Drosophila adulti olfattiva Shock Learning

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la memoria associativa utilizzando il saggio olfattivo con shock elettrico su drosophila adulta. Questo viene realizzato innanzitutto raccogliendo le mosche sotto anestesia con anidride carbonica. Il secondo passaggio consiste nell'esporre simultaneamente le mosche a uno shock elettrico e a un primo odore A nel team A. Successivamente, le mosche vengono esposte al secondo odore B senza alcuno shock.

Infine, le mosche vengono portate al punto di scelta nel team a's, dove sono esposte contemporaneamente all'odore A e all'odore B. Dopo due minuti di tempo di distribuzione, le mosche che hanno scelto l'odore A e quelle che hanno scelto l'odore B vengono raccolte separatamente e contate sotto anidride carbonica. Questo permette il calcolo dell'indice di prestazione (PI) per ciascun odore. L'indice di prestazione finale (PI) si ottiene facendo la media del PI di due esperimenti separati: uno in cui l'odore A è associato allo shock e un secondo in cui l'odore B è associato allo shock.

Questo metodo può fornire informazioni sull'effetto dello stato interno dell'animale e della memoria. Ad esempio, variando l'età, l'alimentazione e il sonno, può essere applicato anche ad altri sistemi. Ad esempio, è analogo ai test di condizionamento al timore mediati da roditori o da fattoria, con i geni e i meccanismi dell'apprendimento altamente conservati tra insetti e mammiferi.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché preparare le mosche per il saggio e spostarle all'interno e all'esterno dei dispositivi è difficile da imparare e non facile da comprendere soltanto attraverso un protocollo scritto. Per iniziare, allevare le mosche su una dieta standard in condizioni di ciclo luce/buio di 12 ore a 25 gradi Celsius; uno o due giorni prima dell'esperimento, anestetizzare le mosche con anidride carbonica e dividerle in quattro gruppi di 25. Conservare le mosche durante la notte in provette con alimento senza lievito a 25 gradi Celsius e 70% di umidità, in una stanza a condizioni ambientali controllate con ciclo luce/buio di 12 ore.

Successivamente, preparare dei MA personalizzati in perspex per il team e verificare regolarmente l'adattamento dei tubi per assicurare un sigillo a tenuta d'aria durante l'esperimento; posizionare griglie di rame su misura all'interno dei tubi di addestramento. Pulire regolarmente le griglie e sostituirle se dovessero ossidarsi. Utilizzare morsetti a coccodrillo per collegare le griglie di rame ai fili che conducono a una scatola di commutazione collegata a uno stimolatore elettrico.

Quindi applicare un voltmetro per assicurarsi che l'apparecchiatura eroghi la scossa richiesta. Successivamente, fissare saldamente il labirinto con morsetti a G. Per evitare perdite d'aria, collegare il labirinto a forma di T a un tubo collegato a una pompa d'aria, in modo che gli odori vengano aspirati attraverso i moscerini e rimossi dall'apparato.

Mantenere un flusso d'aria leggero a due litri al minuto, quindi diluire il metilcicloetanolo o MCH in rapporto 1:67 e l'ottanolo o OCT in rapporto 1:100 in olio minerale. Successivamente, pipettare 30 microlitri dell'odore diluito nella coppetta per odore. Preparare una coppetta per odore su misura e coprire un blocco odoroso con un tubo di plastica munito di coperchio forato.

Inserire la coppetta per odori realizzata su misura nel blocco degli odori. Questo meccanismo permette all'aria di essere aspirata sopra l'odore contenuto nella coppetta, esponendo così le mosche a una nube odorosa. Eseguire tutti gli esperimenti di condizionamento olfattivo con stimolo elettrico negli adulti sotto una luce rossa fioca, che consente al ricercatore di vedere, ma impedisce alla mosca di percepire stimoli visivi, assicurando che gli insetti si concentrino esclusivamente sugli stimoli olfattivi piuttosto che su quelli visivi.

Successivamente, introduci le mosche nel tubo di addestramento collegato ai TMAs e lasciale adattare al tubo e al flusso d'aria per 90 secondi. Presenta il primo odore MCH con una scossa di 60 volt costituita da 12 impulsi di 1,25 secondi con intervalli interpulsivi di 3,75 secondi per una durata totale di 60 secondi.

Seguire lo shock con un periodo di riposo di 32 secondi. Presentare il secondo odore di OCT per 60 secondi senza uno shock. Seguire lo shock con un periodo di riposo di 32 secondi.

Quindi ruotare il dispositivo di addestramento lateralmente e battere delicatamente la base su un tappetino per mouse, in modo da spostare le mosche dalla camera di addestramento alla camera centrale. Dopo aver mantenuto le mosche nella camera centrale per 90 secondi, inserire i tubi di scelta alla base dell'apparecchio per formare il team A al fine di misurare l'apprendimento. Spostare le mosche fino al punto di scelta dei compagni e contemporaneamente esporle a entrambi gli odori per 120 secondi.

Catturare le mosche nei tubi di scelta spostando verso l'alto la camera centrale. Quindi raccogliere le mosche dal compartimento centrale e da ciascun braccio dei compagni di squadra in provette alimentari separate. Etichettare chiaramente le provette indicando il tipo di mosche e la scelta relativa all'odore, quindi contarle per misurare la memoria.

Raccogliere le mosche dopo l'addestramento e trasferirle dai compagni di squadra a provette con alimento privo di lievito. Conservare le mosche al buio a 25 gradi Celsius e al 70% di umidità, come descritto nel protocollo testuale allegato. Successivamente, reintrodurre le mosche nel team aze.

Per la memoria a lungo termine. Utilizzare un labirinto appositamente costruito che consenta di addestrare contemporaneamente più gruppi di moscerini. Somministrare cinque cicli di addestramento.

Mantenere i moscerini a 18 °C e 70% di umidità al buio fino al test. Prima del test, trasferire i moscerini a 25 °C e lasciarli ambientare per almeno un'ora.

Valutare la memoria a lungo termine. 24 ore dopo l'addestramento. Dopo gli esperimenti comportamentali, pulire i contenitori per odori con acqua calda e detersivo inodore.

Dopo l'essiccazione, applicare 10 microlitri di sigma coat sulle coppe odorose. Successivamente, riscaldare le coppe odorose in un forno a microonde per solidificare il sigma coat. Valutare l'acuità olfattiva introducendo 100 moscerini nel team aze dopo 90 secondi, quindi trasferire i moscerini al punto di scelta e permettere loro due minuti per scegliere tra odori puri e aria.

Quindi raccogliere e contare le mosche. Per la reattività allo shock. Introdurre le mosche nella camera di shock.

Dopo 90 secondi di riposo, applicare una scossa elettrica continua di 60 volt. Alcune mosche fuggiranno verso un tubo simile senza scossa. Lasciare le mosche libere di scegliere per due minuti.

Quindi raccogliere e contare le mosche che sono fuggite dal tubo di shock per chiarire gli effetti dell'apprendimento. Una serie di esperimenti è stata eseguita con mosche adulte di tipo selvatico Canton s e con mosche adulte mutant DS per lo studio dell'apprendimento. Le mosche Duns mostrano una riduzione dell'apprendimento rispetto alle mosche di tipo selvatico.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di tenere traccia con precisione di quali mosche sono quali e di cosa è stato fatto loro. Attenzione: le mosche possono essere facilmente stressate durante la preparazione, l'addestramento e i test. Assicurarsi di minimizzare lo stress e di essere coerenti.

Non dimenticare che le prestazioni di Joslin possono mostrare variazioni da un giorno all'altro. Pertanto, adotta la precauzione di eseguire le tue procedure di controllo e sperimentali approssimativamente alla stessa ora della giornata e nelle stesse condizioni. Se i tuoi controlli smettono di imparare, cerca di analizzare cosa è stato fatto in modo diverso rispetto ai giorni in cui l'esperimento funziona.

Dopo aver isolato la variabile, cerca di essere più coerente con essa quando esegui il test della memoria. In futuro, buona fortuna.