C. elegans Chemiotassi Assay

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare la risposta chemiotattica di C elegans utilizzando un test semplice ed economico. Questo viene ottenuto isolando vermi in fase avanzata e posizionandoli al centro di una piastra marcata. A distanza uguale da tutti i siti di test e controllo depositati su ciascun sito c'è un composto di interesse o un composto di controllo, entrambi combinati con un anestetico che fermerà i vermi mentre si avvicinano.

Dopo 60 minuti, si conta la distribuzione finale dei vermi sulla piastra e il rapporto delle posizioni dei vermi viene utilizzato per fornire un indice di saggio. In definitiva, la quantificazione dell'attrazione di sea elegans verso certi composti può essere utilizzata per valutare le conseguenze comportamentali delle manipolazioni sperimentali sottostanti. Il principale vantaggio di questa tecnica è che include molti aspetti benefici dei suoi predecessori, consentendo al contempo una maggiore facilità d'uso.

Questo saggio fornisce informazioni sul comportamento di sea elegans ed è particolarmente utile in combinazione con manipolazioni neurogenetiche e altri saggi neurobiologici. Iniziare con piastre da cinque centimetri caricate con agar chemotattico o NGM. Marcate il lato inferiore delle piastre in quattro quadranti uguali.

Preparare almeno tre piastre per almeno tre tentativi per ogni ceppo genetico in prova e per ogni condizione testata. Poi, tracciare un cerchio con un raggio di 0,5 centimetri intorno all'origine. Quindi, segnare punti nei quadranti opposti con una T per test o una C per controllo, assicurandosi che i siti siano equidistanti dall'origine e l'uno dall'altro.

I punti devono essere almeno a due centimetri dall'origine per questo saggio. Avere vermi giovani adulti preparati in sviluppo sincronizzato su piastre di chemotassi da cinque centimetri. I vermi che si trovano in diverse fasi di sviluppo possono rispondere in modo diverso agli analiti.

Di conseguenza, è molto importante che tutti i vermi impiegati nel saggio siano nella stessa fase di sviluppo. Una volta che i vermi hanno eliminato una falda di OP 50 e coli, pipettare due millilitri di tampone basale S sulla piastra. Manipolare la piastra per far entrare tutti i vermi nel tampone per lavare i vermi.

Pipettare un millilitro dei vermi in tampone in un tubo di microcentrifugazione e centrifugare per 10 secondi. Utilizzando una pico fuge a 6.600 RPM, aspirare l'as basil, lasciando il pellet di vermi indisturbato. Ora lavare questi vermi altre tre volte utilizzando lo stesso metodo.

Iniziare aggiungendo il basil S al tubo e capovolgere il tubo per rimettere i vermi in soluzione. Dopo l'ultimo lavaggio, centrifugare i vermi per altri 10 secondi e poi aspirare il surnatante a un volume finale di 100 microlitri. Successivamente, assicurarsi una densità sufficiente di vermi pipettando due microlitri dei vermi lavati dal pellet su una piastra NGM.

Ci devono essere almeno 50 vermi, ma non più di 250 vermi. Se ci sono troppi vermi, aumentare il volume della soluzione ESP basil. E se ci sono troppo pochi vermi, centrifugarli e sospenderli nuovamente in un volume inferiore.

Mettere il tubo dei vermi in un cappa aspirante. Una volta preparati, i vermi sono pronti per essere utilizzati nel saggio di chemotassi per un massimo di un'ora. Per prima cosa, preparare le soluzioni.

Mescolare la soluzione di test combinando volumi uguali del composto di test con l'anestetico azide 0,5 molare. Quindi, mescolare una soluzione di controllo del solvente utilizzato per diluire il composto di test con azide di sodio 0,5 molare. Ora preparare una piastra di test.

Prima pipettare due microlitri di soluzione di vermi dal pellet sull'origine di una piastra di test. Secondo, aggiungere gli odoranti pipettare due microlitri della soluzione di test sui due siti T e pipettare due microlitri della soluzione di controllo sui due siti T. Una volta che i vermi e le gocce di odorante sono stati assorbiti nell'agar, sostituire i coperchi, capovolgere le piastre e lasciare trascorrere 60 minuti per il tempo di saggio.

Per il tempo di diffusione di ASI di sodio deve essere standardizzato tra i tentativi. È importante che i vermi siano aggiunti immediatamente prima degli odoranti.

Anche ogni piastra dovrebbe essere completamente preparata e l'inizio del saggio dovrebbe avvenire prima di preparare la successiva piastra. Dopo il tentativo di 60 minuti, posizionare i vermi in un frigorifero a quattro gradi Celsius. Più tardi, rimuovere la piastra dal frigorifero quando può essere contata.

Non contarli immediatamente e lasciare i vermi a temperatura ambiente potrebbe permettere loro di mobilitarsi. Ancora. Registrare la posizione dei vermi che hanno completamente attraversato il cerchio interno dai dati. Calcolare l'indice di chemotassi.

Il valore varierà da meno uno a più uno, rappresentando la massima repulsione alla massima attrazione. Ripetere il processo utilizzando la soluzione di controllo sia nei quadranti di test che di controllo. Questo fungerà da piastra di controllo. Tre.

Tali piastre dovrebbero essere realizzate e eseguite per ogni condizione sperimentale. Diacetile. Un noto chemo attrattivo di C elegans è stato utilizzato per confrontare vermi di tipo selvatico con mutanti che non possiedono il recettore per il diacetile. Come previsto, il diacetile ha elicitato una significativa risposta chemo attraente da parte dei vermi di tipo selvatico.

Al contrario, i mutanti ODR 10 non erano più attratti dal diacetile come lo erano dal composto di controllo etanolo Una volta padroneggiata. Questa tecnica può essere completata in meno di 90 minuti se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare in modo efficiente la risposta chemiotattica di sea elegans alle soluzioni di analiti.

Prestare particolare attenzione per assicurarsi che tutti i vermi testati raggiungano uno stadio sincronizzato di sviluppo e che sia impiegato un numero sufficiente di vermi. Ogni tentativo.