Name: La raccolta e la misurazione mediatori biochimici essudato nelle ferite chirurgiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: Impara a raccogliere e misurare mediatori biochimici nell'essudato di ferite chirurgiche dopo taglio cesareo. Questo metodo consente di analizzare citochine, chemochine e neuropetidi per studiare l'infiammazione e il dolore postoperatorio.

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Il lavoro del Dr. Carvalho è stato sostenuto da una borsa di studio presso l&#39;Ufficio di Ricerca sulla salute della Donna e il National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano del National Institutes of Health (5K12 HD043452). Angst Dr ricevuto forniture (On-Q PainBuster Post-Op sistema sollievo dal dolore) e fondi (per i saggi biochimici) da I-Flow (Lake Forest, California).

1. Protocollo di studio <ul><li> Ottenere l&#39;approvazione istituzionale Comitato Etico e il consenso informato scritto. </li><li> Selezionare una popolazione chirurgica appropriata per il comportamento di studio. Questa metodologia è stata applicata solo alle ferite parto cesareo, ma la maggior parte delle ferite chirurgiche sarebbe opportuno. </li><li> Considerare i criteri di inclusione ed esclusione per la partecipazione allo studio. I pazienti e le procedure con alti tassi di infezione della ferita chirurgica non può essere appropriato. </li><li> Standardizzare l&#39;anestesia e la gestione post-operatoria per tutti i pazienti per evitare potenziali fattori confondenti. </li></ul> 2. Nocicettivo e infiammatorie Collezione mediatore biochimico <ul><li> Inserire l&#39;interruttore ON-Q PainBuster con ON-Q SilverSoaker (I-Flow, Lake Forest, CA) nello strato sottocutaneo appena prima di ferire la chiusura (strati di tessuto di altri può essere considerato). L&#39;ON-Q Sistema Pain Relief PainBuster eroga in continuo soluzione fisiologica ad una velocità di 2 ml / h. Il vettore può essere pettineinato con o rispetto ai farmaci di interesse come un anestetico locale e non-steroidei anti-infiammatori. </li><li> Incorporano uno standard valvola a tre vie in questo sistema per permettere l&#39;aspirazione di essudato in punti temporali specifici. L&#39;infusione continua impedisce al catetere di coagulazione e migliora l&#39;affidabilità del sistema di produrre campioni di essudato. Se l&#39;aspirazione di essudato è difficile (circa il 5% dei casi), si consideri spingendo delicatamente sopra la ferita, cambiando la posizione del soggetto (ad esempio, il paziente seduto o sdraiato su di loro piatto), usando un normale filo 0,5-1 ml di soluzione fisiologica o di ritiro del catetere 1-2 cm. </li><li> A tempi previsti dal protocollo (ad esempio, 1, 4, 6, 24, e 48 ore dopo il parto cesareo), aspirare e prelevare 1 ml di essudato. Trasferire l&#39;essudato in una tazza di polietilene contenente 30 ml di inibitore di proteinasi. Abbiamo usato Inhibitor Complete proteinasi (Bioscience Roche, Palo Alto, CA) per i nostri scopi. </li><li&gt; Al stessi intervalli di tempo specificati dal protocollo di studio, raccogliere 10 ml di sangue. Abbiamo usato un tubo di raccolta del sangue contenente eparina al litio; nel nostro istituto si tratta di un verde ripiano in tubo di vetro. Aggiungere un ulteriore 300 ml di inibitore di proteinasi nei campioni di sangue. </li><li> Entro 1 ora di collezione, mettere i campioni in ghiaccio e centrifugare a 3000 rpm per 10 min. </li><li> Rimuovere sopranatante siero e ferita e posto in una provetta da microcentrifuga standard e conservare a -20 ° C. </li></ul> 3. Saggio di analisi <ul><li> Una volta che tutto l&#39;essudato studio e campioni di siero sono raccolti e memorizzati, scongelare e analizzare i campioni nello stesso momento. </li><li> Abbiamo misurato le citochine e chemochine utilizzando un immunodosaggio multiplex. L&#39;immuno-analisi tecnica di multiplex ci permette di dosaggio numerosi analiti da piccoli (50 pl) campioni di volume. Il multiplex producono risultati comparabili con quelli ottenuti con ELISA. Abbiamo usato il 17-plex Bio-PlexTM sistema (BioRad, Hercduli, CA) per la nostra analisi. Questo test è in grado di misurare il fattore di necrosi tumorale α (TNFa), interferone α (INFα), interleuchina 1β (IL-1β), interleuchina 2 (IL-2), interleuchina 4 (IL-4), interleuchina 5 (IL-5 ), interleuchina 6 (IL-6), interleuchina 7 (IL-7), interleuchina 8 (IL-8), interleuchina (IL-10), interleuchina 12 (IL-12), interleuchina 13 (IL-13), interleuchina 17 (IL-17), fattore stimolante colonie di granulociti (G-CSF), granulociti-macrofagi fattore stimolante le colonie (GM-CSF), monocyte chemoattractant proteina 1 (MCP-1) e proteina macrofagica infiammatoria 1 (MIP-1β). Fattore di crescita dei nervi è stata misurata con NGF DY256 anticorpo aggiungendolo al 17-plex piastra con il Bio-Plex kit ammina accoppiamento. </li><li> Per garantire una buona analisi di qualità, ogni misurazione deve essere effettuata in duplicato. Curve standard per ciascun analita sono generati utilizzando analiti di riferimento forniti dal produttore (a concentrazioni di 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3200 pg / ml, piùuno standard zero per la soluzione fisiologica). Le curve standard sono inclusi in ogni seduta e concentrazione del campione sono calcolati con Bio-Plex software di gestione. </li><li> La sostanza P e prostaglandina E2 sono stati misurati utilizzando altamente sensibilità kit ELISA. Abbiamo usato Assay Designs, Inc. (Ann Arbor, Michigan) per questa analisi. Effettuare l&#39;analisi in duplicato in base alle specifiche del costruttore. </li></ul>

<ol><li>Carvalho, B., Clark, D. J., Angst, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+Systemic+Release+of+Cytokines%2C+Nerve+Growth+Factor%2C+Prostaglandin+E2%2C+and+Substance+P+in+Incisional+Wounds+and+Serum+Following+Cesarean+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pain%22%5BJournal%5D)">Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery.</a> J. Pain. 9, 650-657 (2008).</li>
<li>Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D. C., Angst, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+subcutaneous+instillation+of+bupivacaine+compared+to+saline+reduces+interleukin+10+and+increases+substance+P+in+surgical+wounds+after+cesarean+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth.+Analg%22%5BJournal%5D)">Continuous subcutaneous instillation of bupivacaine compared to saline reduces interleukin 10 and increases substance P in surgical wounds after cesarean delivery.</a> Anesth. Analg. 111, 1452-1459 (2010).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo metodo di cui sopra è stato trovato per essere abbastanza sensibile da rilevare biochimici mediatori infiammatori e nocicettivo in essudato. Campionamento a diversi punti temporali ci ha anche permesso di osservare i cambiamenti di questi mediatori nel corso del tempo. 1,2 Non sono a conoscenza di qualsiasi altro test umana ferita chirurgica in grado di misurare il profilo seriale rilascio di mediatori infiammatori e nocicettivi in essudato della ferita chirurgica. Risultati del nostro metodo di raccol...

Dopo una incisione chirurgica, residenti e la migrazione di cellule infiammatorie rilasciano citochine pro-e anti-infiammatori, prostanoidi, neuropeptidi e chemochine che sono importanti per l&#39;avvio e il mantenimento del dolore. 3,4 La capacità di raccogliere marcatori biochimici specifici del sito è fondamentale per determinare il rapporto tra i livelli di siero e della ferita chirurgica, comprendere il complesso rapporto tra rilascio di mediatori e dolore chirurgico, e di essere in grado di valutare l&#39;effetto di entrambi sistemico e somministrazione del farmaco periferica sulla biochimica ferita chirurgica. Gli studi si sono concentrati su misure sistemiche di mediatori biochimici e non sono considerate specifiche del sito di rilascio. 5,6 misurazioni sierici di citochine e chemochine potrebbero non essere riflettente di eventi locali della ferita chirurgica biochimici e solo indicare una risposta globale sistemica al danno chirurgico. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata e visivo unico di questa metodologia che è stata abetest fa riferimento nel 2008 nel Journal of Pain. 1 L&#39;obiettivo di questo articolo JoVE è di fornire una descrizione univoca e visivamente migliore dei metodi.

la raccolta e la misurazione mediatori biochimici essudato nelle ferite chirurgiche

Collecting And Measuring Wound Exudate Biochemical Mediators In Surgical Wounds

Descriviamo un metodo mediante il quale siamo in grado di raccogliere e misurare biochimici mediatori infiammatori e nocicettivi nel sito della ferita chirurgica. Raccolta di marcatori biochimici specifici del sito è importante per capire la relazione tra i livelli di siero e ferita chirurgica, determinare eventuali associazioni tra rilascio di mediatori, il dolore, l&#39;uso di analgesici e altri esiti di interesse, e di valutare l&#39;effetto della somministrazione per via sistemica e periferica sulla ferita chirurgica biochimica. Questa metodologia è stata applicata a donne sane sottoposte a parto cesareo elettivo con anestesia spinale. Abbiamo misurato l&#39;essudato e mediatori di siero a intervalli di tempo stessi punteggi del dolore del paziente e il consumo di analgesici per fino a 48 ore dopo parto cesareo. Usando questa metodologia siamo stati in grado di rilevare vari mediatori biochimici compreso il fattore di crescita nervoso (NGF), prostaglandina E2 (PG-E2) sostanza P, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8,IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFa, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 e MIP-1β. Gli studi che applicano il presente saggio biologico umano ferita chirurgica non hanno trovato correlazioni tra ferita e le concentrazioni sieriche di citochine o il loro tempo a rilascio profilo (J Pain 2008;. 9 (7): 650-7) 1 Abbiamo anche documentato l&#39;utilità della tecnica da identificare. farmaco-mediata cambiamenti nel contenuto della ferita (citochine Anesth Analg 2010; 111:1452-9). 2

Usando questa metodologia siamo stati in grado di rilevare tutti i mediatori biochimici sopra delineati con l&#39;eccezione di IL-5 in essudato e plasma. 1,2 Alcune citochine addizionali non sono stati rilevati nel plasma (IL-4, IL-17, TNFa, INFγ , GM-CSF). 1 L&#39;andamento nel tempo di citochine e chemochine misurati in studi riportati sono stati coerenti, raggiungendo un plateau entro le prime ore che è stato sostenuto per il periodo di osservazione 24 ore .. 1,2 Tuttavia, NGF aumento...

Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata e visiva di una metodologia per la raccolta e la misurazione biochimici mediatori infiammatori e nocicettivi nel sito della ferita chirurgica dopo il parto cesareo. Questo saggio biologico umano è stato utilizzato per determinare le correlazioni tra ferita e concentrazioni sieriche di citochine e farmaco-mediata cambiamenti ferita citochine, chemochine e neuropetides.

La raccolta e la misurazione mediatori biochimici essudato nelle ferite chirurgiche

We describe a methodology by which we are able to collect and measure biochemical inflammatory and nociceptive mediators at the surgical wound site. ...

Il sistema antidolorifico On-Q è stato sviluppato per un'erogazione precisa dell'anestetico nel sito chirurgico. Ma i ricercatori possono modificare questo dispositivo per analizzare la secrezione da una ferita. Per iniziare questa analisi, il chirurgo inserisce il sistema On-Q nello strato sottocutaneo appena prima della chiusura della ferita.Dopo aver fissato l'On-Q alla pelle con striscia chirurgica e nastro trasparente, il dispositivo viene riempito con soluzione fisiologica, anestetico locale o farmaco per lo studio. Un rubinetto di arresto a tre vie è quindi incorporato in questo sistema per consentire l'aspirazione dell'essudato della ferita in punti temporali specificati in un dato momento. Punto uno, il millilitro di essudato può essere aspirato utilizzando un processo a siringa e conservato per un uso futuro o analizzato.Ciao, mi chiamo Brendan Cavallo del Dipartimento di Anestesiologia presso lo Stanford University Medical Center. Oggi vi mostreremo una procedura per la raccolta e la misurazione dell'essudato della ferita e dei mediatori biochimici dalla ferita chirurgica. Utilizzeremo questa procedura per studiare mediatori nocicettivi e infiammatori sito-specifici da ferite chirurgiche a intervalli di tempo regolari, come specificato dal protocollo di studio per il successivo parto cesareo.Ok, ora iniziamo. L'équipe chirurgica inizia la procedura inserendo il sistema antidolorifico On-Q nello strato sottocutaneo appena prima della chiusura della ferita. L'on Q viene quindi fissato alla pelle con striscia chirurgica e medicazione con nastro trasparente.L'on Q è riempito con un massimo di 100 millilitri di soluzione fisiologica, anestetico locale o farmaco in studio. Il sistema eroga continuamente soluzione fisiologica normale o anestetico locale per via sottocutanea nella ferita a una velocità di due millilitri all'ora. Questa erogazione continua impedisce la coagulazione del catetere e migliora l'affidabilità del sistema per la produzione di campioni di essudato.Successivamente, in questo sistema è incorporato un rubinetto di arresto a tre vie per consentire l'aspirazione dell'essudato della ferita in punti temporali specificati dal protocollo. Preleviamo un millilitro di essudato della ferita in una tazza di polietilene contenente 30 microlitri di inibitore della proteinasi. In questo caso, raccogliere l'essudato a sei e 24 ore dopo il parto cesareo.Allo stesso tempo, gli intervalli raccolgono 10 millilitri di sangue in una provetta verde per la raccolta del sangue contenente litio eparina. Il campione di sangue viene quindi centrifugato a 3000 giri/min per 10 minuti. Il siero supinato viene quindi aggiunto a 300 microlitri di inibitore della proteinasi.Anche l'essudato della ferita viene centrifugato e il supinato viene rimosso, i campioni di ferita e siero vengono quindi posti in una provetta standard per microcentrifuga e conservati a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Quando tutte le raccolte vengono elaborate, vengono misurati i livelli di mediatori biochimici sia nel siero che nell'essudato della ferita. Quindi ti abbiamo appena mostrato come misurare e raccogliere i mediatori biochimici di una ferita di taglio cesareo.Ma del resto puoi applicarlo a qualsiasi altra ferita chirurgica. Sebbene abbiamo trovato questa tecnica molto affidabile per la produzione di essudato della ferita in circa il 5% dei pazienti, potrebbe esserci qualche difficoltà nell'aspirazione dell'essudato della ferita. Le tecniche che utilizziamo per migliorare la situazione consistono nel cambiare la posizione di un paziente da seduta a sdraiata o viceversa.Spingiamo delicatamente anche sull'addome e sulla ferita. È possibile utilizzare un lavaggio salino normale di un cc e occasionalmente dobbiamo ritirare il catetere di uno o due centimetri in modo da poter produrre essudato della ferita. Quindi questo è tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi studi.

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Una tecnica per la raccolta e la misura della ferita chirurgica mediatori biochimici a punti temporali specifici.

Raccolta e misurazione nocicettivo mediatori infiammatori e nelle ferite chirurgiche

Questo video mostra l'imaging in vivo per studiare le dinamiche di reclutamento dei neutrofili in un sito di infezione in un topo transgenico immunocompromesso con neutrofili che esprimono GFP. Comporta l'iniezione di batteri luminescenti per causare un'infezione. Ciò porta al reclutamento di neutrofili nel sito di infezione, il cui tracciamento viene effettuato mediante imaging.

Monitoraggio delle dinamiche di reclutamento dei neutrofili e della carica batterica nel sito di infezione in un modello murino

Qui descriviamo un nuovo modello murino diabetico utilizzando topi glabri per il monitoraggio in tempo reale, non invasiva, di infezioni di ferita di biofilm di bioluminescenti Pseudomonas aeruginosa. Questo metodo può essere adattato ad infezione di altre specie di batteri e microrganismi geneticamente modificati, inclusi i biofilm multi-specie, di valutare e testare l'efficacia delle strategie di antibiofilm.

Vieni nel lato di luce: In Vivo monitoraggio di Pseudomonas aeruginosa Biofilm infezioni nelle ferite croniche in un modello murino Hairless diabetico

Qui vengono descritti due modelli di guarigione delle ferite murine, uno progettato per valutare le risposte di guarigione della ferita cellulare e citochina e l'altro per quantificare il tasso di chiusura della ferita. Questi metodi possono essere utilizzati con modelli di malattia complessi come il diabete per determinare i meccanismi di vari aspetti della scarsa guarigione delle ferite.

Valutazione della guarigione acuta delle ferite utilizzando l'impianto di spugna alcolica sottocutaneo dorsale e modelli di ferite cutanee della coda excisionali.

Questo protocollo descrive come generare ferite escisionali bilaterali a pieno spessore nei topi e come monitorare, raccogliere e preparare successivamente le ferite per l'analisi morfometrica. È inclusa una descrizione approfondita di come utilizzare sezioni istologiche seriali per definire, quantificare e rilevare con precisione i difetti morfometrici.

Modello di guarigione delle ferite escisionali murine e analisi istologica delle ferite morfometriche

Qui descriviamo metodi ex vivo  e in vivo per valutare la dispersione batterica da un'infezione da ferita nei topi. Questo protocollo può essere utilizzato per testare l'efficacia delle terapie topiche antimicrobiche e anti-biofilm, o per valutare la capacità di dispersione di diversi ceppi batterici o specie.

Valutazione della dispersione del biofilm nelle ferite murine

Qui dimostriamo una tecnica ottimizzata per valutare la riparazione delle ferite utilizzando la pelle umana ex vivo combinata con un approccio di colorazione a montaggio intero. Questa metodologia fornisce una piattaforma pre-clinica per la valutazione di potenziali terapie delle ferite.

Modello di ferita umana ex vivo e approccio di colorazione a montaggio intero per valutare con precisione la riparazione della pelle

Le ferite croniche resistenti agli antibiotici rappresentano una grave minaccia per il sistema sanitario. Le infezioni da biofilm sono ostinate e ostili e possono causare una chiusura funzionale carente della ferita. Riportiamo un modello suino clinicamente rilevante di ferite croniche a tutto spessore infette da biofilm. Questo modello è potente sia per gli studi meccanicistici che per testare gli interventi.

Modello suino di infezione da biofilm e ferite invisibili

Le ferite rappresentano una sfida sanitaria globale. Questo studio ha sviluppato una cabina fotografica standardizzata utilizzando la planimetria digitale per ridurre al minimo la variabilità della misurazione della ferita. Il monitoraggio delle ferite nei topi per 14 giorni ha rivelato un aumento iniziale dell'area e del perimetro della ferita, seguito da una chiusura graduale. Questa metodologia può aiutare a valutare la cinetica di chiusura della ferita in modelli preclinici.

Planimetria digitale per la valutazione della cinetica di chiusura della ferita in un modello murino

Questo studio presenta un modello da banco progettato per valutare la compatibilità dei materiali per la medicazione delle ferite con i sistemi di terapia delle ferite a pressione negativa, valutando la pressione e la raccolta di liquidi nell'arco di 72 ore con impostazioni di pressione continua e intermittente.

Sviluppo di un modello da banco per la valutazione della compatibilità dei materiali per la medicazione delle ferite con i sistemi di terapia delle ferite a pressione negativa

Impara a raccogliere e misurare mediatori biochimici nell'essudato di ferite chirurgiche dopo taglio cesareo. Questo metodo consente di analizzare citochine, chemochine e neuropetidi per studiare l'infiammazione e il dolore postoperatorio.

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