Raccolta, isolamento e di arricchimento di batteri naturalmente presenti magnetotactic dall'ambiente

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i batteri magnetotattici da un ambiente di acqua dolce. Ciò si ottiene raccogliendo prima campioni di sedimenti d'acqua dal bordo di un fiume o di un lago. Il secondo passo consiste nell'isolare i batteri magnetotattici contenuti all'interno del campione ambientale utilizzando una barra magnetica.

Successivamente, i batteri magnetotattici vengono arricchiti utilizzando una pista capillare in vetro e un magnete. Infine, i batteri magnetotattici sono caratterizzati utilizzando la microscopia ottica. In definitiva, la microscopia elettronica a trasmissione viene utilizzata per mostrare le dimensioni e la forma dei batteri e delle loro zone magnetiche contenenti magnetite.

Questo metodo ci aiuta a comprendere questioni chiave, la microbiologia ambientale, come il modo in cui il magneto si è evoluto sulla terra e come i batteri magnetotattici hanno sintetizzato magneti di dimensioni nanometriche. A dimostrare la procedura oggi sarà Zachary a Stryker. Zachary è un dottorando nel mio laboratorio.

Lavora con me e mio fratello qui alla Ohio State University. Quando si decide su un sito di acqua dolce per raccogliere batteri magnetotattici o MTB, spesso è meglio iniziare con uno stagno o un ruscello a movimento lento che ha uno strato di sedimenti fangosi morbidi. In questa dimostrazione, abbiamo raccolto un campione sul bordo del fiume Oland Tangy nel campus della Ohio State University a Columbus, Ohio.

Trova una posizione in cui la profondità dell'acqua è compresa tra 10 e 100 centimetri e, utilizzando un contenitore con tappo a vite trasparente, riempi il contenitore con lo strato più superficiale di sedimento e lo spazio rimanente con acqua, tappando il contenitore sott'acqua in laboratorio, allentando il tappo e lasciandolo a coprire il contenitore per ridurre l'evaporazione e conservalo al buio per diverse ore o diversi giorni per consentire il sedimento e trovare particelle da depositare. Per realizzare piste da corsa per arricchire la MTB. Inizia usando una penna o una lima diamantata per tagliare la parte superiore di una pipetta di pasta di vetro da 5,75 pollici, lasciando spazio sufficiente per uno o due millilitri di acqua.

Quindi, utilizzare un bruciatore e per sigillare l'autoclave della punta. Diversi cingoli di sollevamento insieme a cotone e lunghi aghi di metallo. Quando sei pronto per isolare la MTB, posiziona i magneti ai lati del contenitore di plastica, a circa un centimetro sopra l'interfaccia dell'acqua di sedimento con i poli sud e nord sui lati opposti del contenitore.

Fare attenzione a non disturbare il sedimento. Attendi da 30 minuti a diverse ore affinché i batteri nuotino verso il magnete. Quindi, utilizzare una siringa per rimuovere il fluido dal contenitore del campione vicino all'interfaccia dell'acqua del sedimento.

Collegare un filtro alla siringa e un ago di metallo al filtro, assicurandosi quindi che non vi siano bolle nel capillare. Utilizzare l'ago per aggiungere l'acqua campione filtrata a una pista da corsa per autoclave con cotone sterile e l'ago di metallo. Ostruisci la pista spingendo il cotone all'interno del capillare a una distanza di 0,5-un centimetro dall'estremità sigillata.

Usando una pipetta sterile, rimuovi i batteri magnetotattici dal contenitore dove sono raggruppati vicino al polo sud del magnete e aggiungi la MTB contenente acqua all'estremità aperta della pista. Una volta che la pista è stata riempita con il fluido campione, appoggiarlo su un lato su una superficie orizzontale e posizionare il polo sud di una barra magnetica accanto alla punta di tenuta della pista. Attendi da cinque a 30 minuti affinché la MTB migri attraverso il cotone.

Usa un coltello diamantato per fare delicatamente un piccolo graffio vicino al tappo di cotone e staccare l'estremità della pista. Utilizzare una siringa da un millilitro con ago stretto per rimuovere il fluido arricchito con MTB dalla punta della pista. Per osservare la MTB al microscopio ottico, posizionare una goccia del campione arricchito su un vetrino coprioggetti.

Posizionare il vetrino coprioggetto su un O-ring appoggiato su un vetrino. Questo è chiamato la goccia sospesa. L'O-ring deve avere un diametro leggermente inferiore rispetto al vetrino coprioggetto.

Quindi, posizionare il vetrino su un tavolino da microscopio ottico e mettere a fuoco un bordo della goccia. Quindi, per attirare la MTB su un lato del dislivello, posiziona l'estremità sud di una barra magnetica vicino a quel lato in pochi minuti, molte MTB dovrebbero essere sul bordo del dislivello. Per osservare la MTB di TEM, posizionare una griglia di rame da 200 mesh stabilizzata var stabilizzata e rivestita di carbonio sulla goccia dei batteri arricchiti e lasciare che il campione si depositi per 10 minuti.

Dopo aver lavato il campione su una goccia d'acqua per 30 secondi, posizionarlo su una goccia di acetato di orinatoio al 2% per 30 secondi o cinque minuti, quindi utilizzare un pezzo di carta da filtro per asciugare completamente e analizzare i campioni utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione a 200 kilovolt. Qui è mostrata un'immagine al microscopio elettronico a trasmissione di un singolo batterio magnetotattico arricchito da un campione di sedimenti ambientali. La spirale e la morfologia della cella e delle zone magnetiche sono chiaramente visibili insieme a un singolo flegel.

Una volta che i batteri magnetotattici sono stati raccolti dall'ambiente, la tecnica di separazione magnetica richiederà circa tre ore se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi dell'RNA ribosomiale a 16 s, che risponderà a ulteriori domande come, qual è la relazione filogenetica dei batteri magnetotattici appena scoperti con altri, con altri microrganismi.