migrata dal nucleo. Segnale fluorescente dal DNA migrato è proporzionale al danno del DNA. Coda DNA più lungo luminoso indica il danno al DNA è aumentato. Alcuni dei i parametri che vengono misurati sono momento tail che è una misura della sia la quantità di DNA e distribuzione del DNA nella lunghezza tail, tail e percentuale di DNA nella coda. Questo test permette di misurare la riparazione del DNA e da risoluzione del danno al DNA significa riparazione ha avuto luogo. Il limite di sensibilità è di circa 50 rotture di filamenti per 1,2 cellula diploide mammiferi. Cellule trattati con un qualsiasi agenti DNA dannosi come etoposide, possono essere utilizzato come controllo positivo. Così il test della cometa è una procedura rapida ed efficace per misurare la danno al DNA.

Il test della cometa è un modo efficiente di rilevare rotture a singolo e doppio filamento, compresi alcali-labili siti e DNA-DNA/DNA-protein legami incrociati sul DNA in tutte le cellule, compresi i neuroni dell&#39;ippocampo. Il metodo sfrutta la migrazione differenziale di DNA in un campo elettrico dovuto a differenze nelle quantità di danno al DNA.

Il saggio danneggiare il DNA in neuroni ippocampali Utilizzo del Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare e quantificare la quantità di danno al DNA nei neuroni utilizzando il test COMET. Ciò si ottiene esponendo prima i neuroni a varie condizioni dannose per il DNA, raccogliendo i neuroni e mescolandoli con aros a basso punto di fusione. Il secondo passo è immobilizzare i neuroni sui vetrini.Successivamente, i neuroni vengono lisati e quindi sottoposti a elettroforesi nella fase finale. Il DNA è colorato di verde cibernetico. Infine, la microscopia a fluorescenza e il software di analisi COMET vengono utilizzati per visualizzare e quantificare i livelli di danno al DNA nei singoli neuroni.Ciao, mi chiamo Eddie Yang e sono un assistente professore presso il Dipartimento di Radioterapia Oncologica dell'Università dell'Alabama a Birmingham. Oggi dimostreremo il test COMET, che è un metodo semplice per rilevare il danno al DNA nelle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti come la colorazione Gamma H a due fuochi A X, così come l'elettroforesi su gel a campo pulsato, è che questa tecnica è un metodo diretto e sensibile per misurare il danno al DNA.Inoltre, con piccole modifiche di questa tecni

assaying-dna-damage-in-hippocampal-neurons-using-the-comet-assay

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Il video mostra il test della cometa per rilevare danni al DNA in seguito all'esposizione ad agenti nocivi. In condizioni alcaline, il DNA si srotola e si denatura, e dopo l'elettroforesi, il DNA integro e danneggiato migra in modo diverso nel gel di agarosio, formando una struttura a forma di cometa. Il DNA intatto che migra lentamente forma la testa circolare della cometa, mentre i frammenti di DNA danneggiati che migrano rapidamente formano la coda allungata della cometa.

Saggio della cometa per il rilevamento del danno al DNA nelle cellule

Descriviamo qui una piattaforma che consente di rilevare test della cometa di danno al DNA con velocità senza precedenti. Il dispositivo modelli di cellule di mammifero in un microarray e consente l'elaborazione parallela di 96 campioni. L'approccio facilita l'analisi del danno al DNA livello di base, danno al DNA indotto da esposizione e di riparazione del DNA cinetica.

CometChip: A High-throughput di 96-Well Piattaforma per la misurazione dei danni cagionati DNA in cellule umane Microarrayed

Comet assay misura rotture del DNA, indotte da fattori diversi. Se tutti i fattori (ad eccezione di stress ossidativo) che causano danni al DNA sono mantenute costanti, la quantità di danni al DNA è un buon parametro indiretto dello stress ossidativo. L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare comet assay per la misura indiretta di stress ossidativo.

Comet Assay come una misura indiretta della sistemica Stress ossidativo

Il test della cometa alcalina misura le rotture del filamento di DNA nelle cellule eucariotiche. Aggiungendo una fase di digestione dell'endonucleasi III o dell'8-ossoguanina-DNA-N-glicosilasi umana, il test è in grado di rilevare in modo efficiente il danno ossidativo al DNA. Descriviamo i metodi per utilizzare questi saggi per rilevare il danno al DNA nel fegato di ratto.

In Vivo alcalina Comet Assay e l&#39;enzima modificato alcalina Comet Assay per la misurazione rotture del DNA Strand e danno ossidativo del DNA in fegato di ratto

Il test della cometa è un metodo efficace per rilevare danni al DNA compreso singolo e doppio filamento di DNA si rompe. Descriviamo la cometa alcalino e neutro saggi per misurare il danno del DNA in cellule di cancro per valutare l'effetto terapeutico della chemioterapia.

Valutazione In Vitro del DNA danni utilizzando test della cometa

Questo protocollo descrive diverse procedure per la preparazione di campioni di tessuto congelato di alta qualità al momento della necroscopia per l'uso nel saggio della cometa per valutare il danno al DNA: 1) tessuto macinato, 2) cellule epiteliali raschiate dal tratto gastrointestinale e 3) tessuto immatolato campioni, richiedendo l'omogeneizzazione utilizzando un dispositivo di mincing dei tessuti.

Uso di tessuto congelato nel saggio Cometa per la valutazione del danno del DNA

Il saggio della cometa è un mezzo popolare per rilevare danni al DNA. Questo studio descrive un approccio per eseguire diapositive in varianti rappresentative del saggio della cometa. Questo approccio ha aumentato significativamente il numero di campioni diminuendo il tempo di esecuzione del test, il numero di manipolazioni dei vetrini e il rischio di danni ai gel.

Un approccio di analisi delle comete ad alto rendimento per la valutazione del danno al DNA cellulare

Questo protocollo descrive un metodo efficace per quantificare la differenza nel danno al DNA indotto da inibitori di tipo I e di tipo II nelle cellule mutanti FLT3 attraverso l'applicazione del saggio della cometa.

Saggio della cometa per quantificare il danno al DNA nelle cellule 32D che esprimono mutanti FLT3 dopo l'esposizione a inibitori FLT3 di tipo I e II

Saggio β-amiloide tossicità utilizzando un transgenici C. elegans Modello

Noi descriviamo un protocollo che permette l'imaging di mitocondri in vita i neuroni tramite microscopia a fluorescenza su durate lunghe. Imaging per lunghi periodi si realizza attraverso lentivirus-mediata espressione di una proteina fluorescente mitocondri mirata e l'uso di un poco costoso stadio-top incubatore che è stato progettato e costruito nel nostro laboratorio.

Neuromodulazione e mitocondriale di trasporto: Imaging Live in neuroni dell&#39;ippocampo oltre durate a lungo

Impara a misurare i danni al DNA nei neuroni ippocampali utilizzando il Comet Assay. Questa tecnica sensibile consente di quantificare rotture a singolo e doppio filamento mediante elettroforesi e microscopia a fluorescenza.

Il saggio danneggiare il DNA in neuroni ippocampali Utilizzo del Comet Assay

Esplora altri video