Screening per Modificatori melanoma utilizzando un modello Zebrafish Tumore autoctone

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di eseguire lo screening dei modificatori del melanoma utilizzando un modello di tumore autogeno di zebrafish. Ciò si ottiene creando animali transgenici in cui i melanociti esprimono un gene di interesse e i pesci sono predisposti al melanoma. La successiva insorgenza del melanoma viene valutata per valutare se il gene di interesse altera l'inizio del tumore.

Quindi vengono eseguiti saggi di invasione tumorale e cellule specifiche per determinare qualsiasi impatto aggiuntivo del gene di interesse sui melanomi e sui melanociti pre-maligni. Infine, le cellule di melanoma vengono trapiantate per misurare come il gene di interesse influenza la frequenza delle cellule che iniziano il melanoma nei tumori stabiliti. I risultati mostrano come un gene candidato influenzi varie proprietà dei melanociti e dei melanomi, tra cui l'invasione dell'insorgenza e la capacità di trapianto.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la transgenesi germinale per l'indagine dei geni del cancro candidati è che si risparmiano tempo, fatica e denaro e si aumenta la produttività con il test. Vari aspetti della tumorgenesi negli animali transgenici a dimostrazione di questa procedura sarà Sherania Agar, una studentessa laureata nel mio laboratorio per generare costrutti per l'iniezione. Inizia creando cloni di ingresso centrale del gateway mediante PCR, amplificando l'intero frame di lettura aperto dei geni di interesse e ricombinandoli in P don R 2 21.

Quindi utilizzare la tecnologia gateway multi-sito per ricombinare il gene promotore mifa specifico dei melanociti di interesse e il segnale di poliadenilazione nel mini vettore di Cooper per porre i geni di interesse sotto il controllo del promotore mifa iniettare 25 picogrammi di ciascun clone, insieme a 25 picogrammi di TOL due traspone l'mRNA in una cellula transgenica triplo omozigote embrioni di zebrafish. Mifa BRAF FP 53. Gli animali mutanti sono carenti di melanociti e inclini alla trasformazione e alla formazione di melanoma.

Insieme al gene di interesse. Il mini vettore di Cooper contiene un mini gene MVA di salvataggio. Quindi gli animali iniettati con successo svilupperanno melanociti salvati, che esprimono il gene di interesse.

Incubare gli embrioni iniettati a 28,5 gradi Celsius a 24 ore dopo la fecondazione o HPF. Rimuovere gli embrioni morti a 72 ore dalla fecondazione utilizzando un microscopio da dissezione in luce incidente su sfondo bianco. Seleziona animali transgenici con melanociti salvati.

Quando gli animali raggiungono i quattro giorni dopo la fecondazione, trasferiscili in vasche da tre litri nella nursery della struttura per il pesce zebra. A due mesi di età, selezionare gli animali con almeno un'area di salvataggio dei melanociti superiore a quattro millimetri quadrati. Screening settimanale degli animali selezionati per la presenza di tumori.

Isolare gli animali portatori di tumore per lo studio. Disegna le curve di sopravvivenza libera da melanoma con l'età in settimane sull'absa e la percentuale di sopravvivenza libera da melanoma sull'ordinata. Confrontare gli animali con i melanociti che esprimono un gene di interesse per controllare gli animali che esprimono EGFP e i melanociti.

Utilizzare un test di rango logaritmico per determinare se le due curve sono statisticamente diverse. Per eseguire un test di invasione tumorale. Inizia selezionando i pesci zebra isolati che sviluppano tumori dorsalmente in una regione tra il confine posteriore del cervello posteriore e il bordo anteriore della pinna dorsale.

Due settimane dopo l'insorgenza del melanoma, utilizzare il trica per sopprimere il pesce dopo averlo fissato e incorporato nella paraffina. Praticare sezioni trasversali di cinque micrometri attraverso le lesioni. Uno. Ogni 50 micrometri tagliare l'intera lesione in modo da poter identificare il punto di invasione più profonda.

Usa l'ematina e l'eoina per colorare le sezioni. Valutare l'invasione tumorale misurando se le cellule tumorali rimangono al di fuori dello strato collagenoso, invadono la muscolatura dorsale o invadono ulteriormente la colonna vertebrale. Determinare la differenza statistica tra i due set di campioni per eseguire l'immunocolorazione.

Anestetizzare il pesce a 0,17 milligrammi per millilitro di trica con luce incidente al microscopio da dissezione. Usa una pinza affilata a punta fine per strappare le squame dorsali. Fare attenzione a non danneggiare il melanocita contenente metà della squama.

Posizionare le squame direttamente dalla pinza in un millilitro di fissativo e incubare a temperatura ambiente girandole per un periodo maggiore o uguale a due ore. Trasferisci il pesce nell'acqua del pesce e monitora il pesce per confermare il successo del recupero dai melanociti pigmentati sbiancati. Per prima cosa lavare due volte le scale fisse in PBST per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi, aggiungi un millilitro di soluzione di candeggina appena fatta e copri con il profumo o con i tappi per evitare che il gas apra i tubi. Continua a decolorare fino a quando il pigmento non è sparito. Quindi lavare in PBST quattro volte ogni cinque minuti a temperatura ambiente.

Incubare per almeno 30 minuti in soluzione a blocchi, quindi incubare con circa 400 microlitri di anticorpo primario e soluzione a blocchi per una notte A temperatura ambiente il giorno successivo, lavare le squame tre volte per 30 minuti in PBS a temperatura ambiente, incubare con anticorpi secondari per due ore per una notte a temperatura ambiente. Dopo essere stato in piedi con i dpi, applicare una goccia di scudo vettoriale su un vetrino e montare le squame in modo che il lato concavo delle squame sia rivolto verso il basso contro il vetrino. Posizionare un vetrino coprioggetto sui campioni.

Usa lo smalto trasparente per sigillare i bordi e osserva i vetrini al microscopio a fluorescenza. Dopo un ricevente radiante, un pesce Casper di due o tre mesi con 25 grigi di irradiazione gamma un giorno prima del trapianto. Lascia che il pesce si riprenda nell'acqua del pesce.

Usa trica per sopprimere un pesce portatore di tumore, taglia il tumore e mettilo in una capsula di Petri con circa cinque millilitri di filtro sterilizzato 0,9 XPBS con il 5% di FBS con un rasoio a cubetti il tumore mentre è in soluzione lavorando a temperatura ambiente e con una pipetta P 1000 iterare per produrre singole cellule. Aumentare il volume a 25 millilitri. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a maglie di 40 micrometri e centrifugare in una centrifuga da tavolo a 453 RCF per 10 minuti.

Risospendere il pellet in 0,9%PBS 5%FBS alla concentrazione desiderata. Utilizzando un emocitometro, calcolare il numero esatto di cellule e diluire la sospensione cellulare in modo che il volume finale di iniezione sia di circa cinque microlitri. Ad esempio, se devono essere iniettate 50.000 cellule, la sospensione cellulare deve essere diluita fino a una concentrazione finale di 10.000 cellule per microlitro.

Agitare il tubo contenente la sospensione cellulare ogni pochi minuti per evitare la formazione di grumi con etanolo al 100% e 0,9 XPBS. Lavare due o tre volte una siringa Hamilton da 7, 0, 1 e 10 microlitri con punta smussata calibro 26 s prima di caricare la siringa con cinque microlitri di sospensione cellulare. Dopo aver anestetizzato il pesce ricevente irradiato in trica, posizionarlo su un lato su una salvietta Kim umida.

Stabilizzare il pesce con una mano e inserire l'ago con lo smusso rivolto verso l'alto con un angolo di 45 gradi nel fianco del pesce sopra la cavità peritoneale. Circa a metà strada tra il confine posteriore del cervello posteriore e il bordo anteriore della pinna dorsale. Premere delicatamente lo stantuffo.

Lasciare che il pesce si riprenda in acqua fresca e osservare quotidianamente il pesce per l'attecchimento del tumore. Se si è verificato un attecchimento, si può osservare anche una crescita continua e lo sviluppo della malattia. Gli embrioni di zebrafish BRAF FP 53 MIFA a una cellula sono stati iniettati con il mini vettore Cooper contenente il set di oncogeni del melanoma DB one o EGFP ciascuno sotto il controllo del promotore MFA, come mostrato qui.

Le curve di incidenza dei tumori per gli adulti hanno rivelato che il SET DB one ha accelerato significativamente l'insorgenza del melanoma rispetto al controllo EGFP, come si vede qui, la colorazione con ematina ed EOSIN mostra che i melanomi che esprimono SET DB one erano più localmente invasivi rispetto ai melanomi di controllo EGFP. Questa figura mostra le squame dorsali di zebrafish sbiancate o non sbiancate che sono state colorate con un anticorpo che riconosce il fattore di trascrizione mifa localizzato nucleare per valutare la capacità di trapianto del tumore. Le cellule di melanoma sono state isolate da un pesce mifa BRAF FP 53 iniettato con mini cup R-E-G-F-P 50.000 cellule sono state iniettate per via sottocutanea in un mutante Casper ricevente che era stato irradiato il giorno prima con 25 grigi, come si può vedere qui a due settimane di età.

Le cellule pigmentate derivate da donatori sono state facilmente riconosciute. Quindi, dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia del cancro per studiare le conseguenze funzionali dei cambiamenti genetici associati al melanoma utilizzando il pesce zebra. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire lo screening dei modificatori del melanoma mediante test, delle differenze nell'invasione dell'insorgenza del tumore, dell'espressione genica e della capacità di trapianto utilizzando un modello tumorale automatico di zebrafish.