Name: Proteine trasfezione di polmone mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: Scopri la trasfezione proteica nel polmone di topo utilizzando un microspray ultrafine e reagenti lipidici. Questo metodo efficiente riduce gli effetti off-target e aumenta l'espressione proteica nei tessuti polmonari.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (7R01HL098528-03) e Clinica Innovator Award FAMRI.

1. Preparazione di proteine ​​Transfezione reagente <ol><li> Sciogliere il reagente Pro-Ject aggiungendo 250 ml di metanolo e cloroformio al tubo contenente il film secco. </li><li> Vortex per 10-20 secondi alla massima velocità. </li><li> Pipettare 20 ml di reagente di Pro-Ject in tubi microcentrifuga separate. </li><li> Evaporare il solvente ponendo le provette da microcentrifuga contenenti il ​​reagente Pro-Ject sotto cappa a flusso laminare per un minimo di 6 ore a temperatura ambiente. Esso deve essere completamente asciutto. Alternativamente, essiccare il reagente Pro-Ject utilizzando un essiccatore a vuoto. </li><li> Conservare le provette a -20 ° C. Essi sono buoni per un anno a questa temperatura. </li></ol> 2. L&#39;aggiunta di proteine ​​a Pro-Ject reagente <ol><li> Pipettare 50 ml di PBS, contenente 2,0 mg di proteina di interesse, in una provetta contenente 20 ml di reagente di trasfezione Pro-Ject essiccato. </li><li> Dopo aver aggiunto la proteina, miscelare la soluzione nel vortex a bassa velocità fo 3-5 sec seguita da incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Amministrazione tracheale di Proteine <ol><li> Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di ketamina / xilazina (100 mg / kg e 10 mg / kg). </li><li> Dopo sedazione è raggiunto, i topi sono sospesi dalla incisivi superiori con una piattaforma appositamente progettata (Figura 1). </li><li> Con pinze e una graffetta come laringoscopio, dell&#39;orofaringe viene aperta in modo che il catetere può essere introdotto (Figura 2). Le corde vocali sono visualizzati semplicemente posizionando una sorgente di luce contro la trachea del mouse. </li><li> La miscela reagente proteina / progetto (50 ml) viene iniettato attraverso la trachea usando un secolo MICROIRRIGATORE Penn. </li></ol>

<ol><li>Glasser, S. W., Korfhagen, T. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+models+for+study+of+pulmonary+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic models for study of pulmonary development and disease.</a> Am. J. Physiol. 267, 489-497 (1994).</li>
<li>D'Armiento, J., Dalal, S. S., Okada, Y., Berg, R. A., Chada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagenase+expression+in+the+lungs+of+transgenic+mice+causes+pulmonary+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collagenase expression in the lungs of transgenic mice causes pulmonary emphysema.</a> Cell. 71, 955-961 (1992).</li>
<li>Foronjy, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+expression+attenuates+cigarette+smoke-+or+elastase-generated+emphysema+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase expression attenuates cigarette smoke- or elastase-generated emphysema in mice.</a> Am. J. Respir Crit. Care Med. 173, 623-631 (2006).</li>
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<li>Perl, A. K., Tichelaar, J. W., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+expression+in+the+respiratory+epithelium+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Conditional gene expression in the respiratory epithelium of the mouse.</a> Transgenic Research. 11, 21-29 (2002).</li>
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<li>Crystal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+an+adenovirus+containing+the+human+CFTR+cDNA+to+the+respiratory+tract+of+individuals+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis.</a> Nat. Genet. 8, 42-51 (1994).</li>
<li>Merkel, O. M., Zheng, M., Debus, H., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+gene+delivery+using+polymeric+nonviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pulmonary gene delivery using polymeric nonviral vectors.</a> Bioconjugate Chemistry. 23, 3-20 (2012).</li>
<li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> J. Virol. 69, 2004-2015 (1995).</li>
<li>Liu, Q., Muruve, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+inflammatory+response+to+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the inflammatory response to adenovirus vectors.</a> Gene Ther. 10, 935-940 (2003).</li>
<li>Pfeifer, C., Aneja, M. K., Hasenpusch, G., Rudolph, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotype+9-mediated+pulmonary+transgene+expression%3A+effect+of+mouse+strain%2C+animal+gender+and+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotype 9-mediated pulmonary transgene expression: effect of mouse strain, animal gender and lung inflammation.</a> Gene Ther. 18, 1034-1042 (2011).</li>
<li>Wallace, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+regulates+innate+immune+and+proteolytic+responses+to+cigarette+smoke+exposure+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A regulates innate immune and proteolytic responses to cigarette smoke exposure in the lung.</a> Toxicol. Sci. 126, 589-599 (2012).</li>
<li>Wallace, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Phosphatase+2a+%28Pp2a%29+Regulates+Innate+Immune+and+Proteolytic+Responses+to+Cigarette+Smoke+Exposure+in+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein Phosphatase 2a (Pp2a) Regulates Innate Immune and Proteolytic Responses to Cigarette Smoke Exposure in the Lung.</a> Toxicol. Sci. , (2012).</li>
<li>Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+endotracheal+intubation+and+pulmonary+functional+assessment+for+repeated+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice.</a> J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Il vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi è che produce aumenti dei livelli della proteina e l&#39;attività all&#39;interno del tessuto polmonare stesso. Inoltre, penetra alle regioni più distali del polmone rispetto a stare solo all&#39;interno delle vie respiratorie. Abbiamo misurato un aumento dell&#39;attività delle proteine ​​del nostro iniettato anche dopo lavaging le vie aeree con soluzione fisiologica 15. Analisi di attività del tessuto indicano che la proteina sta entrando cellule e non...

<table><tbody><tr><td>Microspruzzatore Pro-Ject</td><td>Pierce Bio</td><td>89850</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Penn Century</td><td>FMJ-250</td><td></td></tr><tr><td>Beta-galattosidasi</td><td>Pierce Bio</td><td>89850</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo beta-galattosidasi</td><td>Santa Cruz Bio</td><td>SC-19119</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica di topo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3139</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina/xilazina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K113</td><td></td></tr></tbody></table>

proteine ​​trasfezione di polmone mouse

Protein Transfection of Mouse Lung

Aumentare l&#39;espressione della proteina permette ai ricercatori di comprendere meglio il ruolo funzionale di quella proteina nella regolazione dei processi biologici chiave 1. Nel polmone, questo è stato realizzato tipicamente attraverso approcci genetici che utilizzano topi transgenici 2,3 o vettori virali o non virali che elevano livelli di proteina tramite incremento dell&#39;espressione genica 4. Topi transgenici sono costosi e che richiede tempo per generare e l&#39;inserzione casuale di un&#39;espressione genica transgene o cronica possono alterare il normale sviluppo del polmone e quindi limitare l&#39;utilità del modello 5. Mentre transgenici condizionali scongiurare problemi associati con l&#39;espressione genica cronica 6, le transattivatore (rtTA) topi tetraciclina controllati inversa, che vengono utilizzati per generare un&#39;espressione condizionale, sviluppano spontanea allargamento dello spazio aereo 7. Come con transgenici, l&#39;uso di vettori virali e non virali è costoso 8 e può provocare dose-drisposte infiammatorie ependent che confondono risultati 9 e ostacolano l&#39;espressione 10. Inoltre, l&#39;efficacia di dosi ripetute sono limitati dalla migliorate le risposte immunitarie al vettore 11,12. I ricercatori stanno sviluppando associati adeno-virale (AAV) vettori che provocano meno infiammazione e hanno un&#39;espressione più lunga all&#39;interno del polmone 13. Utilizzando β-galattosidasi, presentiamo un metodo per aumentare l&#39;espressione di proteine ​​rapidamente ed efficacemente all&#39;interno del polmone utilizzando una tecnica diretta trasfezione proteina. Questo protocollo mescola una quantità fissa di proteina purificata con 20 pl di un reagente di trasfezione base lipidica (Pro-Ject, Pierce Bio) per consentire la penetrazione nel tessuto polmonare stesso. La miscela proteica liposomiale viene poi iniettato nei polmoni dei topi attraverso la trachea utilizzando un MICROIRRIGATORE (Century Penn, Philadelphia, PA). Il MICROIRRIGATORE genera un bel pennacchio di aerosol liquidi durante i polmoni. Utilizzando la tecnicaabbiamo dimostrato deposizione uniforme della proteina iniettata durante le vie aeree e gli alveoli dei topi 14. La tecnica di transfezione lipidi permette l&#39;uso di una piccola quantità di proteine ​​per realizzare l&#39;effetto. Questo limita la risposta infiammatoria che altrimenti sarebbe provocata dalla somministrazione di proteine. Infatti, con questa tecnica abbiamo pubblicato che siamo stati in grado di aumentare in modo significativo l&#39;attività PP2A nel polmone senza influire polmone lavanda cellularità 15. Polmone lavanda cellularità preso 24 ore dopo sfida era paragonabile ai controlli (27 ± 4 Controllo vs 31 ± 5 albumina transfettate; N = 6 per gruppo). Inoltre, i livelli di proteina aumenta senza indurre alterazioni dello sviluppo polmonare o modifiche architettoniche che si possono verificare in modelli transgenici. Tuttavia, la necessità di ripetute somministrazioni può rendere questa tecnica meno favorevole per studi di esaminare gli effetti di incremento a lungo termine nell&#39;espressione proteica. Ciò sarebbe particolarmente true per le proteine ​​con breve emivita.

<html> Per dimostrare l&#39;efficacia della nostra tecnica abbiamo usato una MICROIRRIGATORE (Penn sec) per iniettare la trachea di topi con 2 pg di topo albumina (Sigma) disciolto in 50 ml di PBS che conteneva 20 ml di reagente di trasfezione Pro-Ject. I topi trattati con albumina sono stati confrontati con i topi che sono stati trattati in modo identico con 2 mg di proteina beta-galattosidasi (Pierce Bio). Dopo ventiquattro ore, i topi sono stati sacrificati ed i polmoni sono stati processati per l&#39;analisi istologi...

Topi transgenici o vettori virali sono stati usati per aumentare l&#39;espressione della proteina all&#39;interno del polmone. Tuttavia, queste tecniche sono lunghi, tecnicamente complesse e hanno effetti off-target che possono confondere i risultati. Il nostro protocollo di trasfezione proteina utilizza un reagente di trasfezione basata lipidico e un MICROIRRIGATORE ultrafine per fornire uniformemente proteina attiva di cellule polmonari.

Proteine ​​trasfezione di polmone mouse

Increasing protein expression enables researchers to  better understand the functional role of that protein in regulating key  biological processes1. In ...

L'obiettivo generale di questa procedura è trasfettare una proteina nel polmone del topo. Questo viene ottenuto sospedendo innanzitutto la proteina di interesse nel reagente di trasfezione del progetto. Successivamente, un topo viene anestetizzato e posizionato su una piattaforma speciale per l'iniezione.Una sorgente luminosa viene utilizzata per facilitare l'inserimento dello spruzzatore microscopico nella trachea. Infine, vengono iniettati 50 microlitri di fluido contenente la proteina di interesse. In definitiva, questa tecnica di trasfezione proteica viene utilizzata per dimostrare un aumento dei livelli proteici nei polmoni dei topi.Sebbene questo metodo sia stato progettato per essere utilizzato nella malattia polmonare ostruttiva cronica, può essere impiegato anche in altre condizioni patologiche come l'asma o la fibrosi polmonare. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Poiché le fasi dell'iniezione intratracheale sono difficili da apprendere, richiedono un posizionamento corretto delle vie aeree del topo e una transilluminazione delle corde vocali.Cominciare preparando prima il reagente per la trasfezione delle proteine. Aggiungere 250 microlitri di metanolo o cloroformio al tubo contenente il film secco del progetto. Successivamente, vortexare il tubo per 10-20 secondi alla velocità massima.Una volta disciolto, pipettare 20 microlitri di reagente del progetto in provette microcentrifuga separate. Posizionare queste provette sotto una cappa a flusso laminare per far evaporare il solvente per un minimo di sei ore. A temperatura ambiente, le provette devono essere completamente asciutte.Conservare i tubi a meno 20 gradi Celsius, dove rimarranno stabili per un anno. Il giorno della trasfezione, prelevare un'aliquote del reagente per la trasfezione e aggiungere 50 microlitri di PBS contenenti due microgrammi della proteina di interesse. Mescolare la soluzione mediante vortex a bassa velocità per tre-cinque secondi, quindi incubare a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso.Quando la proteina è pronta, anestetizzare un topo per prepararlo all'amministrazione intratracheale. Per l'iniezione intratracheale si utilizza una piattaforma appositamente progettata, dotata di una rampa inclinata di 45 gradi rispetto alla base e di un filo metallico sospeso a due ganci posti nella parte superiore.Dopo l'anestesia, si utilizza questo filo per appendere il topo ai suoi incisivi superiori. Una volta fissato il topo, posizionare una sorgente luminosa contro la trachea per facilitare la visualizzazione delle corde vocali mediante pinzette e una graffetta. Utilizzando quest'ultima come laringoscopio, aprire l'orofaringe e introdurre il catetere.Quando si utilizza lo spruzzatore Micros, è importante esercitare una forza sufficiente spingendo lo stantuffo. In caso contrario, invece di generare un nebulizzato fine, si formeranno goccioline che potrebbero potenzialmente ostruire le vie aeree del topo. Una volta che tutto è posizionato correttamente, iniettare 50 microlitri della miscela proteica attraverso la trachea utilizzando uno spruzzatore microcentesimale a penna.In questo esempio, i topi sono stati iniettati per via intratracheale con albumina murina o beta-galatto 24 ore dopo la trasfezione proteica con beta-galatto intensa. La colorazione indicata qui dalle frecce larghe è stata rilevata all'interno delle vie aeree dei topi trattati con beta-galatto, ma non nei topi trattati con albumina. Una volta acquisita dimestichezza, questa tecnica potrebbe essere eseguita in 10 o 15 minuti se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione del metodo per effettuare l'iniezione intratracheale nei topi a fini di trasfezione proteica.

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