Generazione e recupero dei β-cellule Spheroids dal passaggio di crescita PEG-peptide idrogel

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare le tecniche per incapsulare le cellule in idrogel fotopolimerizzati sottili, nonché il successivo recupero del pH delle cellule beta formate naturalmente dagli idrogel sensibili agli enzimi dalla caratterizzazione biologica. Ciò si ottiene mescolando prima le sei cellule beta con un piolo dell'avambraccio, un macer norbertina e un reticolante peptidico enzimatico sensibile. Le cellule vengono quindi incapsulate utilizzando la fotopolimerizzazione mediata dai radicali liberi per formare un idrogel.

Il secondo passo consiste nel coltivare cellule incapsulate in idrogel sottili in un incubatore ad anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Dopo che le cellule sono proliferate per formare aggregati, gli idrogel carichi di cellule vengono risciacquati con una soluzione tampone e quindi incubati in una soluzione di tripsina di chia. Sotto una leggera agitazione per l'erosione del gel, gli aggregati recuperati vengono accuratamente lavati per rimuovere la soluzione enzimatica e il polimero eroso.

In definitiva, questi aggregati cellulari possono essere utilizzati per l'analisi strutturale e funzionale. Quindi il vantaggio principale della crescita a gradini e della fotochimica è che le sue condizioni di reazione sono più lievi rispetto alla tradizionale crescita a catena PEG dde. Pertanto, gli idrogel sottili forniscono un eccellente microambiente per molti tipi di cellule, comprese le cellule beta pancreatiche.

L'implicazione di questa tecnica si estende a varie terapie cellulari perché questo sistema DIN fornisce un eccellente microambiente per esperimenti in vitro e un'ottima piattaforma per la somministrazione cellulare. Mentre sintetizziamo i peptidi utilizzati in questi esperimenti nel nostro laboratorio, ci sono molte aziende da cui è possibile ottenere i reticolanti peptidici che abbiamo descritto. Per iniziare questa procedura, preparare una soluzione al 20% di PEG quattro NB in PBS a vortice la miscela fino a quando il matricolo non si scioglie completamente.

Quindi passare la soluzione di Kermer attraverso un filtro per siringa per sterilizzarla e conservare Eloqua a meno 20 gradi Celsius fino al momento del bisogno. Quindi, preparare una soluzione al 2% del fotoiniziatore fosfonato di litio arolo in PBS. Passare la soluzione fotoiniziatrice attraverso un filtro a siringa e conservare la soluzione sterilizzata a temperatura ambiente al riparo dalla luce.

Un altro passaggio preparatorio consiste nello sciogliere il reticolante del peptide sensibile alla crisina nel PBS e filtrare la soluzione per la sterilizzazione con la siringa. Le aliquote extra vengono conservate a meno 20 gradi Celsius. Determinare la concentrazione del gruppo idro Sulf nella soluzione peptidica preparata utilizzando il reagente di Elman secondo il protocollo del produttore.

Successivamente, preparare gli stampi per l'azione tagliando la parte superiore di un centimetro di siringhe monouso sterili da un millilitro. Utilizzando una lama di rasoio risterilizzato gli stampi della siringa. Utilizzando un'autoclave, preparare un foglio di calcolo contenente i calcoli della formulazione del gel desiderata, inclusi il volume e la concentrazione dei materiali di riserva, tra cui peptide polimerico, reticolante, fotoiniziatore e soluzioni tampone.

Prima coltura cellulare preriscaldata, soluzione salina bilanciata di matassa media e due viaggi in EDTA a 37 gradi Celsius. Quindi, rimuovere i palloni di almeno sei cellule beta dall'incubatore e posizionarli nella cappa a flusso laminare. Dopo aver aspirato i terreni di coltura cellulare dai palloni, sciacquare le cellule con serbatoi di preriscaldamento, bilanciare la soluzione salina.

Quindi provare a ghiacciare le cellule usando tre millilitri di preriscaldamento, due viaggi in EDTA e incubare i palloni per quattro minuti. Dopo l'incubazione, picchiettare delicatamente i palloni sulla superficie della cappa per staccare completamente le cellule. Confermare il distacco e la dissociazione delle cellule al microscopio.

Quindi, aggiungere un volume uguale di terreno di coltura cellulare. Per neutralizzare la tripsina, mescolare bene la soluzione pipettando delicatamente su e giù. Quindi trasferire la miscela in una provetta conica sterile, centrifugare la sospensione cellulare per cinque minuti a 200 RCF dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere delicatamente le cellule in quattro o cinque millilitri di coltura preriscaldata. Media.

Infine, determinare la densità cellulare mescolando parte della sospensione cellulare con il blu triano al 50% e contando le cellule con un emocitometro. Una volta che le cellule sono pronte, miscelare i volumi necessari di PEG quattro e fotoiniziatore di reticolante peptidico B a una concentrazione finale di cellule millimolari e HBSS in una provetta per microcentrifuga basata su un rapporto TH / EEN di uno a uno e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. In questa dimostrazione viene utilizzato un PEG al 4% quattro e B.

Quindi pipettare 25 microlitri della soluzione risultante in ogni stampo per siringa. Esporre gli stampi della siringa alla luce UV a 365 nanometri a una potenza di cinque milliwatt per centimetro quadrato per due minuti. Per polimerizzare il gel dopo la fotopolimerizzazione, immergere i gel in una piastra sterile a 24 pozzetti contenente un millilitro di terreno di coltura cellulare e incubare gli idrogel a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 30 minuti per sciacquare via eventuali cellule attaccate in modo lasco o macro non reticolate.

Dopo 30 minuti, rimuovere la piastra dall'incubatore e trasferire i gel in un millilitro di terreno fresco. Aggiornare il supporto ogni due o tre giorni. Preparare una soluzione enzimatica da un milligrammo per millilitro aggiungendo la soluzione salina bilanciata di Hanks alla tripsina alfa chimi tripsina libera.

Quindi sterilizzare la miscela con un filtro per siringa. Quindi, rimuovere la piastra di coltura dall'incubatrice e sciacquare i gel con la soluzione salina di Hank's Balance. Quindi aggiungere 500 microlitri di soluzione di tripsina in ciascun pozzetto, quindi incubare a temperatura ambiente agitando delicatamente su uno shaker per circa cinque-10 minuti in modo da ottenere la completa erosione del gel.

Una volta che il gel è completamente dissociato, posizionare la piastra sul ghiaccio per qualche minuto per ridurre l'attività della tripsina CH. Il passo successivo consiste nel trasferire la sospensione cellulare in una provetta da un millilitro e centrifugare lentamente a 45 RCF e quattro gradi Celsius per due minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il surnatante utilizzando una pipetta PEI e sospendere delicatamente lo steroide nella soluzione salina di Hank's Balance.

Quindi trasferire la soluzione steroidea recuperata in una nuova piastra a 24 pozzetti e posizionare la piastra sul ghiaccio per cinque-10 minuti per consentire allo steroide di depositarsi e attaccarsi alla superficie per l'analisi delle dimensioni. Acquisizione di immagini a contrasto di fase degli sferoidi sedimentati utilizzando un microscopio ottico, misurazione dei diametri degli sferoidi recuperati utilizzando software come il software Nikon element o l'immagine J.Questo metodo di incapsulamento garantisce un'elevata vitalità cellulare iniziale, come quantificato dalla colorazione di morti vivi. Con il tempo in coltura cellulare, il metabolismo cellulare misurato da alamar, i reagenti blu sono aumentati in un periodo di 10 giorni in tutte le concentrazioni studiate.

Dopo 10 giorni di coltura cellulare, gli steroidi sono aumentati di dimensioni e hanno mantenuto un'elevata vitalità cellulare. Negli idrogel, l'idrogel peptidico PEG ha supportato la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule beta incapsulate, mostrate qui dopo 10 giorni in coltura, nel recupero somatico con alfa chim tripsina libera gli steroidi dalla matrice di idrogel, producendo una distribuzione ristretta di dimensioni degli steroidi che sono indipendenti dalla concentrazione della matrice. Questi steroidi possono quindi essere utilizzati per ulteriori caratterizzazioni e applicazioni durante il tentativo di questa procedura.

È importante mantenere l'omogeneità nella soluzione prepolimerica durante l'incapsulamento per garantire che le cellule siano ben distribuite. Seguendo questa procedura, le cellule recuperate possono essere caratterizzate utilizzando altre tecniche come l'immunocolorazione a montatura intera e il western blot al fine di studiare l'effetto della condizione della matrice di idrogel sull'espressione e sul fenotipo delle proteine cellulari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come incapsulare le cellule negli idrogel, nonché di come recuperare le cellule dai gel per ulteriori caratterizzazioni biologiche.