Name: Gli antigeni Protetto funzionali globuli rossi dalla membrana innesto di Compact Poligliceroli Hyperbranched (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Scopri come modificare i globuli rossi con poliglicerolo iperramificato per proteggere gli antigeni di superficie. Questo metodo migliora la compatibilità delle trasfusioni e la conservazione del sangue.

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Questa ricerca è stata finanziata dal Canadian Blood Services (CBS) e gli Istituti di Scienze della Salute canadese (CIHR) Fondo di ricerca di partenariato. Gli autori ringraziano l&#39;hub LMB macromolecola presso il Centro UBC per la ricerca del sangue per l&#39;uso delle loro strutture di ricerca. La struttura infrastruttura è sostenuto dalla Fondazione canadese per l&#39;innovazione (CFI) e Michael Smith Fondazione per la ricerca sulla salute (MSFHR). R. Chapanian è un destinatario di (CIHR / CBS) borse di studio post-dottorato in Scienze trasfusione e un destinatario dell&#39;assegno di ricerca posta MSFHR tirocinante dottorato. JN Kizhakkedathu è un destinatario del Premio alla Carriera Scholar Investigator MSFHR.

A. Modifica poliglicerolo Hyperbranched (SS-HPG) <ol><li> Posto liofilizzato HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) in un pallone a fondo tondo e asciugare una notte sotto vuoto a 90 ° C. </li><li> Refrigerare il matraccio a temperatura ambiente, e sciogliere il HPG essiccato in piridina anidra (3 ml). </li><li> Per funzionalizzare circa otto gruppi ossidrilici su HPG con gruppi carbossilici, aggiungere quantità catalitica di dimetilamminopiridina (una goccia di 5 mg / ml di soluzione in piridina) alla soluzione HPG. A questa miscela, aggiungere anidride succinica, (0,0067 g, 0,0664 mmol) sciolto in 0,5 ml di piridina saggio goccia in 10 minuti. Agitare la miscela per una notte a temperatura ambiente sotto argon. </li><li> Precipitare il composto in 40 ml di acetone freddo (4 ° C) in un tubo da centrifuga da 50 ml e centrifugare utilizzando un Beckman J2-MC centrifugare a 27.000 xg per 15 min. Decantare il supernatante, e rimuovere acetone residuo mediante flussaggio con argon a temperatura ambiente. </li><li> Per attivare il carbossil con gruppi succinimidil succinato (SS) gruppi, sciogliere il carbossile-funzionalizzato HPG in 3 ml di DMF anidra. Aggiungere N-idrossisuccinimmide (0,0077 g, 0,0664 mmoli) e N, N&#39;-diisopropilcarbodiimmide (0,0084 g, 0,0664 mmoli) alla soluzione HPG e agitare la miscela per una notte a temperatura ambiente sotto argon. </li><li> Purificare il SS-HPG per precipitazione in acetone freddo. </li><li> Rimuovere residui di acetone mediante flussaggio con argon. </li><li> Determinare la purezza HPG modificato e il grado di funzionalizzazione carbossile e SS dal protone (1 H) - analisi NMR. </li></ol> B. raccolta di sangue intero e la separazione dei globuli rossi (RBC) <ol><li> Raccogliere il sangue intero (40% Ematocrito, 3 ml) da acconsentito donatori umani sani in una provetta vacutainer citrato. </li><li> Centrifugare la provetta citrato a 1.000 xg per 4 min. </li><li> Rimuovere il surnatante contenente plasma e piastrine, e la mano intermedia buffy che contiene i globuli bianchi e platelets usando una pipetta Pasteur. </li><li> Trasferire i globuli rossi imballati (80 Ematocrito%, 1,2 ml) in una centrifuga tubo da 12 ml Falcon, e aggiungere tampone PBS (8 ml, pH = 8.0) per lavare i globuli rossi. </li><li> Mescolare globuli rossi per inversione di ottenere una distribuzione uniforme delle cellule. </li><li> Centrifugare la provetta Falcon a 1.000 xg per 4 minuti e rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare i globuli rossi con PBS due volte ripetendo i passaggi 5 e 6. </li><li> Luogo imballato-GR (100 pl) in 1.6 ml di tubo Eppendorf, e aggiungere tampone PBS (300 ml, pH = 8.0) per ottenere 20% di globuli rossi ematocrito. </li></ol> C. HPG innesto di globuli rossi <ol><li> Subito dopo precipitazione di HPG modificato in acetone in A6 passo, posto SS-HPG (150 mg) in una fiala di vetro (1 DRAM), e farla sciogliere in tampone PBS (300 pl, pH = 8,0). </li><li> Aggiungere SS-HPG soluzione di polimero in 20% Ematocrito globuli rossi lavati per ottenere un volume finale di 400 microlitri e SS-HPG concentrazione che va da 0,5 mm a 3 mm. Ad esempio, per preparare i globuli rossi trattati con 0.5 mM SS-HPG, rimuovere 36 microlitri di PBS dal lavato RBC e mettere 36 ml di SS-HPG soluzione polimerica. </li><li> Vortex la sospensione delicatamente e posizionare i tubi Eppendorf in un agitatore orbitale a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Centrifugare le provette Eppendorf a 1.000 xg per 4 min, e pipettare il supernatante. </li><li> Aggiungere 1 ml di PBS per lavare eritrociti, centrifugare e rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione salina e lavare due volte globuli rossi come al punto 5. </li><li> Aggiungere 300 ml di soluzione salina per 100 pl di RBC confezionati (80 Ematocrito%) ad una concentrazione finale del 20% di ematocrito. </li></ol> Caratterizzazione D. HPG Modificata globuli rossi I. Complemento lisi mediata <ol><li> Raccogliere circa 8 ml di sangue intero da donatori umani sani in provetta BD Vacutainer vetro siero, e permettere al sangue di coagulare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Centrifugare la provetta a 2000 xg per 10 minuti e raccogliere circa 3 ml di siero. </li><li> Un millilitro di serum è stato posto in un bagno di acqua a 60 ° C per 30 minuti per preparare siero inattivato al calore. </li><li> Aggiungere 60 ml di siero fresco o di calore siero inattivato in una provetta Eppendorf che contiene 60 ml di 20% di ematocrito RBC HPG modificati o di globuli rossi non modificati. </li><li> Incubare RBC per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Per quantificare la quantità di emoglobina nella sospensione cellulare, posto 5,9 ml di 20% di ematocrito HPG RBC modificati o non modificati cellule in triplicato a 96 pozzetti. Aggiungere 294 pl di reagente Drabkin (un reagente che viene utilizzato per quantificare la quantità di emoglobina spectrophotomerically). Mescolare celle con reagente Drabkin di pipettando dentro e fuori. Misurare l&#39;assorbanza della cyanoderivative emoglobina a 540 nm usando SPECTRA max 190 lettore di piastre. </li><li> Per quantificare la quantità di emoglobina nel sovranatante, centrifugare le cellule a 13.000 xg per 1 min. Posto 50 pl di surnatante in triplicato in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 250 microlitri di reagente di Drabkin. Cellule Mix tra il reagente di Drabkinpipettando dentro e fuori. Misurare l&#39;assorbanza della cyanoderivative emoglobina a 540 nm usando SPECTRA max 190 lettore di piastre. </li><li> Quantificare la quantità di cellule lisate dal rapporto di emoglobina nel surnatante (passo 7) e dell&#39;emoglobina totale nel campione (passo 6) 8, 11, 12. </li></ol> II. Il camuffamento di antigeni maggiori e minori che utilizzano carte di MTS <ol><li> Posto 50 pl di HPG modified RBC (10% di ematocrito) in una provetta Eppendorf, centrifugare a 1000 xg per 1 minuto, e rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere 110 pl di MTS diluente al pellet e omogeneizzare la sospensione cellulare da pipettando. </li><li> Aggiungere 11 ml di sospensione cellulare a ogni colonna di gel mini. Evitare di toccare il gel durante l&#39;aggiunta. </li><li> Individuare le carte MTS in un titolare della carta centrifuga e centrifugare a 156 xg per 6 min. </li><li> Protezione degli antigeni di superficie è determinata dalla posizione della RBC nella colonna di gel mini, basato sulla fabbricazioner descrizione. </li></ol> III. Acquose, due di fase partizioni misurazioni <ol><li> Preparare Destrano 500 kDa / PEG 8 kDa due sistemi di separazione di fase composto (5% destrano 500k, 4% PEG 8K, 150 mM NaCl, 10 mM di fosfato) secondo 13. </li><li> Centrifugare a 433 xg per 10 min a temperatura ambiente per ottenere un sistema a due fasi (destrano in basso). </li><li> Separare le due fasi con attenzione. </li><li> Aliquota 1,0 ml della fase di PEG superiore in una provetta (con fondo concavo), aggiungere 20 ml di 20% di ematocrito HPG modificato RBC, e le cellule Mescolare delicatamente sfogliando. </li><li> Aggiungere 0,5 ml della fase superiore che contengono celle a 0,5 ml di una fase inferiore, il sistema e mescolare delicatamente sfogliando. </li><li> Posizionare il tubo sul banco per ~ 2 min per il sistema di separare, e determinare la posizione delle celle nel sistema. Localizzazione di globuli rossi (in fase di PEG superiore, nella fase inferiore destrano o in entrambi) è funzione del grado di modifica e molecolarepeso di HPG. </li></ol> IV. Misure di fragilità osmotica <ol><li> Preparare soluzioni di NaCl con concentrazioni che vanno da 0 a 0,9 (w / v)%. </li><li> Luogo 0,4 ml di soluzioni di NaCl in 1,5 ml provette Eppendorf. </li><li> Aggiungere 20 ml di globuli rossi (ematocrito 20%) nelle soluzioni di NaCl. </li><li> Cellule Mescolare con cura per inversione e metterli in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 30 min. </li><li> Sospendere le cellule con attenzione per inversione. Prendere 50 pl di sospensione di RBC e aggiungerlo a un reagente 1 ml Drabkin, posta in una cuvetta. Mescolare celle con reagente Drabkin di pipettando dentro e fuori. Misurare l&#39;assorbanza della cyanoderivative emoglobina a 540 nm usando BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS lettore. </li><li> Per quantificare la quantità di emoglobina nel sovranatante, centrifugare le cellule a 1.000 xg per 1 min. Aggiungere 200 pl di surnatante a 1 ml di reagente Drabkin in una cuvetta. Mescolare celle con reagente Drabkin di pipettando dentro e fuori. Misurare l&#39;assorbanza della hemoglObin cyanoderivative a 540 nm usando BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS lettore. </li><li> Calcolare la quantità di cellule lisate in soluzione di NaCl diverso dal rapporto tra la quantità di emoglobina nel surnatante (passo 6) per la quantità totale di emoglobina nella sospensione cellulare (fase 5). </li></ol> V. misure di flusso di citometria - Protezione dei Rh-D (Rh) antigene <ol><li> Aggiungere 5 l di controllo o HPG RBC modificati (20% di ematocrito) in triplicato per tampone PBS supplementato con 0,5% BSA ad un volume totale di 25 microlitri. </li><li> Aggiungere 25 ml di FITC monoclonale anti-Rhesus D (Rh) acquistato da Quoziente Biodiagnostics (PA, USA). </li><li> Incubare la miscela per 30 min a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Lavare la miscela con 1,5 ml di tampone PBS due volte. Centrifugare a 1000 xg per 1 minuto per eliminare il sopranatante. </li><li> Sospendere i globuli rossi in 1 ml di soluzione salina, e trasferire la sospensione in tubo da 4 ml di citometria a flusso BD flusso. </li><li> Analizzare con FACSCanto II flow citometro, l&#39;acquisizione di 5.000 eventi sul cancello RBC di controllo e utilizzare interi eventi per l&#39;analisi. </li></ol> VI. Citometria di flusso misure - espressione di CD47 <ol><li> Aggiungere 1,54 ml di controllo o HPG RBC modificati (20% di ematocrito) in triplicato per tampone PBS supplementato con 0,5% BSA ad un volume totale di 44 microlitri. </li><li> Aggiungere 6 ml di ficoeritrina (PE) marcato topo anti-CD47 umani acquistati da BD Biosciences (NJ, USA). </li><li> Incubare la miscela per 30 min a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Lavare la miscela con 1,5 ml di tampone PBS per due volte. Centrifugare a 1000 xg per 1 minuto per eliminare il sopranatante. </li><li> Sospendere i globuli rossi in 1 ml di soluzione salina, e passare al 26 G 5/8 aghi per ridurre al minimo aggregazione cellulare. </li><li> Trasferire la sospensione in tubo da 4 ml di citometria a flusso BD flusso. </li><li> Analizzare con FACSCanto citofluorimetro II, l&#39;acquisizione di 10.000 eventi sul cancello RBC controllo. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

RBC donatori universali hanno un grande potenziale disponibilità del sangue ed il di sicurezza per la terapia trasfusionale. Globuli rossi sono considerati promettenti veicoli di somministrazione di farmaci per la loro circolazione lungo e biocompatibilità intrinseca 14, 15. Esperimenti presentati in questo documento valutare la caratteristiche in vitro di HPG RBC modificati. La proprietà in vitro e in vivo di circolazione HPG globuli rossi modificati sono stati studiati nel nostro ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Glycidol </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Trimethylolpropane </td><td> Fluka </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Metilato di potassio </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Anidro piridina </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> 4-dimetilamminopiridina </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Anidride succinica </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Acetone </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Anidro dimetilformammide </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> N-Hydroxysuccinimide </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> N, N&#39;-diisopropilcarbodiimmide </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> MTS carte </td><td></td><td></td><td> Micro Typing System (MTS) carte (FL, USA) </td></tr><tr><td> Destrano 500 kDa </td><td> Pharmacia Fine Chemicals </td><td></td><td> (Svezia) </td></tr><tr><td> PEG 8 kDa </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> FITC anticorpo monoclonale anti-Rhesus D (Rh) </td><td> Quoziente Biodiagnostics </td><td></td><td> (PA, USA) </td></tr><tr><td> PE anticorpo monoclonale anti-CD47 </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td> (NJ, USA) </td></tr><tr><td> Reagente Drabkin di </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella. Prodotti chimici e reagenti utilizzati per l&#39;innesto di HPG polimeri a RBC membrana e la loro analisi. </td></tr></tbody></table>

gli antigeni protetto funzionali globuli rossi dalla membrana innesto di compact poligliceroli hyperbranched

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Globuli rossi (RBC) trasfusione è vitale per il trattamento di una serie di problemi medici acuti e cronici come talassemia e anemia falciforme 1-3. A causa della presenza di numerosi antigeni sulla superficie RBC (~ 308 antigeni noti 4), pazienti in terapia cronica trasfusione sviluppano alloanticorpi causa della partita miss di antigeni minori di eritrociti trasfusi 4, 5. Innesto di polimeri idrofili come polietilene glicole (PEG) e poliglicerolo hyperbranched (HPG) forma uno strato di esclusione sulla membrana RBC che previene l&#39;interazione di anticorpi con antigeni di superficie senza influenzare il passaggio di piccole molecole come l&#39;ossigeno, glucosio, e ioni 3. Attualmente è disponibile alcun metodo per la generazione di globuli rossi donatori universali in parte a causa della difficile sfida presentata dalla presenza di un gran numero di antigeni (proteine ​​e carboidrati base) sulla superficie RBC e la dviluppo di tali metodi migliorerà in modo significativo la sicurezza delle trasfusioni, e drammaticamente migliorare la disponibilità e l&#39;uso di globuli rossi. In questa relazione, gli esperimenti che vengono utilizzati per sviluppare antigene RBC funzionali protetti dalla membrana innesto di HPG e loro caratterizzazione vengono presentati. HPGs sono altamente biocompatibili polimeri compatte 6, 7, e dovrebbero essere situata all&#39;interno della cella glicocalice che circonda la membrana lipidica 8, 9 e maschera RBC antigeni di superficie 10, 11.

Mascherano di antigene Rhesus D e CD47 proteina di superficie RBC sono stati quantificati mediante citometria a flusso utilizzando fluorescenti anticorpi monoclonali marcati, e un risultato rappresentativo è riportato in figura 1. In caso di HPG-innestati GR (grigio), l&#39;intensità del segnale è diminuito (picco spostato a sinistra) rispetto al controllo RBC (rosso e verde) indica una riduzione nel legarsi agli anticorpi di superficie cellulare che indicano il mascheramento delle proteine ​​di superfi...

La modifica membrana cellulare dei globuli rossi (RBC) con poliglicerolo hyperbranched (HPG) è presentato. RBC modificati sono stati caratterizzati da due partizionamento fase acquosa, la fragilità osmotica e lisi complemento mediata. Il camuffamento di proteine ​​di superficie e degli antigeni è stata valutata utilizzando la citometria a flusso e sistema Micro Typing (MTS) carte fenotipizzazione sangue.

Gli antigeni Protetto funzionali globuli rossi dalla membrana innesto di Compact Poligliceroli Hyperbranched

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Lo scopo di questa procedura è quello di preparare globuli rossi funzionali protetti dall'antigene. Ciò si ottiene preparando prima il polimero HPG nella seconda fase. L'HPG viene funzionalizzato attraverso l'aggiunta di gruppi succinilsuccinato.Successivamente, il sangue intero di donatori sani viene lavato con soluzione fisiologica per separare i globuli rossi. Nella fase finale, i globuli rossi isolati vengono trattati con l'HPG funzionalizzato. In definitiva, la protezione degli antigeni di superficie sulle cellule modificate da parte dell'HPG funzionalizzato viene analizzata mediante citometria a flusso.Il vantaggio principale della nostra tecnica rispetto ai metodi esistenti è che le coniugazioni HPG producono globuli rossi funzionali che circolano normalmente. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle trasfusioni di sangue croniche. Poiché l'HPG modificato, i globuli rossi hanno una ridotta antigenicità e una circolazione normale in vivo.A dimostrare la procedura sarà il Dr.Ian, un medico post-medico, compagno di scuola costante, un tecnico nel mio laboratorio Tre giorni prima di raccogliere sangue intero da donatori sani consenzienti, HPG liofilizzato a secco in una fiaschetta a fondo rotondo durante la notte e un vuoto a 90 gradi Celsius. La mattina successiva, togliete il pallone dal bagno d'olio e lasciatelo raggiungere la temperatura ambiente per poi sciogliere l'HPG essiccato in due millilitri di piridina anidra. Successivamente, aggiungere una quantità catalitica di dimetilamminoparidina alla soluzione HPG per funzionalizzare circa otto dei gruppi ossidrilici sull'HPG con gruppi carbossilici.Nei successivi 10 minuti, aggiungere l'idruro di Sica sciolto in 0,5 millilitri, perino goccia a goccia fino alla soluzione, quindi mescolare la miscela per una notte a temperatura ambiente sotto Argonne il giorno successivo e precipitare la miscela HPG in 40 millilitri di quattro gradi Celsius. Acetone in una provetta da 50 millilitri a centrifuga per 15 minuti a 27.000 volte G a quattro gradi Celsius. Quindi decantare il supinato e sciacquare il precipitato con Argonne a temperatura ambiente per rimuovere eventuali residui di acetone.Attivare i gruppi carbossilici con gruppi succinati Saxon e Mial. I gruppi dissolvono l'HPG carbossilico funzionalizzato in due millilitri di DMF anidro. Quindi aggiungere NHS e Diop profile CARBIMIDE alla soluzione HPG e mescolare la miscela per una notte a temperatura ambiente sotto Argonne.La mattina successiva si procede con la depurazione dell'S-S-H-P-G mediante precipitazione in acetone freddo. Successivamente sciacquare con argonne per rimuovere eventuali residui di acetone. Quindi determinare la purezza dell'HPG modificato e il grado di funzionalizzazione del carbossile e del succinilsuccinato mediante analisi NMR protonica.Dopo aver ottenuto il consenso informato, prelevare il sangue dal donatore sano mentre viene valutata la purezza dell'S-S-H-P-G. Centrifugare il sangue intero del donatore per quattro minuti a 1000 volte G e temperatura ambiente. Utilizzare una pipetta paster per rimuovere il supinato e il buffy coat, quindi trasferire i globuli rossi impacchettati in una provetta da centrifuga conica da 15 millilitri.Aggiungere PBS alle cellule e poi mescolare per inversione per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule. Quindi centrifugare le cellule in PB S3 volte rimuovendo il natante SUP. Dopo ogni lavaggio, trasferire il pellet pact RBC in un tubo di orph da 1,6 millilitri e aggiungere 300 microlitri di PBS per portare il volume fino a 400 microlitri subito dopo aver confermato la purezza dell'HPG modificato, trasferire 150 milligrammi di S-S-H-P-G in una fiala di Dr.Glass.Dopo aver pesato il polimero, aggiungere 300 microlitri di PBS all'S-S-H-P-G e agitarlo per sciogliere il polimero. Quindi aggiungere la soluzione polimerica S-S-H-P-G ai globuli rossi lavati con il 20% di emidità. Quindi, agitare delicatamente la sospensione e quindi posizionare la miscela HPG dei globuli rossi su un agitatore orbitale a temperatura ambiente.Dopo un'ora, lavare la soluzione quattro volte con PBS e soluzione salina rimuovendo ogni volta il supinato. Quindi aggiungere 300 microlitri di soluzione fisiologica agli ultimi 100 microlitri di globuli rossi concentrati fino a una concentrazione finale di ematocrito del 20%. Ora lasciare coagulare otto millilitri di cellule del sangue intero del donatore per 30 minuti a temperatura ambiente.Quindi, dopo aver fatto girare le cellule, raccogliere circa tre millilitri di siero e trasferire un millilitro di siero in un bagno d'acqua a 60 gradi Celsius. Per preparare il siero inattivato a caldo. Dopo 30 minuti, aggiungere 60 microlitri di siero fresco e 60 microlitri di siero inattivato a caldo in tubi di eph separati.Ciascuno contiene 60 microlitri di globuli rossi modificati HPG ematocrito al 20%. Quindi aggiungere 60 microlitri dello stesso in provette contenenti lo stesso volume di globuli rossi non modificati e incubare tutti i campioni di sangue rosso per un'ora a 37 gradi Celsius. Per quantificare la quantità di emoglobina nelle sospensioni cellulari, collocare prima 5,9 microlitri di ciascuno dei campioni in triplicato in una piastra a 96 pozzetti.Quindi mescolare ogni campione con 294 microlitri di reagente di Kins grigio e leggere l'assorbanza del derivato sano dell'emoglobina con uno spettrofotometro a 540 nanometri per quantificare la quantità di emoglobina nella centrifuga del supinato, il resto dei campioni cellulari, quindi piastra 50 microlitri di ciascuno dei supinato in triplicato in una piastra a 96 pozzetti. Dopo aver mescolato le cellule con 250 microlitri di reagente per parenti grigi, misurare l'assorbanza dell'emoglobina e del derivato come appena dimostrato per questo passaggio. Iniziare centrifugando 50 microlitri di globuli rossi modificati HPG con il 10% di ematocrito in una provetta a spirale.Dopo aver scartato il surnatante S a 110 microlitri di diluente MTS nel pellet cellulare e pipettare la soluzione su e giù alcune volte per omogeneizzare la sospensione cellulare. Ora caricare 11 microlitri di sospensione cellulare in ciascuna colonna di un mini gel. Quindi posizionare le schede MTS in un portacarte da centrifuga e far girare le carte per sei minuti a 156 volte G.La protezione degli antigeni di superficie può quindi essere determinata dalla posizione dei globuli rossi nelle mini colonne di gel secondo la descrizione del produttore.Per questa fase, dopo aver impostato un sistema di separazione bifase PEG destrano, centrifugare la soluzione PEG destrano per ottenere il sistema bifase. Quindi aliquotare con cura un millilitro della fase PEG superiore in un tubo etichettato con fondo concavo. Aggiungere 20 microlitri di globuli rossi modificati al 20-30% di hemog crypt HPG al tubo, mescolando la sospensione cellulare con un leggero colpo.Quindi, aggiungere 0,5 millilitri della cella contenente la fase superiore a 0,5 millilitri della faccia inferiore del destrano, quindi mescolare nuovamente il sistema con un movimento più delicato. Ora appoggia il tubo su una panca per consentire al sistema di separarsi dopo due minuti. I globuli rossi dovrebbero localizzarsi nella fase superiore del PEG, nella fase inferiore della dextra o in entrambi i globuli rossi.I derivati con alti livelli di HPG si trovano nella fase superiore del PEG per valutare la protezione degli antigeni della superficie dei globuli rossi mediante analisi citofluorimetrica. Innanzitutto, aggiungere 20 microlitri di soluzione fisiologica a tre provette per ogni campione. Quindi aggiungere cinque microlitri ciascuno di globuli rossi di controllo non modificati e HPG modificati in triplicato alle provette.Successivamente, aggiungere 25 microlitri di fit C monoclonale anti reus D a ciascuna provetta e incubare i campioni a 37 gradi Celsius a bagnomaria. Dopo 30 minuti, lavare i campioni in soluzione fisiologica da 1,5 millilitri, rimuovendo due volte il supinato ogni volta dopo il secondo lavaggio, Reese piega i globuli rossi in un millilitro di soluzione fisiologica. Infine, acquisire almeno 5.000 eventi sul cancello di controllo dei globuli rossi per analizzare la protezione degli antigeni di superficie.In questo istogramma, l'espressione normale dell'antigene Resus e, rappresentata dal picco verde sui globuli rossi non modificati provenienti da donatori umani sani, viene mostrata quando i globuli rossi vengono innestati in HPG, l'intensità del segnale dell'antigene elettronico di Reese diminuisce, come evidenziato dallo spostamento dell'espressione a sinistra indicato dal picco grigio. La modificazione dei globuli rossi da parte dell'HPG camuffa anche l'espressione di CD 47, come dimostrato dallo spostamento a sinistra del picco grigio osservato anche in questo istogramma, indicando che il mascheramento delle proteine di superficie avviene in presenza di HPG. Seguendo questa procedura, modificatore HPG, le cellule del sangue possono avere applicazione nelle trasfusioni di sangue e nella somministrazione cellulo-mediata di terapie.Dopo aver visto questo video, avrai una migliore comprensione di come i polimeri possono essere coniugati ai globuli rossi per modificare l'antigenicità e per costruire le basi per la somministrazione di farmaci.

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