Il saggio danneggiare il DNA in neuroni ippocampali Utilizzo del Comet Assay

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare e quantificare la quantità di danno al DNA nei neuroni utilizzando il test COMET. Ciò si ottiene esponendo prima i neuroni a varie condizioni dannose per il DNA, raccogliendo i neuroni e mescolandoli con aros a basso punto di fusione. Il secondo passo è immobilizzare i neuroni sui vetrini.

Successivamente, i neuroni vengono lisati e quindi sottoposti a elettroforesi nella fase finale. Il DNA è colorato di verde cibernetico. Infine, la microscopia a fluorescenza e il software di analisi COMET vengono utilizzati per visualizzare e quantificare i livelli di danno al DNA nei singoli neuroni.

Ciao, mi chiamo Eddie Yang e sono un assistente professore presso il Dipartimento di Radioterapia Oncologica dell'Università dell'Alabama a Birmingham. Oggi dimostreremo il test COMET, che è un metodo semplice per rilevare il danno al DNA nelle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti come la colorazione Gamma H a due fuochi A X, così come l'elettroforesi su gel a campo pulsato, è che questa tecnica è un metodo diretto e sensibile per misurare il danno al DNA.

Inoltre, con piccole modifiche di questa tecnica, il tipo di danno al DNA può essere determinato perché molte terapie antitumorali agiscono inducendo danni al DNA nei tumori e spesso agiscono alterando la capacità di riparazione del DNA. Le implicazioni di questa tecnica possono essere estese all'efficacia della terapia del cancro. A dimostrare la procedura oggi sarà la signora Samara Noshin, un'assistente di ricerca del mio laboratorio, che inizierà raccogliendo cellule neuronali trattate nelle circostanze sperimentali desiderate in provette da 15 millilitri.

Far girare le provette per cinque minuti a 1000 volte G e quattro gradi Celsius dopo aver aspirato il resus. Sospendere il pellet in PBS e poi far girare nuovamente le celle dopo il secondo lavaggio. Resus sospende le cellule in più PBS, le conta e le tiene al buio fino a quando non vengono utilizzate nel test della cometa.

Per evitare danni al DNA prima di iniziare il come, sciogliere l'1%aros in un forno a microonde per tre minuti fino a quando tutti i granuli scompaiono. Quindi immergere i vetrini negli agros fusi e pulire un lato con una salvietta Kim. Lasciare asciugare l'agros all'aria fino a ottenere una pellicola trasparente mentre l'agros essicca la soluzione di lisi a freddo a quattro gradi Celsius per almeno un'ora e sciogliere di più.

1% agro a basso punto di fusione. Bello. Questo lotto di agros a 37 gradi Celsius a bagnomaria per mezz'ora. Per evitare l'induzione artificiale di una coda di cometa, ora diluire la sospensione di cellule neuronali raccolte in modo che ci siano 100.000 cellule per millilitro.

Combinare brevemente la sospensione cellulare con gli agro a basso punto di fusione a 37 gradi Celsius in un vortice con rapporto da uno a 10 e utilizzare immediatamente il lato di una punta di pipetta per distribuire uniformemente 50 microlitri di sospensione cellulare sull'area del campione del vetrino cometa essiccato all'aria. Posizionare i vetrini trattati in frigorifero per 30 minuti fino a quando non appare un cerchio alla periferia del vetrino. Quindi immergere i vetrini nella soluzione di lisi pre-raffreddata al buio a quattro gradi Celsius.

Dopo 30 minuti, aspirare la soluzione di lisi. Quindi incubare i vetrini in un tampone neutro per elettroforesi per mezz'ora in frigorifero. Quindi, aggiungere un tampone per elettroforesi neutro pre-raffreddato a una camera di elettroforesi, quindi posizionare i vetrini nel vassoio per vetrini per elettroforesi, allineando i vetrini in modo che siano equidistanti dagli elettrodi.

Dopo aver riempito la camera abbastanza da coprire i vetrini con 0,2 pollici di un tampone neutro per elettroforesi, impostare la tensione di alimentazione a un volt per centimetro ed eseguire il test al buio per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Iniziare immergendo nuovi agro e vetrini trattati con cellule neuronali in una soluzione di lisi fresca pre-raffreddata, quindi incubarli al buio a quattro gradi Celsius per un'ora o tutta la notte. Quindi, rimuovere i vetrini dalla soluzione di lisi, scolarli e quindi sciacquarli una volta con un tampone di neutralizzazione a freddo per cinque minuti per rimuovere eventuali residui prima della fase di avvolgimento alcalino.

Quindi posizionare i vetrini in una camera di elettroforesi su gel riempita con tampone per elettroforesi pre-raffreddato e appena fatto per non superare 0,5 centimetri sopra i vetrini. Incubare i vetrini nel tampone alcalino per 30 minuti al buio per consentire lo svolgimento del DNA e l'espressione del danno soggetto ad alcali. Quindi eseguire il test a un volt per centimetro per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo aver eseguito il saggio della cometa, drenare il tampone per elettroforesi in eccesso e quindi immergere i vetrini in acqua distillata pre-raffreddata a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, immergere i vetrini in etanolo pre-raffreddato al 70% anche a temperatura ambiente. Dopo altri cinque minuti, impostare i campioni in modo che si asciughino durante la notte, tenendoli lontani dalla luce intensa.

Quindi colorare i vetrini in verde cyber in frigorifero per 30 minuti. Ora togliete i vetrini e lasciateli asciugare completamente al buio. Gli aros diventeranno trasparenti quando saranno completamente asciutti.

Per acquisire le immagini dal saggio, utilizzare un microscopio a fluorescenza impostato sul filtro verde. Quindi aprire il programma di analisi COMET per analizzare le immagini acquisite. Facendo clic sul pulsante della testa della cometa, il software calcolerà i parametri tra cui il momento medio della coda e la quantità di DNA nel nucleo.

Dopo aver analizzato almeno 200 cellule per trattamento, esportare i dati in Microsoft Excel per il calcolo del momento di coda medio e la rappresentazione grafica dei dati. Questa prima figura mostra un esempio di analisi COMET di cellule neuronali con e senza coda di cometa. In questo secondo saggio su cometa analizzato utilizzando il software di analisi COMET, è stato determinato che l'irradiazione delle cellule neuronali induce danni al DNA quando le cellule sono state sottoposte al campo elettrico.

Il DNA è migrato a velocità diverse a causa delle differenze di dimensioni, come successivamente analizzato con il comune software di analisi. Questa prima schermata mostra immagini rappresentative acquisite utilizzando il microscopio a fluorescenza utilizzando il programma di analisi COMET. Facendo clic sul nucleo o sulla testa della cometa di un'immagine si generava un grafico a fluorescenza e una tabella di dati.

Maggiore è il danno al DNA, più il DNA è migrato fuori dal nucleo. Ciò ha comportato una diminuzione dell'intensità della fluorescenza nel nucleo, come indicato dal colore verde, e viene successivamente rilevata dal software producendo un momento di coda più elevato. In questa figura finale, un grafico rappresentativo del momento medio di coda ottenuto analizzando il danno al DNA in cellule neuronali irradiate e non irradiate utilizzando un saggio COMET neutro è mostrato come previsto tre danni al DNA indotti da radiazioni grigie, come indicato dal momento medio di coda più elevato nelle cellule neuronali irradiate.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di maneggiare le celle con cura evitando l'esposizione alla luce diretta e controllare la temperatura del pH. In questo modo le cellule non sono sottoposte a stress aggiuntivo, che potrebbe alterare i risultati Dopo questa procedura. Altri metodi, come l'analisi del DNA, i focolai di riparazione tramite colorazione in immunofluorescenza possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande su quali percorsi di riparazione del DNA sono alterati.

Ad esempio, la colorazione immunofluorescente per focolai RAD 51 o fosfo, i focolai di farmacocinetica del DNA possono essere eseguiti per misurare rispettivamente la riparazione di ricombinazione omologa o non omologa e la riparazione di unione.