Tecnica semplice ed efficace per la preparazione delle sospensioni cellulari testicolari

In questo video verrà presentato un protocollo molto semplice ed efficiente per ottenere la sospensione cellulare del materiale di prova dai roditori in soli 15 minuti. Il metodo è stato applicato per testare il test su porcellini d'India di topo e ratto e utilizza un dispositivo meta macchina per disaggregare il tessuto incapsulato. Dopo una filtrazione e una colorazione, l'inion della cella è pronto per il flusso.

L'omogeneità delle popolazioni cellulari è un prerequisito per l'analisi degli eventi biochimici e molecolari durante il differenziamento maschile di GA. Pertanto, l'eterogeneità testicolare con oltre 30 diversi tipi di cellule rappresenta uno dei maggiori problemi riguardanti lo studio delle basi molecolari della spermatogenesi dei mammiferi. Per questo motivo, sono stati utilizzati vari metodi per ottenere l'arricchimento di popolazioni di cellule testicolari purificate, tra cui l'illustrazione PU e centrifuga.

Il primo passo per qualsiasi metodo di separazione cellulare è la preparazione di una sospensione cellulare. Tuttavia, i protocolli attuali richiedono solitamente molto tempo e possono implicare la perdita di molecole a vita breve come gli RNA, il che è indesiderabile per l'analisi dell'espressione ulteriore. Il vantaggio principale del protocollo qui presentato è che elimina i passaggi tra il sacrificio animale e gli studi molecolari specifici dello stadio dello sperma, ma allo stesso tempo garantisce una buona qualità e un'eccellente rappresentazione del tipo di cellula nelle sospensioni cellulari.

A dimostrare la procedura saranno la dottoressa Ana Rodriguez, ricercatrice presso il laboratorio AL che ha sviluppato il metodo e la citometria a flusso Federico San Lopez che si è occupata dell'analisi citometrica. La procedura richiede una piccola attrezzatura, il sistema meach, con i suoi accessori medicon e fcon. Tuttavia, gli accessori fcon possono essere perfettamente sostituiti da membrane in nylon della stessa dimensione dei pori.

Gli unici altri materiali e reagenti necessari sono il vetro, due piatti, forbici e pinze, una siringa da tre a cinque millilitri per infastidire la camera intestinale, il terreno di coltura DMM integrato con il 10% di siero per la tosse fetale e NDA. Se sono previste applicazioni a valle che coinvolgono manipolazioni dell'RNA, tutti i materiali e le soluzioni devono essere trattati di conseguenza per eseguire il protocollo. Posizionare il testicolo sezionato in un vetro da 96 millimetri per i dati mostrati contenente 10 millilitri di ghiaccio integrato chiamato dm.

Rimuovere il TAL Virginia, tagliare il decap testis in pezzi quadrati di due o tre millimetri per lato. Metti quattro o cinque di questi pezzi in un medicon desegregato usa e getta insieme a un millilitro di codice integrato D ed elaborato nel sistema meta macchina per 50 secondi. Ogni unità medica contiene uno schermo fisso in acciaio inox con un centinaio di fori esagonali circondati da sei micro lame.

Il tessuto viene portato a ciascun foro da un rotore metallico all'interno della camera medica e desegregato passando sopra i fori affilati e attraverso lo schermo metallico, mentre una micro pompa sotto lo schermo fornisce liquido e lava gli scafi. Recuperare il risultato in sospensione cellulare dal medicon utilizzando una siringa da tre a cinque millimetri senza ago. Successivamente immergere un falco da 50 micrometri o una stessa rete di nylon di quattro dimensioni con mezzo millilitro di terreno e filtrare la sospensione attraverso di essa.

Ripetere il passaggio, ma utilizzando una rete di nylon da 25 micrometri o un'unità di falco equivalente e posizionare sul ghiaccio, prendere una quota ALI della sospensione cellulare da contare in una camera noyer e regolare la concentrazione cellulare da una a due volte 10 alle sette cellule per millilitro nei terreni di coltura. Infine, aggiungere NDA a una concentrazione finale dello 0,2% per evitare il pompaggio cellulare e anche per evitare l'intasamento muscolare durante i successivi studi di flusso. Se si intende valutare la vitalità cellulare, questa può essere eseguita per mezzo del kit di vitalità viva morta per cellule animali seguendo le istruzioni del produttore prima dell'analisi citofluorimetrica, aggiungere un colorante fluorescente.

La scelta del fluorocromo dipenderà dai laser disponibili. In questa dimostrazione, verrà mostrato l'uso di diversi coloranti che legano il documento al DNA. Sebbene la dieta propidium yo sia il colorante usuale per cellule fisse o morte a basse concentrazioni, abbiamo scoperto che quando viene utilizzato ad alte concentrazioni, il ROM entra nelle cellule testicolari non fissate nelle sospensioni preparate con il metodo qui presentato.

Ciò è probabilmente dovuto allo stress meccanico implicito, che in combinazione con la natura sensoriale dell'epitelio semiale potrebbe portare alla rottura dei ponti di collegamento cellula-cellula con una manipolazione minima Per la colorazione con ioduro di propidio 10 minuti prima dell'analisi del campione nella soluzione a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro nella sospensione cellulare e incubare a zero gradi Celsius al buio Per analizzare le cellule di colorazione mu del propidio. Per un'ulteriore ordinazione, utilizziamo un citometro a flusso fax vantage dotato di un laser a ioni targon coerente sintonizzato per emettere a 488 nanometri. La potenza del laser è impostata su un centinaio di milliwatt e la fluorescenza emessa dal propidio I viene raccolta da un rivelatore FL 2 utilizzando un filtro passa-banda 5, 7, 5, slash, 26

Utilizzare un ugello da 70 micrometri per le misure di citometria a flusso e il software squa per analizzare i seguenti parametri. Diffusione laterale diretta, fluorescenza totale emessa o area dell'impulso e durata delle emissioni fluorescenti o larghezza dell'impulso. I risultati sono presentati in grammi che rappresentano il numero di eventi a ciascun livello di fluorescenza e in grafici D che mostrano la dispersione laterale rispetto all'area dell'impulso fluorescente e l'area dell'impulso fluorescente rispetto alla sua larghezza.

I doppietti sono esclusi dall'analisi utilizzando grafici DO dell'area dell'impulso fluorescente rispetto alla sua larghezza per lo smistamento di popolazioni di monociti SM con la modalità di smistamento impostata per il fax in R normale o C normale e utilizzando tre gocce ordinate come busta. Regolare il differenziale del campione per analizzare le cellule a una velocità compresa tra 500 e 1500 al secondo. Conservare le provette per campioni e di raccolta a tre o quattro gradi Celsius utilizzando un'unità di refrigerazione.

In alternativa, le cellule della sospensione possono essere colorate con altri fluorocromi. Ad esempio, il colorante vitale. HER 3 3 3 4 2 può essere utilizzato ad una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro e incubato per almeno 10 minuti a 37 gradi, al riparo dalla luce per Hirsch.

3, 3, 3, 4, 2 campioni di macchie. L'analisi cellulare è stata eseguita per mezzo di un citometro a flusso MO dotato di un laser a lunghezza d'onda di eccitazione UV operante a 25 milliwatt e di un ugello da 70 micrometri. Utilizzare il software Summit 4.3 o simile per analizzare gli stessi parametri indicati in precedenza: quando le sospensioni cellulari vengono analizzate in ottica di contrasto facciale, si osservano sospensioni di qualità di taglio.

I principali vantaggi di questo protocollo sono in primo luogo le sospensioni di cellule testicolari preparate utilizzando le numerose macchine e ottenendo solo 15 minuti tra cui test C-cesareo, taglio tissutale, ach, lavorazione meccanica e filtrazione questo lasso di tempo si estende circa un ottavo del tempo solitamente impiegato da altri protocolli. La brevità di questo protocollo, insieme a una minima manualità coinvolta, spiegherebbe la buona conservazione delle macromolecole a vita breve, che è fondamentale quando è richiesto un campione rappresentativo di composti presenti nella popolazione cellulare originale. Poiché il metano comporta una manipolazione minima, è facilmente riproducibile in questa tabella.

Le percentuali relative delle diverse popolazioni di cellule testicolari per sette esperimenti indipendenti eseguiti con ratti adulti e analizzati mediante citometria a flusso sono presentate come esempio per dimostrare la riproducibilità del metodo. A differenza della maggior parte delle particelle attualmente utilizzate per la preparazione di sospensioni di cellule testicolari, il metodo qui presentato non prevede un'azione enzimatica. Sebbene la collagenasi goccioli in un RNA, che sono gli enzimi generalmente inclusi, contribuiscono a rendere inadeguata la segregazione del tessuto, possono influenzare la conservazione delle macromolecole di interesse.

La mancanza di trattamenti enzimatici non solo favorisce la conservazione dell'RNA e delle proteine, ma rende anche più economico un protocollo. Sebbene fosse stato precedentemente riportato che le sospensioni cellulari preparate meccanicamente si aggregavano più facilmente di quelle tripizzate, abbiamo scoperto che questo protocollo porta a sospensioni cellulari ben desegregate in assenza di azione enzimatica. L'inclusione di NDA si è dimostrata molto utile nella prevenzione dell'aggregazione cellulare.

La buona qualità delle sospensioni si evidenzia anche quando i campioni vengono sottoposti ad analisi citometrica a giudicare dai minimi detriti cellulari osservati. Secondo le informazioni pubblicate, circa il 13% degli spermatozoi rotondi si trova come multinucleato quando le sospensioni cellulari vengono preparate con un metodo esclusivamente meccanico o in presenza di tripsina. Tuttavia, molte sospensioni preparate a macchina producono multinucleati molto scarsi, molto probabilmente a causa della riduzione dell'aggrovigliamento, poiché è stato affermato che i multinucleati vengono prodotti principalmente come conseguenza della manipolazione dei tessuti.

In questa immagine si osserva un esempio di una sospensione cellulare preparata a macchina dal testicolo di ratto. Come si può vedere. I citoplasmi sono ben conservati: le percentuali relative di popolazioni di cellule C, due C e quattro C in molte sospensioni testicolari preparate a macchina per diversi roditori, riassemblate, quelle dei PE intatti.

Ciò supporta l'ipotesi che il metodo qui descritto non danneggi selettivamente alcun tipo di cellula specifico. Sorprendentemente, la rappresentazione del tipo di cellula in molte sospensioni preparate a macchina è molto meglio mantenuta rispetto ai classici metodi di preparazione della gocciolata. Come si può notare, la citografica ottenuta per le sospensioni di cellule testicolari processate con meine non differisce sostanzialmente da quelle precedentemente riportate.

Infatti, gli istogrammi e i dot plot ottenuti mostrano le tre caratteristiche quattro popolazioni di cellule testicolari da C a C e C in base al contenuto di DNA, nonché la popolazione apparentemente subha, che rappresenta gli spermatozoi aploidi altamente condensati. Questi profili sono stati osservati rispettivamente per le sue sospensioni di colorazione di ioduro di propidio o di propidio, e questo vale sia per gli esemplari adulti che per quelli giovani. Lo smistamento delle cellule sper mitogeniche è stato raggiunto con successo con una purezza superiore al 98%, sia per popolazioni testicolari selezionate in base al contenuto di DNA che per sottopopolazioni con lo stesso contenuto di DNA, ma con un diverso livello di condensazione della cromatina, come i denti del sonno e i miociti dei denti.

Come abbiamo potuto osservare nelle sospensioni dei test per porcellini d'India, poiché il protocollo non include il trattamento con RNA, le popolazioni selezionate rendono una buona qualità dell'RNA e consentono studi di espressione genica differenziale anche per le popolazioni colorate con ioduro di propidio. In tal senso, vale la pena ricordare che a differenza di altri coloranti, colorazioni di ioduro di propidio, DNA e RNA a doppio filamento, tuttavia, in questo grafico di un'analisi della sospensione testicolare di cavia, i profili simili ottenuti utilizzando lo ioduro di propidio in parallelo con il ciclo vibrante arancione. Questo è un colorante vitale specifico del DNA per dimostrare che la colorazione dell'RNA non influenza significativamente i modelli citometrici dell'istogramma.

Questo elenco riassume i principali vantaggi del protocollo percentuale. Il metodo ottimizzato qui descritto consente di accelerare la preparazione di sospensioni di cellule testicolari adatte per l'analisi citometrica di diversi stadi spermatici da roditori in soli 15 minuti, compresa la dissezione del testicolo, il taglio dei tessuti e il processamento attraverso il sistema ME machine. La brevità, la maggiore riproducibilità, la qualità e le proporzioni del tipo di cellula nelle sospensioni cellulari lo rendono una buona alternativa ad altre tecniche di auto-preparazione, più noiose e dispendiose in termini di tempo, attualmente in uso.

Inoltre, poiché questo metodo comporta pochissime manipolazioni ed evita enzimi e detergenti, è la scelta ideale per applicazioni delicate a valle, come gli studi di espressione genica.