Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Questo sistema sperimentale offre una metodologia ad alto rendimento per il monitoraggio della citotossicità mediata dalle cellule T a livello di singola cellula. Innanzitutto, etichettare le cellule T effettrici e le cellule bersaglio tumorali con coloranti fluorescenti. Caricare entrambi i tipi di celle sugli array di nano pozzetti e immergere l'intero chip in un terreno contenente verde cyt e nexina marcata in modo fluorescente. Cinque.

Al fine di identificare sia le cellule necrotiche che quelle apoptotiche, è ora possibile registrare una pre-immagine iniziale per determinare l'occupazione del pozzetto e la vitalità cellulare all'inizio del saggio. Dopo un'incubazione di sei ore, registrare una seconda immagine. Quindi utilizzare l'analisi automatizzata delle immagini per quantificare la lisi antigene-specifica di EL quattro cellule T CD 19 positive da parte di cellule T car positive.

I risultati ottenuti da questo metodo ad alto rendimento possono schermare la lisi antigene-specifica di bersagli da parte di cellule effettrici sulla base di una colorazione positiva con citossina. Cinque. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il test di rilascio del cromo 51 è che è possibile ottenere vere interazioni bersaglio efficaci uno-a-uno e misurare la frequenza del satellite L'implicazione di questa tecnica si estende a quale terapia del cancro perché consente di studiare i correlati di efficacia nella terapia cellulare autologa Per fabbricare nano pozzetti utilizzando il master di silicio prima mescolare accuratamente la base del kit di elastomeri cigar 180 4 e l'agente indurente a un Rapporto di peso di 10 a uno in una tazza usa e getta utilizzando un coltello di plastica. Degassare la miscela in una camera a vuoto per un'ora.

Quindi versare il composto sul master in silicone e lasciarlo riposare per 30 minuti. Ora per polimerizzare l'elastomero, riscaldare l'assemblaggio in un forno a 80 gradi Celsius per due ore dopo averlo raffreddato a temperatura ambiente per un'ora. Rimuovere con cautela l'array di pozzetti nano PDMS dal master in silicio.

Coprirlo con scotch fino all'uso un giorno prima dell'esperimento passare 5 milioni di cellule bersaglio in cinque millilitri. Il giorno dell'esperimento. Pellettare 5 milioni di cellule in una provetta conica sterile da 15 millilitri mediante centrifugazione a 340 Gs per cinque minuti.

Aspirare il terreno in eccesso lasciando circa 50 microlitri di terreno per etichettare le cellule. Aggiungere 150 microlitri della soluzione di lavoro rossa fresh cell tracker e mescolare accuratamente utilizzando una pipetta P 200, incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Utilizzando un emocitometro, enumerare le cellule effettrici raccolte dalla coltura.

Quindi pellettare 5 milioni di cellule in una provetta conica sterile da 15 millilitri mediante centrifugazione. Aspirare il fluido in eccesso. Quindi aggiungere una soluzione di lavoro fresca di cinque micromolari vibranti D ciclo viola colorante e sospendere il resus utilizzando una pipetta P 200.

Incubare le cellule e farle morire per 20 minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica a 6,8 millilitri e 6,0 millilitri di R-P-M-I-P-L-G-H rispettivamente per le cellule bersaglio ed effettrici e mescolare mediante pipettaggio. Quindi stratificare lentamente 3,5 millilitri di fial pack plus sul fondo di ciascuna provetta, centrifugare entrambe le provette a 340 GS per 30 minuti senza interruzioni e accelerazioni durante la centrifugazione, preparare l'array di nano pozzetti Per prima cosa trasferire sette millilitri di PBS prebellico su una piastra a quattro pozzetti. Pulire il fondo del vetrino con etanolo utilizzando un ossidante al plasma.

Trattare il PDMS con un'impostazione RF alta per 30-45 secondi. Quindi posizionare l'array nel PBS. Trasferire la piastra in una cabina di biosicurezza e aspirare il PBS in eccesso, applicare l'agar nobile caldo all'1% sui bordi superiore e inferiore del vetrino per immobilizzare l'array.

Assicurati di non lasciare asciugare il PDMS dopo 10 minuti a tre millilitri di PBS e aspira l'agar in eccesso. Quindi aggiungere tre millilitri di R 10 sulla parte superiore dell'array di nanopozzetti ed equilibrare per circa 10 minuti. Dopo la centrifugazione Fial, aspirare cinque millilitri di terreno dallo strato superiore di ciascuna provetta.

Facendo attenzione a non aspirare lo strato contenente le cellule con una pipetta P 1000. Raccogli lo strato bianco di cellule tra il fial e il terreno. Trasferire le cellule in nuove provette coniche sterili.

Ora lavate due volte l'effettore raccolto e le cellule bersaglio con tre millilitri di R-P-M-I-P-L-G-H. Dopo la centrifugazione finale, aspirare il terreno in eccesso e risospendere il pellet di cellule. In 500 microlitri di R 10, contare le cellule vitali utilizzando il metodo di esclusione del blu trian su un emocitometro e aspirare il terreno in eccesso dall'array di nano volontà.

Quindi aggiungere due millilitri di aspirato R 10 fresco. Ancora una volta, assicurarsi che la parte superiore del nano non sia né troppo bagnata né troppo asciutta in quanto influenzerà la distribuzione delle cellule. Ora depositare una volta da 10 a un quinto delle cellule del fector in 200 microlitri di R 10 sulla superficie dell'array nano will ha permesso alle cellule di depositarsi per cinque minuti.

Quindi, utilizzando un microscopio standard per colture tissutali, verificare la distribuzione desiderata delle cellule. Successivamente, depositare una volta 10 alla quinta cellula bersaglio in 200 microlitri di R 10 sulla superficie dell'array di nano pozzetti contenente le cellule effettrici. Dopo cinque minuti, valutare la distribuzione cellulare al microscopio.

Quindi sciacquare accuratamente l'array nano well con due millilitri di R 10 e aspirare il terreno in eccesso in una provetta conica sterile separata da 15 millilitri. Pipettare tre millilitri di preriscaldamento R 10 a tre microlitri di cyt 0,5 millimolare, colorazione verde dell'acido nucleico e 60 microlitri di X in cinque LOR 6 47 miscelati accuratamente mediante pipettaggio. Ora pipettare delicatamente la soluzione colorante sulla piastra a quattro pozzetti, assicurandosi che le cellule non vengano spostate dai pozzetti incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius, il 5% di anidride carbonica acquisire immagini dell'array di nano pozzetti utilizzando un microscopio a fluorescenza come il microscopio zes observer Z one, dotato di un tavolino motorizzato e Lambda DG quattro.

Inizializzare il software e il microscopio. Controllare l'intensità del segnale sulla luce trasmessa e sugli altri canali fluorescenti. Regolare la configurazione del microscopio per garantire il massimo rapporto segnale/rumore evitando la saturazione.

Ora apri l'elenco delle posizioni x e Y per l'array nelle. Imposta la posizione zero XY e azzera il fuoco al centro di un blocco di matrice sette per sette nell'angolo in alto a sinistra del timbro dell'array di nelle. Imposta le posizioni XY in modo che coincidano con il centro di ciascun blocco e il valore Z per riflettere accuratamente la messa a fuoco su ciascun blocco.

Ora impostare l'acquisizione dell'immagine in modalità lineare e acquisire le immagini. Dopo la prima serie di imaging, rimettere gli array di nano pozzetti nell'incubatore per colture cellulari per sei ore. Prendersi cura dell'agitazione può portare allo spostamento cellulare.

Quindi ripetere l'acquisizione delle immagini al secondo punto temporale. Questo test citolitico ad alto rendimento misura la frequenza della lisi antigene-specifica marcata con CD19 cellule T CAR positive marcate con cellule bersaglio EL marcate con quattro cellule bersaglio di topo nei singoli pozzetti di un nano array L. I grafici dell'istogramma della cellula bersaglio rappresentano pozzetti contenenti una singola cellula effettrice e una singola cellula bersaglio.

Dopo sei ore di co-incubazione, sono stati utilizzati istogrammi abbinati di cellule bersaglio senza effettori come controlli negativi per riportare la frequenza di morte cellulare di fondo. È auspicabile raggiungere basse frequenze di lisi non specifica nell'intervallo da due a 4%L'array di nano pozzetti può essere adattato per l'imaging time-lapse per consentire l'osservazione dell'effettore, della coniugazione del bersaglio e della successiva morte cellulare. Qui, le cellule T car positive non marcate sono state co-incubate con sei cellule bersaglio di NA LM GFP in un NOL e sottoposte a monitoraggio dinamico.

Quando un Xin cinque è stato aggiunto al terreno di coltura, le cellule apoptotiche etichettano in rosso una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita correttamente in 10-12 ore dopo questa procedura. Altri metodi, come il micro grabbing, possono essere utilizzati per determinare il profilo di secrezione di citochine delle cellule.