Name: Misure rigidezza flessionale di biopolimeri usando saggi Gliding (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Impara a misurare la rigidità flessionale dei microtubuli usando saggi di scivolamento guidati da kinesina. Questo metodo consente di determinare la lunghezza di persistenza di singoli biopolimeri citoscheletrici.

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Ringraziamo Melissa Klocke per l&#39;assistenza preparare la figura 1 e Anna Ratliff per dimostrare il protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto dal Research Corporation per il Progresso della Scienza.

1. Microtubuli Gliding scorta di saggio Solutions Preparare in anticipo dosaggio volo a vela. <ol><li> Polimerizzare microtubuli 0,5 mg scarsamente etichettati con brillante organico fluoroforo 22. La concentrazione etichetta di destinazione è 1 fluoroforo per micrometro di microtubuli, etichettatura o una densità di circa 1 fluoroforo per 1.500 dimeri di tubulina. Conservare a temperatura ambiente, la luce protetta con alluminio, pellicola per un massimo di due settimane. </li><li> Purificare biotina-chinesina 21 a circa 1 pM. Conservare a -80 ° C in aliquote di 5 microlitri per uso in esperimenti singoli. </li><li> Preparare il tampone di saggio (AB) di 50 imidiazole mM, 50 mM di cloruro di potassio (KCl), 4 mM di cloruro di magnesio (MgCl 2), 2 mM di etilene glicole tetraacetico (EGTA), pH 6,7. Filtro sterile e conservare a 4 ° C. </li><li> Sciogliere biotinilato albumina di siero bovino (biotina-BSA) a 2 mg / ml in AB. Filtro con 0,2 micron filtro siringa.Conservare a -80 ° C in aliquote di 100 microlitri per lunghi periodi, a 4 ° C per un mese. </li><li> Sciogliere streptavidina (SA) a 10 mg / ml in AB. Filtro con 0,2 micron filtro siringa. Conservare a -80 ° C in 20 aliquote pl per lunghi periodi, a 4 ° C per un massimo di due settimane. </li><li> Sciogliere α-caseina a 5 mg / ml in AB. Filtro con 0,2 micron filtro siringa. Conservare a -80 ° C in aliquote di 100 pl per lunghi periodi, a 4 ° C per un massimo di due settimane. </li><li> Sciogliere ditiotreitolo (DTT) in acqua deionizzata a 200 mM. Conservare a -20 ° C in aliquote di 100 pl, da usare entro 8 ore di scongelamento. Può essere ricongelato. </li><li> Sciogliere paclitaxel (PT) in grado HPLC dimetilsolfossido (DMSO) a 4 mM. Conservare in aliquote da 10 pl a -80 ° C lungo termine, -20 ° C a breve termine. Utilizzare entro 8 ore dallo scongelamento. Può essere ricongelato. </li><li> Sciogliere il glucosio in acqua deionizzata a 120 mg / ml. Conservare in aliquote di 100 pl a -20 ° C. Può essere ricongelato. </li><li> Disrisolvere adenosina trifosfato (ATP) in acqua deionizzata a 150 mM, pH 7,0. Conservare in aliquote di 5 pl a -80 ° C, da usare entro 8 ore di scongelamento. </li><li> Preparare 100x magazzino l&#39;assorbimento di ossigeno 25, sciogliendo 10.000 unità di glucosio ossidasi e catalasi 156.000 unità in 600 microlitri di buffer totale del saggio. Centrifugare brevemente in una microcentrifuga per far sedimentare i solidi; sopranatante filtro con filtro 0,2 micron siringa. Conservare a -80 ° C in aliquote da 10 pl per lunghi periodi, a 4 ° C per una settimana. </li></ol> 2. Microtubuli Gliding Assay, in giornata Soluzione Preparazione Preparare le soluzioni in 2,1-2,6 il giorno dell&#39;esperimento. Con la pratica, le soluzioni 2,2-2,6 può essere preparato durante la cella a flusso di lavaggio. Se non diversamente specificato, mantenere le soluzioni di archivi su ghiaccio. <ol><li> Preparare AB, 1 ml di tampone con 10 ml di DTT magazzino (AB con 2 mM DTT). Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare bio-BSA, 40 e mu, L di una miscela 1:1 di biotina-BSA magazzino e AB. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare tampone BSA, mescolando 645 ml di AB 5,5 microlitri con BSA (1 mg / ml di BSA in AB). Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare tampone SA, mescolando 57 ml di AB con 3 stock microlitri streptavidina (0,5 mg / ml di streptavidina in AB). Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare α-caseina buffer, mescolando 200 ml di BSA, 50 microlitri archivio di caseina, e 0,8 pl di ATP 15 mM (1 mg / ml α-caseina, 0,8 mg / ml BSA, 50 nM ATP in AB). Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare fluorescenza anti-candeggina tampone, mescolando 95 microlitri α-caseina tampone, 2,5 microlitri archivio di glucosio, 1 mix microlitri ossigeno 100x scavenging, 1 stock paclitaxel pl, 1 ml 2-mercaptoetanolo (βME). Aggiungi βME sotto cappa d&#39;aspirazione. Utilizzare fluorescenza anti-candeggina buffer entro 1 ora di preparazione. ATTENZIONE: βME è altamente tossico e odori terribili. Assicurarsi di aprire solo sotto la cappa aspirante. Conservare nella bottigliaassenza di luce, la luce degrada βME e la sua capacità di ridurre photobleaching. </li></ol> 3. Microtubuli Gliding Assay <ol><li> Costruire circa quattro corsie di flusso tra un x 24 60 coprioggetto mm e 22 x 22 mm con l&#39;utilizzo coprioggetto grasso per vuoto, estrusi da una siringa attraverso un puntale, come un distanziatore. Ogni corsia flusso deve essere di circa 10 microlitri di volume (scala volumi successivi di conseguenza). </li><li> Lavare 10 pl di bio-BSA buffer in ogni corsia. Incubare 5 min per permettere BSA per rivestire le superfici di vetro. </li><li> Lavare ogni corsia tre volte con 15 microlitri tampone BSA per rimuovere libera biotina-BSA, pur continuando a bloccare la superficie di scorrimento. Utilizzare un Kimwipe o carta da filtro per rimuovere il tampone dal lato opposto della camera di flusso, assicurandosi di non lasciare bolle d&#39;aria di passare attraverso la camera di flusso. </li><li> Lavare 15 microlitri SA-buffer in ogni corsia. Attendere 10 minuti, o fino a 2 ore. La streptavidina si legano alla superficie è legato biotina-BSA. </li><li> Lavare ogni corsia per tre volte con 15 microlitri di buffer BSA per rimuovere libero SA, pur continuando a bloccare la superficie del vetrino. </li><li> Lavare ogni corsia con 15 microlitri α-caseina buffer. α-caseina aiuta ulteriormente bloccare il legame non specifico di chinesina e microtubuli al vetro. </li><li> Diluire chinesina a 10 nM in α-caseina tampone e lavare ogni corsia con 15 pl di questo chinesina - α-caseina soluzione. Attendere 15 minuti (o fino ad un&#39;ora) per la cinesina biotinilato di legarsi specificamente alla superficie è legato il streptavidina. I domini motore chinesina resteranno liberi di microtubuli si legano. </li><li> Diluire paclitaxel a 40 pM a temperatura ambiente α-caseina tampone, e lavare ogni corsia con 15 pl di questa soluzione per lavare chinesina libero e per pre-caricare ogni camera di flusso con una soluzione di paclitaxel per impedire microtubuli dai depolimerizzante. Freddo depolimerizza anche microtubuli, in modo da assicurarsi che questi passaggi avvengono a temperatura ambiente con temperature ambienteri soluzioni. </li><li> Diluire il marcato in modo fluorescente microtubuli 1:100-1:1,000 della fluorescenza anti-candeggina buffer con 1 mM ATP. Lavare 15 microlitri in una corsia ed osservare entro 30 min. </li></ol> 4. Raccolta dei dati <ol><li> Osservare il volo a vela microtubuli mediante microscopia a fluorescenza, un microscopio in grado di risolvere fluorofori singoli come un setup commerciale o casa-build TIRF è richiesto 26 (Figura 2). I microtubuli devono essere azionati da motori chinesina sul substrato a circa 0,5 micron / s, a seconda della temperatura. Se il campo di vista del microscopio è 50 pm, microtubuli singoli dovrebbero essere visibili per circa 100 sec. Impostare l&#39;intensità di illuminazione in modo che singoli fluorofori non fotosbiancante più velocemente di 100 sec. Se si utilizza eccitazione laser, un livello di potenza di circa 3-5 mW è appropriato. </li><li> Raccogliere sequenze di immagini per l&#39;analisi. 600 immagini a5 Hz (2 totale min) funziona bene. Utilizzare sequenze abbastanza a lungo microtubuli che attraversano l&#39;intero campo di vista. </li></ol> 5. Analisi dei dati Una routine IDL, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.pro</a> , è allegato. Questa routine restituisce un valore di lunghezza di persistenza sulla base di tutte planata microtubuli in una sequenza data immagine. O eseguire questa routine su ogni sequenza di immagini, modificare i parametri di intensità a seconda della configurazione del microscopio particolare, o di effettuare le seguenti operazioni: <ol><li> Traccia ogni fluoroforo collegato a un microtubulo per creare traiettorie fluorofori. </li><li> Combinare tutte le traiettorie di fluorofori su un microtubulo data in una traiettoria complessiva microtubuli; ripetere per ogni microtubule nella sequenza di immagini (Figura 3). </li><li> Calcolare l&#39;angolo tangente ad ogni punto lungo la traiettoria (Figura 4), E calcolare &lt;cos θ s&gt; nell&#39;eq. 1 mediando il coseno della differenza di angolo per ogni coppia di punti separati da un percorso di lunghezza s (Figura 5). Trovare la lunghezza di persistenza di un microtubulo o un gruppo di microtubuli &lt;cos montaggio θ s&gt; a Eq. 1, ponderazione singoli punti dati nella forma per il numero di valori indipendenti di cos θ s che sono utilizzati per calcolare la media. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Misure di lunghezza persistenza sono una buona caratterizzazione delle proprietà meccaniche dei biopolimeri singoli. In questo articolo, abbiamo descritto un metodo per misurare la lunghezza di persistenza dei microtubuli. Come detto nell&#39;introduzione, questo metodo è facilmente esteso ad esaminare le proprietà meccaniche microtubuli in una varietà di condizioni semplicemente variando i reagenti, temperatura o viscosità nella fase finale del saggio planata, 3,9, o da microtubuli polimerizzanti, passo 1,1, in condizi...

Il citoscheletro, una rete di biopolimeri presenti nella maggior parte delle cellule eucariotiche, svolge un ruolo nella organizzazione cellulare, trasporto intracellulare, e meccanica delle cellule. Le caratteristiche meccaniche dei biopolimeri del citoscheletro (principalmente actina e microtubuli) svolgono un ruolo significativo nel determinare le caratteristiche meccaniche della cellula nel suo complesso 12. Poiché meccanica cellule intere possono caratterizzare cellule sane e malate 13,14 ed è coinvolto nella motilità cellulare 15, le proprietà meccaniche dei componenti citoscheletrici sottostanti sono un&#39;area attiva di studio per gli ultimi due decenni 1. La flessibilità (o rigidità) di biopolimeri è caratterizzato dalla lunghezza di persistenza, la lunghezza del polimero che si piega per circa un radianti sotto fluttuazioni termiche a temperatura ambiente. Un certo numero di tecniche sono state sviluppate per misurare la lunghezza di persistenza 16, per exampLe tecniche attive che coinvolgono piegare il polimero attraverso il flusso idrodinamico, trappole ottiche, o campi elettrici 4,17,18, e tecniche passive che misurano le fluttuazioni di polimeri libere in soluzione 5,6. Le misurazioni attivi, tuttavia, richiedono configurazioni specializzate per implementare forze note sulla scala del micrometro, e le misurazioni di fluttuazione libera può essere difficile a causa della diffusione di piano focale del microscopio utilizzato. In questo articolo, si descrive un complementare, passiva, tecnica per misurare la lunghezza di persistenza dei microtubuli, un polimero del citoscheletro. La tecnica prevede saggi volo a vela, che assicurano che il polimero rimane sempre nel piano focale 19. Inoltre, esso comporta il rilevamento fluorofori singoli collegati in modo permanente al polimero di interesse, in modo che punti specifici lungo il polimero sono ben caratterizzati. Un cartone animato del metodo è illustrato nella Figure 1. Kinesina si muove in particolare verso la fine + di microtubuli, in modo che i microtubuli in un test di volo a vela sono spinti unidirezionale. L&#39;estremità anteriore del microtubulo, oltre l&#39;ultima chinesina collegato, è libero di fluttuare sotto le forze termici della soluzione circostante. Come il microtubulo viene spinto in avanti, fino alla fine oscilla legarsi a una molecola chinesina nuovo più avanti lungo il vetrino si congela in una fluttuazione dato. Poiché chinesina attribuisce microtubuli fortemente, la microtubuli è costretto a seguire il percorso della estremità anteriore. Pertanto, le fluttuazioni statistiche congelati nella traiettoria microtubuli sono le stesse delle fluttuazioni statistiche della estremità libera 11 microtubuli, e può quindi essere utilizzata per calcolare la lunghezza di persistenza secondo 20 <img alt="Equazione 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" src = &quot;/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg&quot; /&gt; dove L è la lunghezza p persistenza del microtubulo, s θ è l&#39;angolo tra tangenti alla traiettoria separate da una lunghezza s contorno, e &lt;&gt; indica una media di tutte le coppie di posizioni separate da una lunghezza s contorno. Il saggio di scorrimento si utilizza chinesina biotinilato al coiled-coil 21 legato specificamente al vetrino tramite una streptavidina-biotina linkage. Questo accessorio assicura che i domini motore sono liberi di legarsi ai microtubuli e spingere. Al fine di seguire traiettorie microtubuli, microtubuli sono scarsamente etichettati con fluorofori organici 22,23 - le etichette devono essere sparso abbastanza fluorofori singoli sono risolvibili utilizzando singola molecola microscopia a fluorescenza. Fluorofori singole sono monitorati tramite routine di analisi di immagini scritte in IDL. Le traiettorie di ciascun fluoroforo legato ad un determinato microfonorotubule sono combinati in una traiettoria microtubulo automaticamente composito 24. Gli angoli θ tangente ad ogni punto lungo una traiettoria vengono calcolati; da questi angoli tangenti l&#39;&lt;cosθ s&gt; valore viene calcolato per ogni s lunghezza dei contorni. Infine, questi dati sono idonei a Eq. 1 in modo da estrarre una lunghezza di persistenza per un determinato microtubulo, o per molti microtubuli nello stesso dosaggio scorrimento. Il metodo è abbastanza robusta per lavorare con microtubuli preparati in una varietà di condizioni (con differenti agenti stabilizzanti o altre piccole molecole legate al microtubulo, con proteine ​​legate associati microtubuli (MAP), o con una varietà di soluzioni viscose). Nel nostro laboratorio, la tecnica è stata utilizzata per caratterizzare la lunghezza di persistenza dei microtubuli in funzione della lunghezza lungo i microtubuli ei microtubuli con diversi agenti stabilizzanti. La limitazione principale è che i microtubuli devono ancora sOSTEGNO chinesina motilità. Poiché chinesina è un enzima motore robusto, questa è una restrizione abbastanza sciolto. Sostituendo con actina e microtubuli chinesina con un enzima famiglia miosina, la lunghezza di persistenza di actina può essere misurata utilizzando la stessa tecnica.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Reagenti</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Imidazolo</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cloruro di potassio</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cloruro di magnesio</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 126615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Biotinilato BSA</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 29130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Α-caseina</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Streptavidina</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 21125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ditiotreitolo</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Paclitaxel</td&gt;<td&gt; LC Laboratori</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucosio ossidasi</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Catalasi</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucosio</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ATP</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2-mercaptoetanolo</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt; Toxic. Acquista piccola quantità.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24x60 mm N ° 1 1/2 bicchiere di copertura</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22X22 mm N ° 1 bicchiere di copertura</td&gt;<td&gt; Gold Seal</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Grasso per alto vuoto</td&gt;<td&gt; Dow-Corning</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Attrezzatura</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TIRF microscopio</td&gt;<td&gt; Molti</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; Il microscopio TIRF utilizzato in questo metodo è stato fatto in casa.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL (software)</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; Potrebbe sostituire MATLAB, ImageJ, o altri software di analisi dell&#39;immagine.</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

misure rigidezza flessionale di biopolimeri usando saggi gliding

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

I microtubuli sono polimeri del citoscheletro che svolgono un ruolo nella divisione cellulare, cellulari, meccanica e mezzi di trasporto intracellulare. Ciascuna di queste funzioni richiede microtubuli che sono rigidi e dritti abbastanza per occupare una frazione significativa del diametro della cellula. Come risultato, la lunghezza di persistenza microtubuli, una misura della rigidità, è attivamente studiati negli ultimi due decenni 1. Tuttavia, restano questioni aperte: microtubuli brevi sono 10-50 volte meno rigido rispetto microtubuli lunghi 2-4, e anche lungo i microtubuli hanno misurato lunghezze persistenza che variano da un ordine di grandezza 5-9. Qui, vi presentiamo un metodo per misurare la persistenza lunghezza microtubuli. Il metodo si basa su un saggio microtubuli chinesina-driven scorrimento 10. Grazie alla combinazione di scarsa marcatura fluorescente dei microtubuli singoli con servizio di monitoraggio singola particella di fluorofori singoli collegati al microtubulo, il Glidintraiettorie g di microtubuli singoli vengono tracciati con precisione a livello di nanometri. La lunghezza di persistenza delle traiettorie è uguale alla lunghezza di persistenza del microtubulo nelle condizioni utilizzate 11. Una routine di rilevamento automatico viene utilizzato per creare traiettorie microtubuli da fluorofori collegati microtubuli singoli, e la lunghezza di persistenza di tale traiettoria è calcolata utilizzando routine scritte in IDL. Questa tecnica è attuabile rapidamente, e in grado di misurare la lunghezza di persistenza di 100 microtubuli in un giorno di sperimentazione. Il metodo può essere esteso per misurare la lunghezza di persistenza sotto una varietà di condizioni, tra lunghezza di persistenza in funzione della lunghezza lungo i microtubuli. Inoltre, le routine di analisi utilizzate può essere esteso a miosina basati azione saggi scorrimento, per misurare la lunghezza di persistenza dei filamenti di actina pure.

Un&#39;istantanea da un saggio scorrimento è mostrato in Figura 2. Una buona densità microtubuli è microtubuli 1-10 per campo; sostanzialmente più provocherà sbandamento come microtubuli incrociano. Un grafico delle traiettorie 11 microtubuli del dosaggio scorrimento in figura 2 è mostrato in Figura 3. Traiettorie tipiche sono 10-30 micron di lunghezza, alcune traiettorie presentano spazi vuoti dove si incrocia un altro microtubuli. Tali traiettorie possono essere scart...

Un metodo per misurare la lunghezza di persistenza o rigidezza flessionale di biopolimeri è descritto. Il metodo utilizza una chinesina-driven saggio microtubuli planata per determinare sperimentalmente la lunghezza di persistenza di microtubuli singoli ed è adattabile a actina saggi basati scorrimento.

Misure rigidezza flessionale di biopolimeri usando saggi Gliding

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare un saggio di scorrimento per misurare la rigidità UAL dei microtubuli. Ciò si ottiene attaccando prima in modo specifico la proteina motoria chinesina a un vetrino da microscopio con domini motori liberi di legare i microtubuli. Il secondo passo consiste nell'aggiungere al campione microtubuli marcati in fluorescenza, che vengono tradotti dalla chinesina.I prossimi video dei microtubuli scorrevoli vengono raccolti utilizzando la microscopia a fluorescenza. La fase finale consiste nell'analizzare i video del saggio di scorrimento per calcolare la rigidità flessionale del micro tubulo. Infine, i saggi di scorrimento vengono utilizzati per determinare la rigidità flessionale dei singoli microtubuli.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della meccanica del citoscheletro, come la rigidità alla flessione dei singoli polimeri del citoscheletro. A dimostrare questa procedura sarà Anna Ratliff, una studentessa del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, preparare il tampone di prova di lavoro aggiungendo 10 microlitri di 200 milli mole di DIO, tre atol o DTT a un millilitro della soluzione tampone di prova stock e mescolare.Mantenere questa e tutte le altre soluzioni di lavoro a temperatura ambiente durante la procedura. Successivamente, utilizzando il tampone di prova, preparare 40 microlitri di tampone BSA di biotina combinando albumina sierica bovina biotinilata filtrata sterile a due milligrammi per millilitro con il tampone di prova di lavoro in un rapporto di uno a uno e mescolando la soluzione. Quindi preparare il tampone BSA combinando 645 microlitri di tampone per saggio con 5,5 microlitri di 117 milligrammi per millilitro di BSA e mescolando la soluzione.Preparare anche il tampone tritina mescolando 57 microlitri di tampone per il test con tre microlitri di strisciococco din filtrato sterile a 10 milligrammi per millilitro nel tampone del test. Successivamente, costruire le corsie di flusso su un vetrino coprioggetti di 24 x 60 millimetri, estrudere cinque sottili linee di grasso sottovuoto da una siringa da 10 millilitri. Utilizzando un puntale per pipette da 200 microlitri per regolare il flusso, le linee devono essere distanti circa quattro millimetri l'una dall'altra.Posizionare un vetrino coprioggetti di 22 x 22 millimetri sopra il grasso per vuoto e premere leggermente verso il basso per formare i canali. Con un volume approssimativo di 10 microlitri, le linee di grasso sottovuoto dovrebbero estendersi fino a circa il doppio della larghezza originale. Il passo successivo consiste nel prechiudere le corsie con albumina sierica bovina biotinilata pipettando 10 microlitri di tampone bioTE BSA in ciascuna corsia di flusso utilizzando la forza capillare per aspirare il tampone incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi risciacquare ogni corsia tre volte iniettando 15 microlitri di tampone BSA su un lato di ciascuna corsia mentre si estrae la soluzione dall'altro lato utilizzando un panno Kim o carta da filtro. Fare attenzione a non introdurre bolle d'aria nelle corsie. Successivamente, versare 15 microlitri di tampone streptavidina in ciascuna corsia e incubare per un massimo di due ore con un minimo di 10 minuti.Durante l'incubazione, preparare l'alfa KC in tampone mescolando 200 microlitri di tampone BSA, 50 microlitri di alfa KC filtrato sterile a cinque milligrammi per millilitro in tampone di saggio e 0,8 microlitri di 15 micromolari a TP a pH sette. Preparare anche la soluzione di chinesina pipettando il tampone alfa KCM in una nuova provetta e aggiungendo la biotina chinesina a 10 nanomolari e quindi mescolando dopo l'incubazione con il tampone streptavidina. Sciacquare ogni corsia tre volte con 15 microlitri di tampone BSA.Quindi risciacquare ogni corsia con 15 microlitri di tampone alfa kcn per ridurre il legame non specifico di chinesina e microtubuli al vetro. Quindi, aggiungere 15 microlitri di soluzione di chinesina in ciascuna corsia e incubare per 15 minuti a un'ora. Durante questo periodo, la biotina chinesina formerà un forte legame con la streptavidina legata alla superficie e consentirà ai domini motori della chinesina di essere accessibili per legare i microtubuli.Nel frattempo, preparare una soluzione di paclitaxel 40 micromolari e alfa KC e tampone. Il paclitaxel è importante per prevenire la depolimerizzazione dei microtubuli. In una cappa aspirante, preparare il tampone anti-sbiancamento a fluorescenza mescolando insieme 95 microlitri di tampone alfa KCM, 2,5 microlitri di glucosio, un microlitro di 100 x ossigeno scavenging.Mescolare un microlitro di Paclitaxel e DMSO a quattro millimolari. E infine, un microlitro di beta me capto etanolo. Dopo l'incubazione, sciacquare via l'eventuale biotina chinesina libera lavando ogni corsia con 15 microlitri di temperatura ambiente.Il paclitaxel in soluzione di alfa Kian utilizzando un tampone freddo può depolimerizzare i microtubuli. Infine, versare il tampone anti-candeggina a fluorescenza in una nuova provetta e aggiungere i microtubuli marcati in fluorescenza a una diluizione da uno a 100 a uno a 1000. Quindi aggiungere un millimolare a TP e mescolare.Iniettare 15 microlitri della soluzione di micro tubuli in una corsia e osservare utilizzando la microscopia a fluorescenza entro 30 minuti. L'aspetto più critico di questa procedura è avere una concentrazione ottimale di microtubuli per garantire che non si sovrappongano e avere un fondo basso. Le corsie rimanenti vengono utilizzate per ottimizzare la concentrazione dei microtubuli e utilizziamo il microscopio stesso per allinearle e metterle a fuoco.L'imaging dei microtubuli scorrevoli viene eseguito utilizzando un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale fatto in casa. Un obiettivo ad alta apertura numerica 100x visualizza un campo di circa 50 micron per 50 micron, che è uno spazio sufficiente per osservare il movimento per circa 100 secondi a una velocità di 0,5 micron al secondo. Il laser utilizzato per l'eccitazione a un'impostazione di potenza da tre a cinque milliwatt.Questa potenza è sufficientemente bassa da prevenire il fotosbiancamento del pavimento di quattro secondi più rapidamente di 100 secondi per consentire un tempo di imaging adeguato. Utilizzando il software di acquisizione delle immagini, raccogli sequenze di immagini a cinque fotogrammi al secondo per due minuti. Le sequenze dovrebbero essere abbastanza lunghe da consentire ai microtubuli di attraversare l'intero campo visivo.Analizza i dati dell'immagine utilizzando una routine IDL come il file, ottieni LP Pro, che può essere ottenuto dal materiale supplementare. Questa routine DL restituisce un valore di lunghezza di persistenza basato su tutti i microtubuli che scivolano in una data sequenza di immagini. Modificare i parametri di intensità in base all'intensità del fluoro quattro e alla configurazione del microscopio.Qui è mostrato un saggio di scorrimento effettuato con microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. I quattro di Fluor possono essere visti scarsamente decorati lungo la lunghezza dei microtubuli. Le singole traiettorie dei quattro fluoro appena mostrate sono unite, combinando una media di 10 quattro di fluorazione in un unico punto per 100 nanometri per migliorare l'analisi dei dati.Quando si osserva un singolo microtubulo, l'angolo di tangente tra ciascun punto può essere facilmente calcolato e mappato in funzione della lunghezza. Utilizzando gli angoli tangenti, è possibile calcolare la lunghezza di persistenza e tracciare la lunghezza media del cosegno per segmento utilizzando l'equazione mostrata qui. Una volta padroneggiata, è possibile determinare una linea di adattamento.Questa tecnica può essere utilizzata per misurare la rigidità alla flessione di diverse dozzine di microtubuli in tre o quattro ore, se eseguita correttamente.

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La durata dei polimeri e dei compositi polimerici rinforzati con fibre in servizio è un aspetto critico per la loro progettazione e la manutenzione basata sulle condizioni. Presentiamo una nuova piattaforma di test di laboratorio a basso costo per lo studio dell'influenza dei carichi meccanici e ambientali concomitanti e possiamo aiutare a progettare strutture composite più efficienti ma più sicure.

Una piattaforma di prova per una durata Studi di polimeri e fibra-Reinforced Polymer Composites sotto Stimoli Concurrent Hygrothermo-meccanico

Qui viene descritto un metodo che consente una preparazione rapida, efficiente ed economica di gel di poliacrilammide in un formato di piastra multipozzetto. Il metodo non richiede alcuna attrezzatura specializzata e potrebbe essere facilmente adottato da qualsiasi laboratorio di ricerca. Sarebbe particolarmente utile nella ricerca incentrata sulla comprensione delle risposte cellulari dipendenti dalla rigidità.

Semplice Poliacrilammide-based a più pozzetti Rigidità Assay per lo Studio della rigidezza-dipendenti le risposte delle cellule

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Sintesi di programmabile principale catena Elastomeri liquido-cristallini Utilizzando una a due stadi Thiol-acrilato di reazione

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Nanotubi di DNA come un Versatile strumento per lo studio di polimeri semiflessibili

Vi presentiamo un protocollo per l'esecuzione di prove di flessione di tre punti su fibre di scala sub-millimetrica utilizzando un dispositivo di prova meccanico su misura. Il dispositivo può misurare le forze che vanno da 20 µN fino a 10 N e può quindi ospitare una varietà di formati di fibra.

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