Intatta Caratterizzazione istologica di Microdevices Brain-impiantati e il tessuto circostante

Lo scopo di questa procedura è quello di visualizzare l'interfaccia del tessuto cerebrale intatto attorno a micro dispositivi impiantati cronicamente nel tessuto cerebrale dei roditori. Ciò si ottiene utilizzando prima l'elastomero siliconico a cellule rapide e un acrilico dentale in due parti per coprire la craniotomia e formare una calotta cranica attorno al dispositivo impiantato nel cervello. Dopo aver perfuso l'animale con il fissativo e l'elaborazione tissutale post-mortem, la parte impiantata nel cervello del dispositivo viene separata dal cappuccio della testa bruciando l'acrilico dentale e tagliando la cellula rapida.

Successivamente, il cervello viene rimosso e affettato con un vioma per catturare l'impianto in una sezione di tessuto. Il passaggio finale consiste nel preparare il tessuto per l'imaging fluorescente lavando l'etichettatura e quindi eliminando la sezione del tessuto in una soluzione di chiarificazione ottica. In definitiva, la microscopia confocale viene utilizzata per mostrare la risposta biologica intatta che l'impianto cerebrale penetrante produce nel tessuto circostante su scala subcellulare.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'esplicativa, il dispositivo, è che la tecnica evita di interrompere il tessuto circostante e aderente al dispositivo impiantato in modo che il tessuto di interfaccia possa essere esaminato intatto. Questo metodo si basa su tecniche avanzate di immunoistochimica e microscopia e si traduce in dati di microscopia confocale che descrivono in dettaglio la regione che circonda un dispositivo impiantato nel cervello. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroprotesi, come il grado in cui la morte cellulare locale, la formazione di cicatrici gliali e la riorganizzazione dei vasi sanguigni influiscono realmente sulla durata dei dispositivi a micro elettrodi impiantati nel cervello.

Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sull'interfaccia neurale cronica degli array di micro elettrodi impiantati nel cervello. Le tecniche coinvolte in questo metodo possono essere applicate anche ad altre aree della ricerca neuroscientifica, tra cui cannule impiantate o fibre ottiche In una cappa aspirante, iniziare la procedura rimuovendo con cura la pelle e altri tessuti attorno alla calotta cranica acrilica, utilizzando pinze e piccole forbici mentre si indossano guanti insensibili al calore. Usa un ferro da stiro per produrre una finestra nell'acrilico ammaccatura ed esporre un'area di sigillatura rapida sottostante.

Il dispositivo deve essere visibile racchiuso nella chiusura rapida trasparente. Successivamente, sotto un microscopio operatorio, tagliare l'elastomero siliconico con un paio di micro forbici curve. Quindi rimuovere piccoli pezzi di sigillo rapido con una pinzetta e micro forbici fino alla posizione in cui il dispositivo entra nel cervello.

Continua a tagliare lungo la superficie della craniotomia per separare i componenti del dispositivo che si attaccano al polisilicio e al cranio dai componenti impiantati nel cervello. Prestare attenzione quando si tagliano i componenti esposti del dispositivo. Evitare di spingere o trascinare le protesi nel tessuto fissato.

Quindi rimuovere con cura l'osso attorno al cappuccio della testa usando poi la pelle grezza. Usa una spatola per separare il cervello con il dispositivo impiantato dal cranio. Ora metti il cervello in una capsula di Petri di vetro piena di HBHS.

Usa il blocco cerebrale e le lame di rasoio per sezionare il cervello e creare un piano piatto che corrisponda strettamente all'angolo dei dispositivi impiantati. Dopodiché, premi due lame di rasoio attraverso il tessuto cerebrale esponendo la superficie piana che verrà montata sul Vibram. Quindi, posiziona del ghiaccio sotto la piattaforma Vibram.

Quindi asciugare brevemente la superficie del fazzoletto su un tovagliolo di carta. Successivamente, orientare il campione in modo tale che la dimensione più ampia sia parallela alla direzione di movimento della lama del tono vibrante per evitare che la lama possa potenzialmente rovesciare il tessuto, incollare immediatamente il piano piatto al tavolino con la super colla. Dopo che la colla ha fissato un PBS freddo sul piatto di vibrato attorno al fazzoletto.

Ora tagliare le fette di tessuto tra 250 e 500 micron utilizzando la massima velocità di vibrazione e una velocità di progressione lenta della lama con un angolo della lama di 10 gradi rispetto all'orizzontale. Quindi raccogli le fette con cura con un pennello e una spatola e conserva un HBHS in una piastra a 24 pozzetti a quattro gradi Celsius mentre raccogli le fette, tieni traccia dello spessore e della posizione di ciascuna fetta mentre vengono rimosse sulla piastra a 24 pozzetti. Una volta che il dispositivo Insitu è visibile, raccogliere una fetta di tessuto di circa 500 micron di spessore.

Al fine di catturare il dispositivo in una singola fetta di tessuto per raccogliere una sezione di tessuto più sottile, è possibile raccogliere con cura fette da 100 micron per avvicinarsi al dispositivo. A quel punto si può raccogliere una fetta spessa meno di 500 micron con il dispositivo all'interno. Iniziare la lavorazione dei tessuti lavando le fette tre volte a cinque minuti per lavaggio in HBHS.

Quindi incubarli in idruro di bora di sodio per 15 minuti. Su ciascun lato della fetta, capovolgere lentamente la fetta utilizzando un piccolo pennello ed evitare di toccare le aree intorno al dispositivo impiantato. Insieme al pennello piccolo si può usare anche un micro cucchiaio in acciaio inox o rivestito in teflon.

Ora lavate le fette tre volte a cinque minuti per lavaggio in soluzione di lavaggio a temperatura ambiente. Bloccateli nella soluzione di lavaggio per due ore a temperatura ambiente mentre girate le fette. Dopo un'ora dopo due ore, incubare le fette in anticorpi primari per circa 48 ore a quattro gradi Celsius.

Quindi, eseguire sei lavaggi rapidi di tre minuti con la soluzione di lavaggio. Quindi eseguire sei lavaggi di un'ora in soluzione di lavaggio. Successivamente, incubarli in anticorpi secondari per circa 48 ore a quattro gradi Celsius.

Ancora una volta, eseguire sei lavaggi rapidi di tre minuti seguiti da sei lavaggi di un'ora in soluzione di lavaggio. Successivamente, rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere la soluzione di chiarificazione U2 a base di glicerolo. Coprire il piatto con un foglio di alluminio e conservare a quattro gradi Celsius.

Lasciare che le fette spesse si liberino per circa una settimana o sezioni di tessuto molto spesse per due o tre settimane a quattro gradi Celsius. Dopo lo sgombero, montare le sezioni di tessuto sui vetrini utilizzando la soluzione di pulizia come mezzo di montaggio. Sigillare tutti i vetrini con smalto trasparente e conservarli a quattro gradi Celsius lontano dalla luce, utilizzando obiettivi per microscopio a distanza di lavoro più lunga.

Iniziare l'imaging con un microscopio confocale a scansione laser o un microscopio a due fotoni. Dimostreremo con un software di invio XS L SM seven 10 Carl Xi e un tavolino di traslazione XY controllato da computer per visualizzare un panorama 3D attorno a un impianto per correggere l'indice di rifrazione della soluzione di chiarezza. In questa dimostrazione, inseriamo un valore dell'indice di rifrazione di 1,4 nel software del microscopio Leica Zen per la soluzione di pulizia U2.

Questa impostazione regola leggermente gli intervalli dei passi Z per tenere conto della mancata corrispondenza dell'indice di rifrazione nel tessuto vicino al dispositivo. Valutare approssimativamente la finestra dell'asse Z appropriata e le impostazioni di raccolta dei dati nella dimensione zdi per ciascun canale fluorescente utilizzando una bassa potenza laser, da circa lo 0,5 al 5% e grandi dimensioni del passo Z. Quindi utilizzare il software Zen panorama per impostare l'obiettivo al centro XY dell'eventuale panorama e per determinare il numero di posizioni di raccolta necessarie per gli assi x e y.

Per coprire l'area di interesse, rivaluta e finalizza la finestra di raccolta dell'asse Z controllando rapidamente il primo e l'ultimo fotogramma dello stack. Quindi, impostare manualmente la sensibilità del rivelatore e la potenza del laser in modo che aumentino con l'aumentare della profondità. L'obiettivo è in genere quello di mantenere approssimativamente la stessa intensità dell'immagine indipendentemente dalla profondità dell'immagine nella fetta di tessuto e anche di evitare un elevato rumore di fondo.

Raccogli ogni serie di dati di immagini fluorescenti, se necessario per evitare segnali sovrapposti, esegui linee laser in sequenza. Modificare le impostazioni del software per raccogliere i dati o i dati di trasmittanza e utilizzare un laser a lunghezza d'onda più lunga e penetrante, ad esempio 6 33 nanometri per catturare questi canali. Quindi determinare la potenza laser appropriata e rilevare una sensibilità per la raccolta della riflettanza e della trasmittanza e ripetere la stessa serie di raccolta attorno al dispositivo impiantato.

Infine, esportare i dati per la successiva elaborazione, quantificazione e analisi. L'imaging attraverso entrambi i lati del vetrino può consentire di valutare l'interfaccia attorno a un dispositivo, come mostrato qui, dove le microglia lungo il supporto di silicio di un MEA sono visibili da un lato e le microglia lungo i siti degli elettrodi e le tracce sono visibili dall'altro lato. Una volta che il tessuto montato può essere visualizzato utilizzando uno stadio di traslazione XY, è possibile generare panoramiche delle etichette fluorescenti sull'intera fetta di tessuto alla risoluzione desiderata.

Qui, nuclei cellulari colorati con uncini 3, 3, 3, 4, 2 e monociti microglia marcati con 3, 2, 9. Anti IBA one è stato ripreso simultaneamente su canali separati. Sono state raccolte anche la luce di trasmissione e la riflettanza mostrando la posizione dell'impianto di quattro settimane rispetto agli uncini e i dati IVA uno, la sovrapposizione di tutti i canali, ma la trasmissione è mostrata qui.

L'esame dettagliato dell'interfaccia tissutale morfologicamente conservata attorno ai micro dispositivi impiantati può essere raccolto ad alto ingrandimento per l'analisi della risposta tissutale locale, la riflettanza e la trasmittanza consentono la localizzazione del dispositivo mentre gli anticorpi fluorescenti o le etichette chimiche consentono l'imaging dettagliato dei componenti tissutali lungo l'interfaccia tissutale intatta. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di dedicare molto tempo all'attenta separazione dei dispositivi impiantati attraverso il cappuccio della testa e pianificare che questo passaggio richieda fino a 30 minuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere ed elaborare fette di cervello contenenti dispositivi impiantati.

Dovresti anche essere in grado di etichettare e raccogliere dati istologici che descrivono la neurobiologia che circonda questi dispositivi.