Gene Trapping Utilizzo Gal4 in Zebrafish
September 29th, 2013
Questo protocollo descrive il metodo di trappola gene inserzionale mutagenesi utilizzando Gal4-VP16 come giornalista primario e GFP / RFP come reporter secondarie in zebrafish. Circa uno su dieci-alta esprimendo F0 gene rendimento pesce trappola progenie co-esprimono GFP e RFP. La procedura di screening può essere facilmente scalata per adattarsi alle dimensioni del laboratorio che esegue lo schermo mutagenesi inserzionale.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre pesci mutanti utilizzando la trasposizione di rottura genica su vettori con GAL four, VP 16 come reporter primario della trappola genica. Ciò si ottiene coiniettando prima il vettore della trappola genica insieme a due trasposizioni alte in embrioni di pesce zebra. Gli embrioni iniettati vengono sottoposti a screening per la fluorescenza GFP tre giorni dopo la fecondazione e circa il 30% degli embrioni più brillanti viene selezionato per stabilire il pool F zero.
Successivamente, i pesci F zero vengono incrociati con la linea di tester U-A-S-M-R-F-P per lo screening della trasmissione germinale degli eventi di trappola genica. Il passo finale consiste nell'incrociare l'F1 per stabilire la generazione F 2 e generare embrioni per la caratterizzazione molecolare degli eventi di trappola genica mediante PCR inversa e razza a cinque prime. In definitiva, circa un pesce F zero su 10 sottoposto a screening dovrebbe produrre una progenie di trappole genetiche.
I traspos di rottura genica sono stati progettati per non produrre mutazioni dopo l'integrazione negli ingressi dei geni codificanti proteine. I nostri vettori GBT utilizzano G 4 P 16 come reporter primario della trappola genica. Questa modifica aumenta la sensibilità per i geni espressi a bassi livelli e ci rende possibile utilizzare mutanti trappola genica senza evitare eccessivamente i fenotipi come quattro driver G per l'espressione tessuto-specifica di altri transgeni.
Riteniamo che il principale collo di bottiglia del nostro metodo sia il raggiungimento di tassi sufficientemente elevati di integrazione genica nella linea germinale dei pesci F zero. In questa dimostrazione, tratteremo diversi passaggi critici, la preparazione del DNA, la MICROINIEZIONE e lo screening F zero. Il vettore di trappola genica GBTB one utilizza GAL four VP 16 come reporter primario della trappola genica.
Le due trasposizioni alte minime alle estremità vengono utilizzate per l'integrazione della trappola genica. Gli eventi di trappola genica sono rilevati direttamente da un reporter EGFP sotto il controllo di 14 X GAL quattro UAS. L'intera cassetta della trappola genica è fiancheggiata da blocchi diretti dei siti P.
Ciò rende reversibili gli eventi di trappola genica mediante l'espressione dei pettini di Cree per stabilire la prova di una relazione di causalità tra una specifica integrazione di trappola genica e un fenotipo osservato. Inoltre, la cassetta U-A-S-E-G-F-P è affiancata da siti FRT diretti. L'iniezione di mRNA flip combs porterà all'escissione della cassetta U-A-S-E-G-F-P, lasciando la mutazione della trappola genica non marcata dalla fluorescenza EGFP e consentendone l'uso in linee transgeniche che marcano tessuti specifici o eventi di sviluppo mediante fluorescenza GFP prima della micro iniezione.
Preparare la trasposizione sul DNA e la trasposizione dell'mRNA. Preparare il GBTB un DNA vettore trappola genica. Utilizzando un mini kit di preparazione standard e seguendo il protocollo del produttore, è essenziale includere la fase di lavaggio PB durante la preparazione del DNA.
In caso contrario, il mini DNA di preparazione sarà contaminato da RNA, A che porta alla degradazione del Mr.NA trasposto, diluire il DNA in acqua libera di RNA a 10 nanogrammi per microlitro. Per preparare il due alto traspone l'mRNA prima linearizzato PT tre TS T due usando xbo uno. Successivamente, trascrivi il DNA linearizzato utilizzando una macchina a messaggio M Kit di trascrizione in vitro T three con una modifica.
Aggiungere 0,5 microlitri di inibitore degli RNA del rib lock dopo la fase di trattamento del DNA, purificare l'mRNA utilizzando un kit standard e valutare la qualità dell'mRNA trascritto in vitro mediante elettroforesi su gel agros. Diluire l'mRNA in acqua libera di RNA a 40 nanogrammi per microlitro e conservarlo come aliquote di due microlitri a meno 80 gradi Celsius appena prima della micro iniezione. Preparare la miscela per iniezione aggiungendo otto microlitri di trasposizione diluita sul DNA a un'aliquota di due microlitri di mRNA trasposto.
Iniettare tre nanolitri di miscela D-N-A-R-N-A nel tuorlo di embrioni di pesce zebra a una cellula utilizzando tecniche di microiniezione standard mirando all'interfaccia blasfema del tuorlo Dopo l'iniezione, eseguire cinque microlitri di soluzione per iniezione rimanente su un gel all'1% di aros per il controllo di qualità per garantire che l'mRNA trasposto non sia stato degradato circa sei-otto ore dopo l'iniezione. Rimuovere gli embrioni non fecondati e morti e distribuire gli embrioni in 60-80 per piastra di Petri da 100 millimetri. Gli embrioni anormali e morti vengono rimossi un giorno dopo la fecondazione, due giorni dopo la fecondazione e tre giorni dopo la fecondazione a tre giorni dopo la fecondazione sotto uno stereomicroscopio dotato di fluorescenza o un microscopio verticale.
Esamina gli embrioni e rimuovi eventuali embrioni anomali. Esamina gli embrioni rimanenti senza difetti evidenti. Per la fluorescenza GFP, selezionare gli embrioni F zero più luminosi e allevarli utilizzando le procedure standard di allevamento del pesce zebra zebra in questo laboratorio.
I GBT vengono solitamente iniettati in linee con modelli di pigmentazione wild type o leopardo. È ragionevole aspettarsi che il 20-30% degli embrioni iniettati selezionati per l'allevamento sopravviverà fino all'età adulta. L'integrazione del vettore trappola genica GBTB one può portare all'espressione di EGFP attraverso due diversi meccanismi.
Il primo è un vero e proprio evento di trappola genetica. Il vettore integra in un gene un trascritto di fusione tra i cinque primi di quel trascritto genico endogeno e il GAL quattro VP 16 viene prodotto e tradotto in una proteina di fusione contenente l'estremità terminale della proteina e rivestita dal gene mutato dell'inserto e GAL quattro, VP 16. Questa proteina di fusione si lega al 14 XUAS e attiva la trascrizione di EGFP.
Il secondo evento meno desiderabile è una trappola potenziatrice. Il promotore minimo davanti all'EGFP cade sotto il controllo di un enhancer vicino al sito di integrazione che porta alla produzione di EGFP in assenza di GAL quattro, VP 16. Per distinguere tra queste due classi di eventi, è stata realizzata una linea transgenica 14 X-U-A-S-M-R-F-P contrassegnata da GFP cristallina gamma specifica per la lente.
Gli eventi di trappola genica sono verificati incrociando pesci iniettati con GBT con pesci omozigoti U-A-S-M-R-F-P e screening per la co-espressione di GFP e RFP, che è possibile solo se GAL quattro, VP 16 viene prodotto e attiva U-A-S-M-R-F-P in trans per iniziare la procedura di screening F zero pesci incrociare singoli F zero con pesci omozigoti U-A-S-M-R-F-P. Poiché i pesci iniettati con GBT hanno modelli di pigmentazione wild type o leopard e la linea omozigote U-A-S-M-R-F-P è su uno sfondo di ottone, il pesce F zero può essere facilmente distinto dal pesce U-A-S-M-R-F-P eliminando la necessità di registrare se l'F zero sottoposto a screening era un maschio o una femmina, così come potenziali errori derivanti da errori nella registrazione e/o nella determinazione del sesso di ciascun pesce. Il giorno successivo.
Rimetti i pesci in ottone U-A-S-M-R-F-P nella loro vasca. Posizionare i pesci F zero che hanno dato gli embrioni in vasche statiche individuali mentre gli embrioni vengono raccolti per lo screening pulito e trasferire gli embrioni raccolti in nuove piastre di Petri nel pomeriggio del giorno zero. Screening degli embrioni per la fluorescenza GFP e RFP un giorno dopo la fecondazione e tre giorni dopo la fecondazione.
Estrarre gli embrioni positivi sia per GFP che per RFP, ordinarli in base al modello di espressione G-F-P-R-F-P. Se si osserva più di un modello in una frizione e allevarli per stabilire la generazione F1. Si noti che gli embrioni PF 3D che sono positivi per GFP ma non per RFP non vengono estratti in quanto rappresentano eventi di trappola potenziatrice.
Incrocia nuovamente il pesce F zero che ha prodotto una progenie positiva G-F-P-R-F-P per ottenere un secondo lotto di positivi. I pesci F1 vengono sottoposti a screening per stabilire le famiglie F two, per documentare il modello di espressione del gene trapp e per congelare lotti di embrioni per l'identificazione molecolare dei loci delle trappole geniche. Per prima cosa incrociare i singoli pesci F1 con i pesci omozigoti U-A-S-M-R-F-P il giorno successivo. Posizionare i pesci F1 che hanno dato gli embrioni in vasche statiche individuali mentre gli embrioni vengono raccolti per lo screening un giorno dopo la fecondazione.
L'etichettatura RFP potrebbe non essere ancora stata presentata, quindi esamina gli embrioni per la fluorescenza GFP ed estrai gli embrioni positivi alla GFP tre giorni dopo la fecondazione, lo screening per la fluorescenza GFP e RFP ed estrai i doppi positivi. Quindi fotografare gli embrioni positivi sia per GFP che per RFP a cinque giorni dopo la fecondazione, congelare lotti di 20 embrioni G-F-P-R-F-P positivi e 20 G-F-P-R-F-P negativi per l'identificazione dei geni mutati dell'inserto mediante PCR inversa e cinque razze prime. Allevare i restanti embrioni positivi G-F-P-R-F-P per stabilire la generazione F due in un'iniezione di successo.
Almeno l'80% degli embrioni iniettati con la trappola genica DNA alto due traspose miscela di mRNA mostrerà un certo grado di fluorescenza GFP. Una bassa espressione di GFP indica l'iniezione non riuscita o la degradazione dell'RNA trasposto a causa della contaminazione degli RNA. Quando gli embrioni GFP positivi più brillanti vengono selezionati per stabilire il pool F zero, circa uno su 10 pesci F zero sottoposti a screening produrrà una progenie di trappole geniche tra i pesci F zero da cui vengono recuperati gli eventi di trappola genetica.
La maggior parte trasmette un singolo evento di trappola genica oltre a diverse trasposizioni non espressive su integrazioni. Poiché l'intera cassetta trappola genica è fiancheggiata da siti P di locks diretti, qualsiasi mutazione della trappola genica illustrata in questo diagramma con caselle blu che rappresentano esoni del gene mutato è reversibile mediante l'espressione dei pettini CRE. Queste immagini mostrano la co-espressione di GFP e RFP nel sistema nervoso dell'NSF TP sei gene L'iniezione di RNA Cree in N SF TP sei embrioni porta alla perdita di espressione di GFP e RFP.
Si noti che non vi è alcuna riduzione dell'espressione di GFP nel cristallino come previsto. La maggior parte delle procedure qui descritte sono applicabili ad altri screening di trappole geniche, nonché a regolari esperimenti di transgenesi con TOL due e altri trasposoni Con la procedura di trappola genica descritta qui. L'impostazione di 20-30 incroci F zero out a settimana dovrebbe portare al recupero di una trappola genica a settimana.
Tuttavia, la procedura può essere facilmente scalata.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per la mutagenesi da inserimento mediante gene trap nei pesci rossi utilizzando Gal4-VP16 come reporter primario e GFP/RFP come reporter secondari. La procedura permette l'identificazione della prole gene trap che co-esprime GFP e RFP, con un processo di screening che può essere scalato in base alle dimensioni del laboratorio.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Genetica
- Biologia dello sviluppo
- Modelli transgenici
Sfondo
- La mutagenesi da inserimento mediante gene trap è una tecnica utilizzata per creare mutazioni in geni specifici.
- Gal4-VP16 serve come reporter sensibile per l'espressione genica.
- GFP e RFP sono utilizzati per visualizzare gli eventi gene trap.
- Il metodo mira a minimizzare le mutazioni indesiderate durante l'integrazione.
Obiettivo dello studio
- Produrre pesci rossi mutanti per l'analisi funzionale dei geni.
- Migliorare la sensibilità del rilevamento dell'espressione genica.
- Stabilire un metodo di screening affidabile per gli eventi gene trap.
Metodi utilizzati
- Co-iniezione di vettori gene trap e mRNA di transposasi negli embrioni di pesce rosso.
- Screening per la fluorescenza GFP a tre giorni post-fecondazione.
- Incrocio di pesci F0 con linee tester U-A-S-M-R-F-P per verificare la trasmissione della linea germinale.
- Outcrossing F1 per stabilire la generazione F2 per la caratterizzazione molecolare.
Principali risultati
- Circa il 30% degli embrioni più luminosi sono stati selezionati per ulteriori analisi.
- Circa un pesce F0 su dieci ha prodotto prole gene trap.
- Gli eventi gene trap sono stati confermati attraverso la co-espressione di GFP e RFP.
- Sono stati identificati meccanismi di integrazione, inclusi eventi di vero gene trap e enhancer trap.
Conclusioni
- Il metodo genera efficacemente mutanti di pesce rosso per gli studi sulla funzione genica.
- Alti tassi di integrazione gene trap sono cruciali per risultati di successo.
- Questo approccio consente la marcatura reversibile degli eventi gene trap per ulteriori ricerche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Gene trap insertional mutagenesis in zebrafish enables high-throughput functional annotation of genes in a vertebrate system, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The use of Gal4-VP16 as a primary reporter enhances sensitivity for low-abundance transcripts and allows converted trap lines to serve as tissue-specific drivers for transgene expression, facilitating pathway interrogation and phenotypic screening. This approach improves predictive confidence by linking genotype to tissue-specific phenotypes without relying on overt developmental defects, particularly valuable for genes with redundant or non-essential functions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through insertional mutagenesis that tags endogenous gene expression with Gal4-VP16 for sensitive detection.
- Operational Value: Generates reversible gene trap mutations via loxP-flanked cassettes, allowing causal validation of phenotype-genotype relationships through Cre-mediated excision.
- Scientific Value: Supports functional target validation by converting trapped loci into Gal4 drivers to direct expression of effector transgenes in specific tissues, clarifying gene function in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative dual-reporter readouts (GFP/RFP co-expression) to distinguish true gene trap from enhancer trap events, improving assay specificity.
- Operational Value: Establishes a scalable germline transmission pipeline where ~10% of screened F0 founders yield transmissible gene trap alleles, supporting consistent mutant line generation.
- Scientific Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening by freezing batches of double-positive embryos for molecular identification of trap loci via inverse PCR and 5' RACE.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Recovers trap mutations in genes encoding nuclear, cytoplasmic, and membrane proteins, ensuring broad target coverage without bias toward nuclear localization.
- Operational Value: Facilitates translational continuity by enabling F2 intercrosses to document expression patterns and freeze embryos for genotyping, supporting preclinical validation workflows.
- Scientific Value: Promotes mechanistic de-risking by allowing reversible marking of mutations, thus distinguishing causal gene trap integrations from positional effects in phenotypic screens.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early mutagenesis through lead identification, where gene trap lines serve as both mutant alleles and Gal4 drivers for pathway-specific transgene expression, supporting iterative target validation and assay refinement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by tagging endogenous loci with Gal4-VP16 to monitor expression dynamics in vivo during chemical or genetic perturbation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs via GFP/RFP co-expression scoring, enabling standardized comparison of mutant and wild-type conditions across screening campaigns.
- Analytics: Generates molecular readouts (inverse PCR, 5' RACE) that enable precise identification of trapped genes, supporting data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by preserving embryos for genotyping and expression analysis, ensuring phenotypic observations are linked to validated genetic lesions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reversible, scalable platform where founder fish can be repeatedly outcrossed to generate F2 families, supporting longitudinal studies and cross-project reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by enhancing detection of low-expression genes and enabling tissue-specific transgene expression without requiring phenotypic penetrance.
- Operational Value: Standardizes mutant generation through defined injection ratios, fluorescence-based sorting, and germline transmission screening, improving reproducibility across labs.
- Strategic Value: Reduces biological risk in lead identification by providing reversible, allele-specific models for target validation, minimizing false positives from insertional artifacts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through allelic series generation and phenotypic deconvolution, supporting go/no-go decisions based on mechanistic evidence rather than phenotypic severity alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish microinjection, fluorescence screening, and transgenic line maintenance.
- Dependent on functional transposase mRNA and high-purity DNA preparation, including PB wash steps to prevent RNA contamination.
- Necessitates standardized crossing schemes with UAS-mRFP reporter lines to distinguish gene trap from enhancer trap events via co-expression scoring.
- Involves adaptation considerations for genes encoding secreted or membrane proteins, as N-terminal fusions may impair Gal4-VP16 nuclear localization and transcriptional activity.
- Subject to practical limitations in germline transmission efficiency, where optimizing F0 screening and outcrossing frequency impacts mutant recovery rates.
