Metodi sperimentali per testare gli effetti del peptide neurotrofico, ADNF-9, Contro L'apoptosi indotta da alcol durante la gravidanza in topi C57BL / 6

Lo scopo di questa procedura è valutare gli effetti neuroprotettivi dei peptidi trofici in un modello di esposizione fetale all'alcol. Ciò si ottiene accoppiando prima gli animali da esperimento e poi trattando le femmine gravide con peptidi trofici come secondo passo, i feti vengono sezionati per isolare il cervello fetale per usi sperimentali. Successivamente, i cervelli fetali vengono incorporati nella gelatina per il sezionamento, seguito dalla colorazione del tunnel per determinare i risultati della morte cellulare.

Ciò dimostra che l'esposizione prenatale all'alcol aumenta il numero di cellule tunnel positive nell'eminenza gangliare. Rispetto alla somministrazione del peptide trofico nel gruppo di controllo, un nove D e F hanno ridotto significativamente l'aumento indotto dall'alcol nelle cellule tunnel positive rispetto agli animali trattati con alcol di controllo. Quindi la dimostrazione visiva di questo metallo è fondamentale in quanto la dissezione del cervello fetale e le fasi incorporate sono difficili da imparare perché i cervelli fetali sono molto piccoli da sezionare e processare per sezionare i topi neri di prima razza C 57 da posizionare topi femmina di sei settimane di circa 20 grammi in gabbie domestiche maschili per due ore immediatamente dopo la rimozione.

Controllare ogni femmina per verificare la presenza di un tappo spermatico per confermare che l'accoppiamento è avvenuto. Se è presente un tappo di sperma, designare questo giorno zero embrionale su E sette pesi corrispondono alle femmine gravide in quattro gruppi. Un gruppo di dieta liquida alcolica fornito come accesso gratuito come unica fonte di nutrienti.

Due gruppi di controllo Perfed tre gruppi di trattamento con peptidi, che dovrebbero ricevere l'iniezione intraperitoneale di un peptide DNF nove insieme all'esposizione all'alcol. Dieta liquida. Registrare il volume di dieta liquida consumata dagli animali in 24 ore da provette graduate con tappo a vite da 30 millilitri per determinare la quantità giornaliera di alcol, dieta liquida o dieta liquida abbinata che può essere fornita tramite un eccesso libero come unica fonte di nutrienti.

Assicurarsi che la dieta liquida appena preparata sia fornita ogni giorno da E 7 a E 13 dopo aver sacrificato la Myer E 13 incinta mediante eutanasia con anidride carbonica, seguita da lussazione cervicale. Stendere la carcassa sulla tavola di dissezione in posizione supina e pulire l'addome con etanolo al 70%. Usa forbici e pinze sterili per praticare un'incisione addominale.

Una volta che l'addome è aperto, tieni l'utero con una pinza e usa una seconda pinza per strappare lentamente e delicatamente l'endometrio dall'utero senza perforare gli embrioni. Rimuovere con cura gli embrioni dall'utero e trasferirli nella soluzione di Hank in una piastra per colture cellulari da 60 millimetri per 15 millilitri su ghiaccio umido, posizionare la capsula e il contenitore del ghiaccio sul tavolino di uno stereomicroscopio utilizzando una pinza ultra fine per la microdissezione. Staccare la pelle degli embrioni nella parte superiore della testa per esporre il cranio.

Una volta che il cranio è esposto e chiaramente visualizzato allo stereomicroscopio, afferrare la base del cranio a livello del midollo spinale e del tronco encefalico con una pinza e iniziare a staccare il cranio. Continua a staccare il cranio pezzo per pezzo dalle parti posteriori a quelle anteriori della testa. Una volta che il cervello è completamente esposto, usa una pinza per estrarlo.

Quindi sezionare il cervello fetale dalla base del bulbo primordiale o di fabbrica alla base del Met Postfix, tutti i cervelli fetali sezionati in paraldeide al 4% per due o tre giorni. I cervelli fetali possono anche essere congelati se li si esegue il test per il western blot o i test enzimatici. Dopo aver preparato una soluzione al 10% di gelatina di grado A preparata in acqua distillata, riempire a metà uno stampo da incorporare staccabile e attendere che la gelatina si solidifichi.

Posizionare il cervello fetale di controllo e quello trattato in epoca prenatale fianco a fianco sopra la gelatina solidificata. Questo per mantenere condizioni coerenti tra il gruppo di controllo e quello sperimentale. Assicurati che la gelatina non sia troppo calda e aggiungi gelatina liquida sopra il cervello fetale per creare uno stampo completo.

Lo stampo finale dovrebbe assomigliare a questa immagine, refrigerare lo stampo di gelatina preparato che trattiene il cervello fetale per 15 minuti. Quindi, staccare la plastica dello stampo da inclusione. Lo stampo finale dovrebbe assomigliare a questo e poi trasferire la gelatina contenente il cervello fetale in paraldeide al 4% per due giorni.

Il terzo giorno, attaccare un blocco di gelatina contenente cervelli fetali fissi allo stadio del vioma. Quindi sezionare i cervelli utilizzando un vioma impostato a uno spessore compreso tra 25 e 50 micron per il sezionamento coronale. Raccogli le sezioni del cervello fetale in PBS, quindi monta le sezioni del cervello fetale su super gelate e scivoli in acqua e lasciali asciugare per 15 minuti.

Trascorsi 15 minuti. Posizionare i vetrini nel PBS per il test del giorno successivo della reazione del tunnel. Per prima cosa, immergere i vetrini in una soluzione di 20 microgrammi per millilitro di proteinasi K e PBS per cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Quindi risciacquare tre volte in PBS per cinque minuti ciascuna su uno shaker orbitale. Incubare le sezioni con perossido di idrogeno al 3% in metanolo per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitare. Quindi lavare i vetrini come prima.

Successivamente, incubare le sezioni in soluzione permeabile per due minuti sul ghiaccio. Dopo l'incubazione, lavato due volte in PBS. Come in precedenza, utilizzare un fazzoletto da laboratorio per asciugare l'area del vetrino attorno alle sezioni.

Quindi usa una penna per disegnare intorno alle sezioni della diapositiva. Ciò impedisce la fuoriuscita della soluzione colorante, consentendo così l'utilizzo di un volume ridotto. Incubare una sezione di ogni coppia con una miscela di reazione a tunnel preparata secondo le istruzioni del produttore.

Aggiungere una soluzione vettore senza reagente tunnel alla sezione di controllo negativo. Quindi incubare i vetrini per un'ora a 37 gradi Celsius. Una volta trascorso il tempo di incubazione, lavare i vetrini tre volte in PBS su un agitatore orbitale come prima.

Quindi asciugare l'area intorno al tessuto con una salvietta da laboratorio. Quindi, incubare le sezioni con la soluzione POD del convertitore per 30 minuti a 37 gradi Celsius senza agitare. Quindi risciacquare le sezioni tre volte per cinque minuti ciascuna con tris HCL.

Trasferire i vetrini in un supporto e metterli in un barattolo di coplin contenente lo 0,05% di DAB e lo 0,003% di perossido di idrogeno. Coprite il barattolo con un foglio di alluminio e posizionatelo su uno shaker orbitale con ghiaccio per sette minuti dopo l'incubazione, lavando il PBS come prima, se lo desiderate. I vetrini possono essere memorizzati in PBS prima di procedere alla colorazione del contatore del missile, come descritto nella parte di testo del protocollo.

Le immagini seguenti mostrano gli effetti del peptide neurotrofico, A DNF nove contro l'apoptosi indotta dall'alcol utilizzando il saggio del tunnel nell'eminenza gangliare poiché l'esposizione prenatale all'alcol allo stadio E 13 ha indotto aumenti della morte cellulare come indicato dalle punte di freccia nel gruppo A LC rispetto al gruppo PF. La somministrazione di A D NF 9 insieme all'esposizione prenatale all'alcol ha indotto una diminuzione delle cellule tunnel positive. L'analisi statistica ha dimostrato che la somministrazione di AD e F nine ha impedito l'aumento indotto dall'alcol nelle cellule tunnel positive.

I valori vengono visualizzati come medie più meno l'errore standard della media. Un singolo asterisco indica un valore P inferiore a 0,052. L'asterisco indica un valore P inferiore a 0,01 secondo il test post hoc di Newman Coles.

Ogni gruppo conteneva un N di quattro. Quindi, dopo il suo sviluppo, questa tecnica consente ai ricercatori e al campo dello sviluppo del cervello di esplorare gli effetti dei farmaci o del composto e dello sviluppo del cervello nei topi.