Name: Gene Trapping Utilizzo Gal4 in Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Scopri la mutagenesi per inserzione con trappola genica in zebrafish utilizzando Gal4-VP16 come reporter principale. Questo metodo consente di generare mutanti per studi di funzione genica con screening scalabile.

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Ringraziamo il Dott. Jennifer Emtage per la lettura critica del manoscritto, Ryan Gill per l&#39;assistenza tecnica e aiutare con cura zebrafish e il Dr. Stephen C. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) per i reagenti. Il nostro lavoro è stato sostenuto da Temple University College di Scienza e Tecnologia e il National Institutes of Health (R01-HD061749).

1. La produzione del F0 Generation di microiniezione della Trappola Gene. Abbiamo scoperto che gli embrioni di diverse origini genetiche mostrano diverse tolleranze di questa procedura, con il tipo selvatico pet-store-based e Tuebingen - Long Fin (TLF) è la più tollerante mentre i ceppi AB e Tuebingen hanno più poveri la sopravvivenza. <ol><li> Preparazione del trasposone DNA. Preparare GBT-B1 (pDB783, Balciuniene et al. In preparazione) DNA plasmidico utilizzando il kit QIAprep miniprep standard (Qiagen 27106). È essenziale includere la fase di lavaggio PB (che è opzionale in procedura QIAprep), altrimenti il DNA miniprep sarà contaminato da RNasi A, che porta alla degradazione dell&#39;mRNA transposase. Prima dell&#39;iniezione, diluire il DNA in acqua RNase-free (Ambion AM9937) a 10 ng / ml. </li><li> Preparazione di transposase mRNA. Linearizzare pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 utilizzando XbaI e trascrivere il DNA linearizzato utilizzando una macchina T3 mMessage(Ambion AM1348) nel kit di trascrizione in vitro. Abbiamo modificato la reazione di trascrizione in vitro con l&#39;aggiunta di 0,5 ml di inibitore RiboLock RNasi (ThermoFisher Fermentas EO0381). Dopo la fase di trattamento DNasi, purificare mRNA utilizzando un kit RNeasy MinElute (Qiagen 74.204). Valutare la qualità del mRNA in vitro trascritto mediante elettroforesi su gel di agarosio. Diluire il mRNA in acqua RNase-free a 40 ng / ml, e negozio come due aliquote microlitri a -80 ° C. </li><li> Preparazione della miscela microiniezione. Prima dell&#39;iniezione, aggiungere 8 ml di diluito DNA trasposone ad una aliquota 2 microlitri di transposase mRNA. </li><li> Microiniezione. Iniettare 3 nl di miscela di DNA / RNA nel tuorlo di 1 embrioni di zebrafish cella utilizzando tecniche standard di microiniezione, puntando per l&#39;interfaccia tuorlo / blastomeri. Raccogliere gli embrioni ogni 20 min per assicurare l&#39;iniezione in 1 fase delle cellule. Nella nostra esperienza, una persona abile può facilmente iniettare 1.000 embrioni in 1-1.5 ore. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, eseguire 5 ml di sinistraoltre soluzione iniettabile su un gel di agarosio 1% per il controllo di qualità, per garantire che l&#39;mRNA transposase non è degradata. </li><li> Cura embrione iniettato. Nel tardo pomeriggio, rimuovere gli embrioni non fecondate e anormali e distribuire gli embrioni di 60-80 per 100 millimetri piatto di Petri. Embrioni anormali e morte vengono rimosse al 1 ° giorno dopo la fecondazione (dpf), 2 dpf e 3 dpf. </li><li> Screening per l&#39;espressione GFP. Embrioni schermo senza difetti evidenti per GFP fluorescenza a 3 dpf (Figura 3). Lo screening può essere effettuato sia in uno stereomicroscopio dotato di fluorescenza (Nikon usiamo un SMZ1500) o su un microscopio verticale (usiamo un Zeiss AxioImager con un obiettivo 5X Fluar). Bassa espressione GFP indica o iniezione riuscita o degrado della trasposasi RNA a causa della contaminazione RNasi (Figura 3A). Selezionare circa il 30% degli embrioni brillanti che hanno o espressione GFP in diversi tessuti o in una elevata percentuale di cellule di un tessuto specifico (confrontare Figures 3B e 3C). Da una iniezione di 1.000 embrioni, di solito abbiamo fino a 100 evolutivamente-normale, alta-GFP che esprimono embrioni. </li><li> Sollevare embrioni F0 selezionati con procedure zebrafish allevamento standard. E &#39;ragionevole aspettarsi che il 20-30% degli embrioni iniettati selezionati per l&#39;allevamento potrà sopravvivere fino all&#39;età adulta. </li></ol> 2. Manutenzione degli UAS: MRFP Tester Line. Abbiamo generato una 14xUAS: linea MRFP segnata da γCry specifico obiettivo: GFP. Poiché UAS è soggetto a tacere attraverso la metilazione del DNA, è importante selezionare il pesce con bassi livelli di tacere per propagare il brodo. <ol><li> Impostare UAS individuale: omozigoti MRFP per l&#39;accoppiamento con una delle nostre linee più affidabili trappola gene GAL4, tpl6 NSF (Balciuniene et al in preparazione.). </li><li> Il giorno successivo, trasferire i UAS: pesce MRFP che hanno dato gli embrioni a singoli serbatoi statici, mentre gli embrioni sono raccoltie puliti. </li><li> Embrioni schermo per GFP e RFP fluorescenza a 1 dpf e 3 dpf. </li><li> Pesce intercross che ha dato embrioni con elevata espressione MRFP per stabilire la prossima generazione di UAS: linea MRFP. </li></ol> 3. Proiezione del F0 Pesce. <ol><li> Croce F0 individuale con il UAS omozigote: MRFP pesce (Figura 4). Noi di solito iniettiamo nostri GBTS in linee con wild-type o leopardo pigmentazione modelli, e le nostre UAS omozigoti: linea MRFP è in ottone background. Pertanto pesce F0 GBT-iniettato può essere facilmente distinguibili dalle UAS: MRFP pesce, eliminando la necessità di registrare se il F0 essere proiettato era un maschio o una femmina così come potenziali errori derivanti da errori di registrazione e / o determinare il sesso ogni pesce. Il personale con esperienza molto limitata, tali noi studenti universitari, sono quindi in grado di impostare e abbattere accoppiamenti di pesce. Questo approccio ha lo svantaggio che due diversi background genetici sonoin uso, potenzialmente complicando interpretazione di perdita di fenotipi funzionali. </li><li> Il giorno successivo, restituire le UAS in ottone: MRFP pesce per loro serbatoio. Mettere il pesce F0 che ha dato embrioni in singoli serbatoi statici (usiamo Hagen Exo Terra Faunarium Piccolo, ma ogni piccolo serbatoio può essere utilizzata per questo scopo), mentre gli embrioni sono raccolti e proiettati. </li><li> Pulire e trasferimento embrioni raccolti in nuove piastre di Petri (&lt;100 a piatto), nel pomeriggio del giorno 0. </li><li> Embrioni schermo per GFP e RFP fluorescenza a 1 dpf, 2 dpf e 3 dpf. Tirare embrioni positivi sia per GFP e RFP fuori, ordinarli per GFP / RFP pattern di espressione (se più di un modello si osserva in una frizione) e sollevare loro di stabilire generazione F1. </li><li> Euthanize il pesce F0 che produceva soltanto embrioni negativi (su un numero totale di 50-100 embrioni). </li><li> Attraversare il pesce F0 che ha prodotto GFP / RFP progenie positivo di nuovo per ottenere un secondo lotto di positivi. </li></ol> 4.Proiezione del F1 Pesce. Il pesce F1 sono proiettati per stabilire famiglie F2, per documentare trappola genica pattern di espressione e di congelare partite di embrioni per l&#39;identificazione molecolare di trappola gene loci da 5 &#39;RACE e inversa PCR. <ol><li> Attraversare pesce F1 individuale con l&#39;UAS omozigote: MRFP pesce (Figura 4). </li><li> Il giorno seguente, posizionare il pesce F1 che ha dato embrioni in singoli serbatoi statici, mentre gli embrioni sono raccolti e proiettati. </li><li> Embrioni schermo per GFP e RFP fluorescenza a 1 dpf, 2 dpf e 3 dpf. Embrioni separati e fotografare positivi sia per la GFP e RFP 24. </li><li> A 5 dpf, congelare lotti di 20 GFP / RFP-positivi e 20 GFP / RFP embrioni-negativo per l&#39;identificazione di geni mutati da insertionally inversa PCR e 5 &#39;RACE 9,10. Sollevare rimanenti / embrioni RFP-GFP positive per stabilire generazione F2. </li></ol>

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</ol>

Questi autori hanno nulla da rivelare.

I vettori trappola gene e la metodologia qui descritte sono già in uso in diversi laboratori indipendenti. Nella nostra esperienza, ci sono due fasi critiche del processo. Il primo passo fondamentale è quello di raggiungere elevati tassi di integrazione trappola gene in embrioni iniettati F0. Errore in questa fase può spesso essere attribuita alla contaminazione RNasi dei reagenti di iniezione, soprattutto al DNA miniprep. È inoltre molto importante per iniettare embrioni allo stadio 1 cellula per esperimenti trap gene. Nella nostra esperienza, la transgenesi mediata Tol2 è molto efficiente, che permette di ottenere linee transgeniche anche quando l&#39;iniezione successiva alla fase 1 cella o con il DNA di qualità inferiore. Iniezioni incagliati sono molto più problematico quando svolgimento trappola gene mutagenesi, dal momento che solo una piccola frazione delle integrazioni vettoriali comporta efficaci intercettare gli eventi del gene. Il secondo passo fondamentale è quello di accertare intercettare gli eventi del gene attraversando il nostro UAS: linea MRFP. Assenza di espressione MRFP èquasi sempre indicativo di un evento trappola enhancer. Tuttavia, talvolta la mancanza di espressione MRFP può indicare silenziamento dei 14x UAS. E &#39;quindi importante mantenere le UAS: linea MRFP in uno stato non silenziato propagando la prossima generazione utilizzando gli individui con alta espressione RFP quando incrociate di tpl6 NSF. Siamo in grado di prevedere facendo diversi miglioramenti per i nostri vettori intrappolare gene e il protocollo. Il primo è quello di utilizzare un UAS meno ripetitivo nel costrutto trappola gene. E &#39;stato dimostrato che un 5x UAS è sufficiente per raggiungere piena attivazione in esperimenti di coltura cellulare, e che le sequenze UAS meno ripetitive sono meno suscettibili di metilazione e silenziamento 6,25. Può anche essere possibile progettare vettori trappola gene per mutagenesi pienamente subordinata, in analogia con i vettori utilizzati dal mouse trappola gene consorzio internazionale e recentemente adattate zebrafish 2,26,27. Un altro miglioramento potrebbe essere quella di utilizzare un diverso tSistema ransposon, per esempio Sleeping Beauty 28, per generare un UAS: linea giornalista MRFP. Ciò consentirebbe iniezione di trappole gene basati Tol2 direttamente nella linea giornalista e lo screening di F0s da incrossing. Inoltre, verrebbe meno l&#39;utilizzo di due differenti background genetico, rendendo l&#39;interpretazione della perdita di fenotipi funzione più semplice. Anche con questi miglioramenti, il Gal4 protocollo trappola gene generale presentata qui sarebbe ancora pienamente applicabile.

Mutagenesi inserzionale ha dimostrato di essere un approccio efficace per dissezione funzione genica in diversi sistemi modello da organismi unicellulari come batteri e lieviti per gli organismi multicellulari come topi e piante. Qualsiasi DNA esogeno (virus, trasposone o plasmide) può servire come mutageno interrompendo elementi essenziali di geni come esoni o promotori. L&#39;obiettivo efficace di tali approcci semplici è estremamente piccolo in grandi genomi complessi, poiché esoni comprendono solo 1-3% di un tipico genoma vertebrato. Piccole efficace dimensione di destinazione può essere superato da tassi di integrazione molto elevato vettoriali, come esemplificato dal grande successo di retrovirale mutagenesi inserzionale in zebrafish 11,12. Al contrario, introni costituiscono circa il 20-30% dei genomi di vertebrati. In zebrafish, a base di trasposoni, vettori di mutagenesi inserzionale che introducono efficacemente gravi mutazioni hypomorphic su integrazione-null o in introni sono stati chiamati &quot;transposo gene di rotturans &quot;(GBTS) 8-10. Per un&#39;efficace integrazione trappola gene, usano un minimo Tol2 trasposone 13,14. Mutagenicità delle GBTS si basa su pesce di derivazione splice accettore e trascrizionali sequenze di terminazione / poliadenilazione. Gli elementi responsabili GBT mutagenicità si affiancano da siti loxP diretti di escissione da Cre ricombinasi. Così, l&#39;iniezione di mRNA Cre porta alla reversione efficiente delle mutazioni GBT-indotte, anche se alcune sequenze trasposoni rimangono al locus integrazione 9,10. I vettori GBT pubblicati recentemente usano MRFP come la trappola gene reporter 9,10, portando a due potenziali carenze. In primo luogo, non si sa quale frazione di geni di zebrafish sono espressi ad un livello abbastanza alto da essere rilevato da proteine ​​giornalista di fusione fluorescenti diretti. In secondo luogo, solo un piccolo sottoinsieme di geni, dovrebbe avere funzioni essenziali. E &#39;stato stimato che ci sono solo 1,400-2,400 geni necessari per svilupp zebrafishnt 15,16. La maggior parte dei mutanti trappola gene non sono tenuti a visualizzare fenotipi evidenti e quindi avrà un&#39;utilità limitata. Per superare queste due limitazioni, abbiamo modificato GBT-R15 9,10 da utilizzare con Gal4-VP16 come giornalista trappola gene primario (Balciuniene et al. In preparazione). Come con AUG-meno MRFP in GBT-R15, il sito di inizio della traduzione è stato rimosso dalla Gal4-VP16. Per il rilevamento diretto di eventi trappola gene, i nostri vettori contengono un reporter eGFP sotto il controllo di 14x Gal4 UAS 17,18. Diverse caratteristiche aggiuntive sono state progettate nel nostro bipartito trappola gene vettore. Le scuole universitarie professionali: cassette eGFP è affiancato da un sito scalo FRT (chevrons grigio nella Figura 1). Iniezione di Flp ricombinasi mRNA porta ad escissione delle UAS: cassette eGFP, lasciando la mutazione del gene trappola smarcato da eGFP fluorescenza. Può quindi essere utilizzato in linee transgeniche che segnano specifici tessuti o eventi sviluppo di fluorescenza GFP. Come in altreGBTS, l&#39;intera cassetta trappola gene è fiancheggiata da siti loxP scalo (pentagoni aperti in Figura 1). Questo rende intercettare eventi gene reversibile mediante espressione di Cre ricombinasi, prontamente accertamento della prova di rapporto di causalità tra una determinata integrazione trappola gene e fenotipo osservato (Figura 2). Infine, la cassetta trappola gene è fiancheggiata da siti invertiti meganuclease I-SCEI (triangoli neri in Figura 1). In Drosophila, integrazioni trasposoni sono spesso convertiti in delezioni (carenze) per escissione impreciso dell&#39;elemento P. Non ci sono prove che l&#39;escissione del trasposone Tol2 (o qualsiasi altro trasposone attivo nei vertebrati come la Bella Addormentata, PiggyBac o Ac / Ds) può portare ad eliminazioni. Abbiamo quindi incluso siti I-SCEI come un potenziale metodo surrogato per l&#39;induzione di delezioni, anche se non vi è alcuna prova che I-SCEI può indurre delezioni in zebrafish. Va notato che, mentre I-SCEI meganucleasi può essere utilizzato per facilitare transgenesi in zebrafish, taglio del DNA da I-SCEI meganuclease è utilizzata per studiare i meccanismi di riparazione del DNA, tra cui soggetto a errori non omologhe fine giunzione, nel lievito e cellule di mammifero 19-22. Integrazione della nostra trappola gene vettore può portare ad espressione eGFP da due meccanismi differenti. Il primo è un vero e proprio evento trap gene (Figura 1C): il vettore integra in un gene (IMG per Insertionally gene mutato), una trascrizione fusione tra il 5 &#39;del trascritto IMG endogeno e la Gal4-VP16 è realizzato e tradotto in un proteina di fusione contenente l&#39;N-terminale della proteina codificata da IMG e GAL4-VP16. Questa proteina di fusione lega ai 14x UAS e attiva la trascrizione di eGFP. Il secondo evento, meno desiderabile è una trappola enhancer (Figura 1D): il promotore minimo davanti eGFP cade sotto il controllo di un enhancer vicino al sito di integrazione, che porta alla produzione di eGFP in abindicationi della produzione Gal4-VP16. Nella nostra stima, il 30-50% degli eventi di espressione eGFP sono dovuti ad una trappola enhancer e il 50-70% sono dovuti a una trappola gene 23 (Balciuniene et al. In preparazione). Per distinguere tra queste due classi di eventi, abbiamo fatto un 14xUAS: MRFP linea transgenica (Figura 1B), per comodità segnata da specifici lente γCry: (. Balciuniene et al, in preparazione) GFP. Intercettare eventi Gene vengono verificati da co-espressione di GFP e RFP (confrontare C e D in figura 2). Nel nostro schermo pilota, abbiamo recuperato più di 40 eventi intercettare gene dopo lo screening di 270 F0 pesce iniettato con una miscela di DNA trasposone e transposase mRNA. Due dei nostri integrazioni trappola gene si sono verificati nei geni precedentemente pubblicati con mutanti indotti chimicamente: NSF e FLR. I fenotipi della nostra mutanti inserzionali tpl6 NSF e flr tpl24 sono superficialmente indistinguibili dal fenotipos dei corrispondenti mutanti indotti chimicamente. Abbiamo anche notato che gli eventi trap gene appaiono polarizzate verso gli introni vicino all&#39;estremità 5 &#39;dei geni, aumentando così la probabilità di alleli nulli. Facciamo osservare un certo grado di UAS silenziamento (variegatura) in tutte le nostre linee di trappola genica, e alcuni loci sono nettamente più sensibili alla variegatura di altri. Noi non crediamo che UAS silenziamento è un problema significativo per la propagazione delle linee trappola gene, come siamo stati in grado di propagare con facilità tutte le nostre linee di trappola genica attraverso almeno cinque generazioni selezionando per l&#39;espressione GFP da sola.

<table><tbody><tr><td>Kit Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>La fase di lavaggio PB opzionale è un must</td></tr><tr><td>Enzima di restrizione XbaI</td><td>ThermoFisher</td><td>ER0681</td><td></td></tr><tr><td>mMessage Machine T3</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNasi Inibitore</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Può essere sostituito dall'estrazione del fenolo e precipitazione. Non usare LiCl!</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Deve essere trattato senza DEPC</td></tr><tr><td>Capilari in vetro borosilicato per aghi per microiniezione World</td><td>Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcapiari per la calibrazione</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Punte per microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per aghi *</td><td>Sutter Strumenti</td><td>Stereomicroscopio P-87</td><td></td></tr><tr><td>per microiniezione * </td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>Utilizziamo anche Wild 5M e Olympus SZ61 con supporto a luce trasmessa</td></tr><tr><td>Picoinjector *</td><td>Harvard Instruments</td><td>Pli-90</td><td>Utilizziamo anche Pli-100</td></tr><tr><td>Microscopio di screening con fluorescenza GFP/RFP *</td><td>L'obiettivo Zeiss</td><td>Zeiss AxioImager</td><td>5X Fluar ha una distanza</td></tr> <tr><td>di lavoro sufficienteMicroscopio di screening con fluorescenza GFP/RFP *</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* Consigliamo questa apparecchiatura solo perché la utilizziamo con successo nel nostro laboratorio. In ogni categoria sono disponibili diverse opzioni comparabili di più produttori.</td></tr></tbody></table>

gene trapping utilizzo gal4 in zebrafish

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Grandi dimensioni frizione e sviluppo esterno di embrioni otticamente trasparenti rendono zebrafish un eccezionale sistema modello vertebrato per la mutagenesi inserzionale in vivo con i giornalisti fluorescenti per contrassegnare espressione dei geni mutati. Diversi laboratori hanno costruito e collaudato vettori-enhancer e gene-trap in zebrafish, utilizzando proteine ​​fluorescenti, attivatori trascrizionali basati lexA Gal4 e come reporter 1-7. Questi vettori avevano due possibili inconvenienti: rigore non ottimale (ad esempio, mancanza di capacità di distinguere tra gli eventi-enhancer e gene-trap) e bassa di mutagenicità (es. integrazioni in geni raramente prodotte alleli nulli). Gene Ultime Transposon (GBTS) sono stati sviluppati per affrontare questi inconvenienti 8-10. Abbiamo modificato uno dei primi vettori GBT, GBT-R15, per l&#39;utilizzo con Gal4-VP16 come giornalista primario trappola genica e UAS aggiunto: eGFP come giornalista secondario per il rilevamento diretto di manifestazioni trappola gene. Lapplicazione di Gal4-VP16 come primario giornalista trappola genica offre due vantaggi principali. In primo luogo, essa aumenta la sensibilità per geni espressi a bassi livelli di espressione. In secondo luogo, consente ai ricercatori di utilizzare le linee trappola del gene come autisti GAL4 alla diretta espressione di altri transgeni nei tessuti molto particolari. Ciò è particolarmente pertinente per i geni con funzioni non essenziali o ridondanti, in cui l&#39;integrazione trappola gene non può portare a fenotipi evidenti. Lo svantaggio dell&#39;utilizzo GAL4-VP16 come primario giornalista trappola gene è che i geni che codificano per proteine ​​con sequenze segnale N-terminale non sono suscettibili di cattura, come le proteine ​​di fusione risultanti GAL4-VP16 è improbabile che siano in grado di entrare nel nucleo e attivano trascrizione. È importante sottolineare che l&#39;uso di GAL4-VP16 non preselezionare per proteine ​​nucleari: abbiamo recuperato mutazioni geniche intrappolare nei geni che codificano proteine ​​che funzionano nel nucleo, citoplasma e membrana plasmatica.

In una iniezione di successo, almeno il 80% degli embrioni iniettati con la trappola gene DNA / Tol2 transposase mix mRNA visualizzare un certo livello di fluorescenza GFP (Figura 3). Quando i brillanti embrioni GFP-positive (Figura 3C) sono selezionati per stabilire la piscina F0, circa uno su 10 proiettato pesce F0 sarà resa gene trap progenie. Tra il pesce F0 da cui gli eventi trappola genica sono recuperati, più trasmettere un singolo evento trappola gene oltre a diverse integrazioni trasposoni non esprimono. Tuttavia, abbiamo stabilito fino a quattro linee trappola gene da un singolo individuo F0. GFP / RFP pattern di espressione in linee trappola gene vanno da estremamente specifico tessuto (per esempio in bulbi olfattivi) ad alquanto onnipresente. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> Figura 1. Tegli GAL4 contenenti trappola gene bipartito vettore GBT-B1 e le sue applicazioni. A. I componenti del Gal4 contenente trappola gene vettore: Tol2 5 &#39;e Tol2 3&#39;, minimal Tol2 trasposone finisce 13, CSA, Carp β-actina splice accettore 8; ^ Gal4-VP16, agosto-meno Gal4-VP16; ZP ( A), zebrafish β-actina UTR e poli 3 &#39;(A) gli elementi da GBT-R15 9,10. 14XUAS, eGFP e SV40 p (A) sono componenti di UAS: eGFP cassetta di espressione 17,18. La freccia indica l&#39;attivazione di UAS: eGFP da Gal4-VP16 prodotta dalla trappola gene B. Il 14XUAS:. MRFP transgene segnato da un γCry specifico obiettivo: cassette GFP. La freccia indica l&#39;attivazione di UAS: MRFP da Gal4-VP16 in trans caso trappola C. Gene.. Scatole blu sono esoni. Splicing è indicato dalla linea tratteggiata. Evento trap D. Enhancer. L&#39;integrazione del vettore in prossimità di un potenziatore (scatola marrone) può mettere il minimo promotore eGFP sotto il controllo di questo enhancer (freccia marrone). Ciò si tradurrebbe in una espressione tessuto-specifica di eGFP, ma dal momento che Gal4-VP16 non è fatto, espressione MRFP non verrebbe attivata. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> Figura 2. Inversione di eventi trappola genica utilizzando Cre ricombinasi. A, B. Schema di una trappola gene mutazione (A) e Cre-ritornato trappola gene allele (B). C, D. Co-espressione di GFP (C) e RFP (D) nel sistema nervoso del gene tpl6 nsf linea trappola. E, F. Iniezione di Cre RNA in embrioni NSF tpl6 porta alla perdita di GFP (E) e RFP (F) espressione. Si noti che non vi è alcuna riduzione di espressione GFP nella lente, come previsto. Figura 3. Embrioni iniettati con la trappola gene GBT-B1 (pDB783). . A. embrioni iniettati con pGBT-B1 (pDB783) visualizzazione solo poco fluorescenza GFP nel corpo B, C. embrioni iniettati con pGBT-B1 e Tol2 transposase mRNA: un gruppo casuale di embrioni (B) e high-expressors selezionati per l&#39;allevamento (C). <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> Figura 4. Schema sperimentale per la creazione di GAL4 linee trappola gene. Strutture rosso / verde in parte coincidenti indicano co-espressione di GFP e RFP, mentre il verde indica solo mosaicismo per intrappolare gene o trappola enhancer eventi.

Questo protocollo descrive il metodo di trappola gene inserzionale mutagenesi utilizzando Gal4-VP16 come giornalista primario e GFP / RFP come reporter secondarie in zebrafish. Circa uno su dieci-alta esprimendo F0 gene rendimento pesce trappola progenie co-esprimono GFP e RFP. La procedura di screening può essere facilmente scalata per adattarsi alle dimensioni del laboratorio che esegue lo schermo mutagenesi inserzionale.

Gene Trapping Utilizzo Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre pesci mutanti utilizzando un trasposone interruttore di geni su vettori contenenti GAL quattro, VP 16 come reporter principale per il gene trap. Questo viene realizzato iniettando inizialmente il vettore per il gene trap insieme al trasposasi Tal due negli embrioni di zebrafish. Gli embrioni iniettati vengono selezionati in base alla fluorescenza di GFP a tre giorni dalla fecondazione e circa il 30% degli embrioni più luminosi viene selezionato per costituire il pool F zero.Successivamente, i pesci F zero vengono incrociati con la linea tester U-A-S-M-R-F-P per selezionare la trasmissione germinale degli eventi di gene trap. Il passaggio finale consiste nell'incrocio esterno degli F1 per stabilire la generazione F due e generare embrioni per la caratterizzazione molecolare degli eventi di gene trap mediante PCR inversa e 5 prime race. In definitiva, circa uno su 10 pesci F zero esaminati dovrebbe produrre prole con gene trap.I trasposoni interrompitori di geni sono stati progettati per non produrre mutazioni durante l'integrazione nelle regioni iniziali dei geni codificanti per proteine. I nostri vettori GBT utilizzano G four P 16 come reporter principale per il gene trap. Questa modifica aumenta la sensibilità per geni espressi a bassi livelli e ci permette di utilizzare mutanti con gene trap senza fenotipi eccessivi, impiegando G four come attivatori per l'espressione tessuto-specifica di altri transgeni.Riteniamo che il collo di bottiglia principale del nostro metodo consista nel raggiungere tassi sufficientemente elevati di integrazione del gene trapp nel germinale dei pesci F zero. In questa dimostrazione, affronteremo diverse fasi critiche: preparazione del DNA, MICROINIEZIONE e screening dei F zero. Il vettore gene trapp GBTB uno utilizza GAL quattro VP 16 come reporter principale del gene trapp.Vengono utilizzati vettori minimali di tipo tall due con estremità transposte per l'integrazione del gene trap. Gli eventi di gene trap sono rilevati direttamente mediante un reporter EGFP sotto il controllo di 14 X GAL quattro UAS. L'intero cassetta del gene trap è delimitata da siti P diretti.Ciò rende gli eventi di gene trap reversibili mediante l'espressione di Cree combs, consentendo di dimostrare una relazione di causalità tra un particolare inserimento del gene trap e un fenotipo osservato. Inoltre, il cassette U-A-S-E-G-F-P è delimitato da siti FRT diretti. L'iniezione di mRNA di flip combs porterà all'escissione del cassette U-A-S-E-G-F-P, lasciando la mutazione del gene trap non marcata dalla fluorescenza di EGFP e permettendone l'utilizzo in linee transgeniche che marcano specifici tessuti o eventi dello sviluppo mediante fluorescenza di GFP prima della microiniezione.Preparare il DNA della transposasi e l'mRNA della transposasi. Preparare il DNA del vettore di trappola genica GBTB. Utilizzare un kit mini prep standard e seguire il protocollo del produttore, includendo obbligatoriamente il passaggio di lavaggio PB durante la preparazione del DNA.Altrimenti, il DNA della mini prep sarà contaminato da RNA, con conseguente degradazione dell'mRNA dei trasposoni. Diluire il DNA in acqua priva di RNA a una concentrazione di 10 nanogrammi per microlitro. Per preparare l'mRNA dei due trasposoni, inizialmente linearizzare il plasmide PT3TS2 utilizzando l'enzima XboI. Successivamente, trascrivere il DNA linearizzato usando un kit di trascrizione in vitro MEGAscript T3, con una modifica.Aggiungere 0,5 microlitri di inibitore rib lock RNAs dopo il passaggio di purificazione del DNA, purificare l'mRNA utilizzando un kit standard e valutare la qualità dell'mRNA trascritto in vitro mediante elettroforesi su gel agarosio. Diluire l'mRNA in acqua priva di RNAses fino a una concentrazione di 40 nanogrammi per microlitro e conservarlo in aliquote da due microlitri a meno 80 gradi Celsius, immediatamente prima della microiniezione. Preparare la miscela di iniezione aggiungendo otto microlitri di DNA transposon diluito a un'aliquote da due microlitri di mRNA transposon.Iniettare tre nanolitri di una miscela di D-N-A-R-N-A nel tuorlo di embrioni di pesce zebra a una cellula utilizzando tecniche standard di microiniezione, mirando all'interfaccia tra tuorlo e blasmera. Dopo l'iniezione, eseguire un'analisi su gel di agarosio all'1% con cinque microlitri della soluzione iniettabile rimasta, come controllo di qualità, per verificare che l'mRNA trascritto non sia degradato. Circa sei-otto ore dopo l'iniezione, rimuovere gli embrioni non fecondati e quelli morti, quindi distribuire gli embrioni in piastre di Petri da 100 millimetri, da 60 a 80 per piastra. Rimuovere gli embrioni anomali e quelli morti a un giorno, due giorni e tre giorni dopo la fecondazione, effettuando l'osservazione a tre giorni dopo la fecondazione al microscopio stereoscopico dotato di fluorescenza o al microscopio verticale.Esaminare gli embrioni ed eliminare quelli anomali. Esaminare gli embrioni rimanenti senza difetti evidenti. Per la fluorescenza GFP, selezionare gli embrioni F zero più luminosi ed elevarli utilizzando le procedure standard di allevamento di zebrafish in questo laboratorio.I GBT vengono solitamente iniettati in linee con pattern di pigmentazione di tipo selvatico o leopardata. È ragionevole aspettarsi che dal 20 al 30% degli embrioni iniettati selezionati per l'allevamento sopravvivrà fino all'età adulta. L'integrazione del vettore di gene trap GBTB può portare all'espressione di EGFP attraverso due meccanismi diversi.Il primo è un evento reale di gene trap. Il vettore si integra in un gene, generando un trascritto di fusione tra la regione 5' del trascritto genico endogeno e il GAL4-VP16, che viene tradotto in una proteina di fusione contenente l'estremità N-terminale della proteina fusa al gene mutato inserito e al GAL4-VP16. Questa proteina di fusione si lega alle sequenze 14 XUAS e attiva la trascrizione di EGFP.Il secondo evento, meno desiderabile, è un enhancer trap. Il promotore minimo posto davanti all'EGFP viene posto sotto il controllo di un enhancer vicino al sito di integrazione, portando alla produzione di EGFP in assenza di GAL four, VP 16. Per distinguere tra queste due classi di eventi, è stata generata una linea transgenica 14 X-U-A-S-M-R-F-P marcata con GFP specifico del cristallino gamma a livello del cristallino.Gli eventi di gene trap vengono verificati incrociando i pesci iniettati con GBT con pesci U-A-S-M-R-F-P omozigoti e selezionando quelli con co-espressione di GFP e RFP, condizione possibile soltanto se GAL quattro e VP 16 sono prodotti e attivano U-A-S-M-R-F-P in trans, avviando così la procedura di selezione dei pesci F zero. Incrociare ogni singolo pesce F zero con pesci U-A-S-M-R-F-P omozigoti. Poiché i pesci iniettati con GBT presentano un modello di pigmentazione selvatico o leopardato, mentre la linea U-A-S-M-R-F-P omozigote ha un fenotipo brass, i pesci F zero possono essere facilmente distinti dai pesci U-A-S-M-R-F-P, eliminando la necessità di registrare se il pesce F zero sottoposto a screening fosse maschio o femmina, nonché potenziali errori derivanti da errori nella registrazione o nella determinazione del sesso di ciascun pesce. Il giorno successivo.Riportare il pesce U-A-S-M-R-F-P in ottone nel loro serbatoio. Collocare i pesci F0 che hanno prodotto embrioni in serbatoi statici individuali mentre gli embrioni vengono raccolti per l'analisi preliminare, quindi trasferire gli embrioni raccolti in nuove capsule di Petri nel pomeriggio del giorno zero. Analizzare gli embrioni per la fluorescenza GFP e RFP a un giorno e a tre giorni dopo la fecondazione.Estrararre gli embrioni positivi sia per GFP che per RFP e ordinarli in base al modello di espressione G-F-P-R-F-P. Se in una covata viene osservato più di un modello, allevare gli embrioni per stabilire la generazione F1. Si noti che gli embrioni 3D PF positivi per GFP ma non per RFP non vengono estratti, poiché rappresentano eventi di intrappolamento dell'enhancer.Incrociare nuovamente i pesci F0 che hanno prodotto prole positiva per G-F-P-R-F-P per ottenere un secondo lotto di individui positivi. I pesci F1 vengono sottoposti a screening per stabilire famiglie F2 al fine di documentare il pattern di espressione del gene trapp e per congelare lotti di embrioni per l'identificazione molecolare dei loci del gene trapp. Incrociare innanzitutto singoli pesci F1 con pesci U-A-S-M-R-F-P omozigoti il giorno successivo. Collocare i pesci F1 che hanno prodotto embrioni in singoli acquari statici mentre gli embrioni vengono raccolti per lo screening a un giorno dalla fecondazione.La marcatura con RFP potrebbe non essere ancora visibile, quindi esaminare gli embrioni per la fluorescenza di GFP ed estrarre gli embrioni positivi per GFP a tre giorni dalla fecondazione; successivamente, esaminare sia la fluorescenza di GFP che di RFP ed estrarre gli embrioni doppiamente positivi. Quindi, fotografare gli embrioni positivi per entrambi GFP e RFP a cinque giorni dalla fecondazione; congelare campioni di 20 embrioni positivi per G-F-P-R-F-P e 20 embrioni negativi per G-F-P-R-F-P per l'identificazione dei geni inseriti mutati mediante PCR inversa e 5 prime race. Allevare i restanti embrioni positivi per G-F-P-R-F-P per stabilire la generazione F2 in un'iniezione di successo.Almeno l'80% degli embrioni iniettati con la miscela di DNA del gene trap e dell'mRNA dei trasposasi mostrerà un certo grado di fluorescenza GFP. Una bassa espressione di GFP indica o un'iniezione non riuscita o la degradazione dell'RNA delle trasposasi dovuta a contaminazione da RNAsi. Quando vengono selezionati gli embrioni positivi per GFP più luminosi per costituire il pool F0, circa uno su 10 dei pesci F0 analizzati produrrà prole con inserzioni del gene trap tra i pesci F0 da cui vengono recuperati gli eventi del gene trap.La maggior parte trasmette un singolo evento di intrappolamento genico, oltre a diverse integrazioni di trasposoni non espressi. Poiché l'intero cassette di intrappolamento genico è delimitato da siti P diretti, ogni mutazione da intrappolamento genico illustrata in questo diagramma, con i riquadri blu che rappresentano gli esoni del gene mutato, può essere invertita mediante l'espressione di CRE ricombinasi. Queste immagini mostrano la co-espressione di GFP e RFP nel sistema nervoso della linea genetica con intrappolamento genico NSF TP sei; l'iniezione di RNA di CRE nei embrioni NSF TP sei determina la perdita dell'espressione di GFP e RFP.Si noti che non vi è alcuna riduzione dell'espressione di GFP nel cristallino, come previsto. La maggior parte delle procedure descritte qui è applicabile anche ad altri esperimenti di gene trap, così come a esperimenti di trasgenesi classici con TOL due e altri trasposoni. Con la procedura di gene trap qui descritta, impostando da 20 a 30 incroci F zero ogni settimana, si dovrebbe ottenere il recupero di un gene trap a settimana.Tuttavia, la procedura può essere facilmente ampliata.

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