Name: Isolamento e registrazioni dei canali Kv in cardiomiociti murini atriale e ventricolare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Impara a isolare cardiomiociti atriali e ventricolari da topi geneticamente modificati per studi elettrofisiologici. Questo protocollo utilizza la tecnica patch clamp per analizzare i canali del potassio e comprendere le aritmie cardiache.

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Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Fritz-Thyssen-Stiftung e Charité / MDC.

1. Animal Anestesia e prelievo di organi <ol><li> Anestetizzare il mouse intraperitoneale (ip) iniezione di ketamina (200 mg / kg di peso corporeo) e TMA (20 mg / kg di peso corporeo). </li><li> Per anticoagulate iniettare 250 IP UI di eparina per evitare la coagulazione del sangue e la formazione di trombi. </li><li> Attendere fino narcosi viene raggiunto, che è caratterizzato da areflessia. Per verificare la presenza di areflessia, riflesso corneale prova toccando delicatamente la cornea o del volo reflex test pizzicamento coda. </li><li> Trasferire il mouse sul tavolo operatorio e fissarlo in posizione supina. </li><li> Incidere la pelle e la parete addominale al di sotto del xifoide ed eseguire toracotomia clamshell: estendere il taglio su entrambi i lati lungo l&#39;arco costale e successivamente tagliare le costole nella linea ascellare mediale, deviare verso l&#39;alto gabbia toracica. </li><li> Aprire pericardio, individuare grossi vasi. Premere delicatamente caudale cuore per visualizzare meglio l&#39;aorta. Bloccare l&#39;aorta con pinza. </li><li> Posizionare il cuore in concavità di una coppia di s<html> cissors e sezionare tutte le navi di collegamento con un unico taglio. Assicurarsi di conservare una parte sufficientemente grande della aorta ascendente per incannulazione Langendorff. </li><li> Trasferire cuore staccato immediatamente ad una piastra Petri riempito con ghiaccio freddo e pre-ossigenato soluzione di 1 (per le soluzioni, vedi Tabella 1). </li></ol> 2. Preparazione di perfusione Cuore e Langendorff <ol><li> Incannulare l&#39;aorta con una cannula di acciaio 1.8F. Assicurati di evitare embolia gassosa. </li><li> Aorta fissarsi sulla cannula con una sutura chirurgica e coronarie filo con 1 ml di soluzione 1. </li><li> Collegare cannula con un apparato Langendorff. </li><li> Assicurarsi che il tempo di toracotomia per incannulazione Langendorff non supera i 120 secondi per evitare di estesa ischemia / riperfusione al miocardio. </li><li> Cuore profumato con 10 ml di soluzione di Ca 2 + libero 2 (4 ml / min). </li><li> Cuore profumato con una soluzione di collagenasi 3 per 8 min (4 ml / min). </li></ol>le &quot;&gt; 3. microchirurgica dissociazione del Cardiac Chambers <ol><li> Cuore trasferimento in un pre-riscaldato a 100 mm piastra Petri contenente partire Ca 2 + soluzione 4. </li><li> Rimuovere con attenzione aortica e altri non-tessuto cardiaco con le forbici e scartarla. </li><li> Atri e ventricoli separati e continuare con ciascuna camera separatamente. Mantenere le cellule immersi in soluzione al 4. Utilizzare piccoli volumi (meno di 5 ml). </li></ol> 4. Dissociazione ulteriore Cardiomyocytes <ol><li> Cardiomiociti atriali: <ol><li> Per individuare cardiomiociti atriali trasferire gli atri in un apposito pre-riscaldata da 100 mm piastra di coltura e dissociare il tessuto attraverso delicatamente spinge via con una pinza sottile. Assicurare un dissociazione quasi completa del tessuto. </li><li> Usare una pipetta da 1 ml con allargata fuoco lucidato punta di plastica pipetta per sospendere le cellule in 1 ml di soluzione di 5 per 5 min. </li><li> Separare le cellule dai detriti utilizzando un filtro cella (200 maglia um). </li> &lt;li&gt; Aggiungere 5 ml di soluzione al 5 sospensione cellulare e centrifugare per 2 minuti a 16 xg a temperatura ambiente. </li><li> Le seguenti operazioni sono gestite sotto una cappa di coltura cellulare. Eliminare il supernatante e risospeso il pellet in 5 ml di soluzione 6. </li><li> Dopo sedimentazione per gravità per 10 min in una provetta da 15 ml, centrifugare per 1 min a 16 xg a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule a seconda della loro quantità in 1-5 ml di soluzione 6. </li></ol></li><li> Cardiomiociti ventricolari: <ol><li> Sezionare la regione di interesse ventricolare sinistra con pinza sottile in 5 ml di soluzione 4. </li><li> Sospendere cellule pipettando gentilmente finché la maggior parte delle cellule sono separate. Trasferire la soluzione cellulare dopo il filtraggio (200 maglia micron) in un tubo da 50 ml, si aggiunge un volume di 25 ml. </li><li> Centrifugare per 2 minuti a 16 xg a temperatura ambiente. </li><li> Le seguenti operazioni sono gestite sotto una cappa di coltura cellulare. Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 25 ml disoluzione 6 e consentire la sedimentazione delle cellule per 10 min. </li><li> Contare le cellule e rimuovere il surnatante, aggiungere 25-50 ml di soluzione 6 sulle cellule. </li></ol></li></ol> 5. Preparazione di Cardiomyocytes per elettrofisiologia cellulare, biochimica o se gli studi <ol><li> Per gli studi di elettrofisiologia, tenere i miociti in soluzione 6 in una provetta da 50 ml e inibire la sedimentazione. </li><li> Per studi biochimici, calcium imaging esempio, miociti piastra sul piatto laminina rivestite coltura cellulare (concentrazione finale di 20 pg / ml di laminina in PBS). </li><li> Per colorazione per immunofluorescenza preparare una coltura di piastra di cella piatto con vetrini coprioggetto rivestiti di vetro e con soluzione laminina (concentrazione finale di 50 pg / ml di laminina in PBS). <ol><li> Rimuovere la soluzione prima di miociti placcatura. Piastra le cellule e controllare la densità cellulare utilizzando un microscopio. </li><li> Lasciare i miociti aderire fodera per 1 ora a 37 ° C in 2% di CO 2, rimuovere la soluzionee iniziare subito con un protocollo standard procedura di colorazione. </li><li> Incubare con fissativo, ad esempio PFA 4% in PBS (pH 7,5) per 10 min a temperatura ambiente e seguire con tre passaggi di lavaggio PBS per 5 minuti ciascuna. </li><li> Per permeabilizzare le cellule e di inibire l&#39;anticorpo non specifico legame incubare i miociti con 10% di siero, 0,3% Triton, 0,2% BSA in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Incubare con l&#39;anticorpo primario per 1 ora a 37 ° C e lavare come descritto prima. </li><li> Incubare con l&#39;anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente. Per i nuclei di contrasto e di α-actinina uso e fluorocromo DAPI falloidina coniugato (Alexa Fluor 488, Invitrogen). </li><li> Dopo il lavaggio, trasferire il coperchio di vetro scivola attentamente silano vetrini trattati e cellule embed in fluorescenza mezzo di montaggio. </li></ol></li></ol> 6. Cellular Elettrofisiologia <ol><li> Eseguire Whole-cell patch-clamp su FREshly isolati cardiomiociti atriali e ventricolari a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire sani cardiomiociti compaiono nella camera di perfusione riempita con un volume definito della soluzione del bagno extracellulare. 117 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 4 mM NaHCO 3, 1,7 mM MgCl 2, 3 mM CoCl 2, HEPES 10 mM, glucosio 10 mM, e 0,02 mM Tetrodotoxina (TTX), (pH 7,4) . Utilizzare NaOH per la regolazione del valore di pH. </li><li> Usare un equipaggiamento patch clamp (cioè IX71 microscopio invertito, un amplificatore Multiclamp 700B, una acquisizione Digidata 1440A sistema e PC con pClamp10.3 software (Molecular Devices)). </li><li> Utilizzare pipette patch con resistenze di 3-5 MW quando riempito con soluzione intracellulare contenente 130 mM KCl, 2 mM MgCl2, 11 mM di HEPES, 11 mM EGTA, 5 mM Na 2 ATP, 0,4 mM Na 2 GTP, 5 mM Na 2 CP e 4,9 mM CaCl 2 (pH 7,2). Utilizzare KOH per la regolazione del valore di pH. </li><li> Evoke verso l&#39;esterno K + correnti duanello di 4,5 sec gradini di tensione per testare potenziali tra -60 e +50 mV a 10 mV, con incrementi da un potenziale di mantenimento di -70 mV dopo 20 msec prepulse a mV -40. </li><li> Assicurarsi di correnti di fuga sono sempre &lt;100 pA. </li><li> Per la dissezione di K + diverse correnti di usare inibitori specifici come 4-aminopiridina (4-AP; Biomedicals ICN, Irvine, CA, USA), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) o Tetraethylammonium (TEA, Sigma). Le soluzioni madre dovrebbero essere preparati in soluzione del bagno extracellulare, e applicato direttamente sulla zona più vicina possibile della cellula tramite una micropunta dopo &quot;baseline&quot; registrazioni. Equilibramento dovrebbe essere consentito per 2-3 minuti prima di &quot;droga&quot; registrazioni. </li><li> Per l&#39;analisi normalizzare ampiezze attuali singole celle a dimensione della cella (a cellula intera capacità di membrana). Analizzare i dati non in linea utilizzando pClamp10.3 software (Molecular Devices) o software simile. </li></ol>

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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Con lo sviluppo crescente di ceppi di topi geneticamente per studiare la funzione cardiaca e patologia cardiaca relativa a gene delezione c&#39;è anche un crescente interesse per metodi specializzati per studiare gli effetti della delezione genica specifica in vitro. Nel nostro laboratorio studiamo i ruoli di una famiglia di Kv canale subunità accessorie sulla ripolarizzazione cardiaca. I geni KCNE comprendono una famiglia di 5 geni (KCNE1-5), che svolgono un ruolo importante in ventricolare u...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td></tr><tr><td> Tetrodotoxina </td><td> Alomone </td></tr><tr><td> 4-amminopiridina </td><td> ICN Biomedicals </td></tr><tr><td> Heteropodatoxin 2 </td><td> Alomone </td></tr><tr><td> Tetraethylammonium </td><td> Sigma Chemicals </td></tr><tr><td> Collagenasi di tipo 2 </td><td> Worthington </td></tr></tbody></table>

isolamento e registrazioni dei canali kv in cardiomiociti murini atriale e ventricolare

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE geni codificano per una piccola famiglia di Kv canale subunità accessorie che formano complessi con eteromerici Kv canale subunità alfa di modificare le loro proprietà funzionali. Mutazioni in geni KCNE sono stati trovati in pazienti con aritmia cardiaca, come la sindrome del QT lungo e / o fibrillazione atriale. Tuttavia, precisa la fisiopatologia molecolare che porta a queste malattie resta sfuggente. In studi precedenti le proprietà elettrofisiologiche della malattia che provoca mutazioni in questi geni sono in gran parte state studiate in sistemi di espressione eterologa e non possiamo essere sicuri se gli effetti segnalati possono essere direttamente tradotti in cardiomiociti nativi. Nel nostro laboratorio abbiamo quindi utilizzare un approccio diverso. Siamo direttamente studiare gli effetti della delezione del gene KCNE in cardiomiociti isolati da topi knockout per elettrofisiologia cellulare - una tecnica unica che descriviamo in questo numero del Journal of esperimenti visualizzati. I cuori di geneticatopi ingegnerizzati KCNE lly stanno rapidamente asportato e montato su un apparato Langendorff da incannulazione aortica. Gratuito Ca 2 + nel miocardio è vincolato da EGTA, e la dissociazione dei miociti cardiaci viene poi raggiunto da perfusione retrograda delle arterie coronarie con una specializzata a basso Ca 2 + tampone contenente collagenasi. Atria, parete libera del ventricolo destro e il ventricolo sinistro possono essere separati da tecniche microchirurgiche. Il calcio è poi lentamente aggiunti ai cardiomiociti isolati in un passo multiplo comprendente procedura di lavaggio. Cardiomiociti atriali e ventricolari di aspetto sano senza contrazioni spontanee vengono immediatamente sottoposti ad analisi elettrofisiologiche dalla tecnica di patch clamp o altre analisi biochimiche nelle prime 6 ore dopo l&#39;isolamento.

Isolamento degli adulti cardiomiociti murini di topi geneticamente modificati per studiare la funzione dei geni di interesse specifico in vitro è diventato un potente strumento per capire meglio fisiopatologia cardiaca. Questo metodo è attualmente utilizzato da un numero piccolo ma crescente di base laboratori scientifici di tutto il mondo. Tuttavia, l&#39;isolamento dei cardiomiociti ventricolari murini adulti può essere difficile e deve essere fatto accuratamente e ripetutamente da mani esperte. Figur...

Kv canale disfunzione è associata ad aritmie cardiache. Al fine di studiare i meccanismi molecolari che portano a tali aritmie che utilizziamo un protocollo sistematico per l&#39;isolamento di cardiomiociti atriali e ventricolari da Kv topi knockout subunità dei canali ausiliari. Cardiomiociti isolati possono essere utilizzate immediatamente per cellulari studi elettrofisiologici, biochimici o di immunofluorescenza (IF) saggi.

Isolamento e registrazioni dei canali Kv in cardiomiociti murini atriale e ventricolare

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

L'obiettivo generale di questa procedura è estrarre cardiomiociti atriali e ventricolari vitali da topi geneticamente modificati per l'utilizzo in registrazioni mediante tecnica del patch clamp su cellula intera e altri esperimenti. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo con attenzione ma rapidamente il cuore di un animale anestetizzato. Il secondo passaggio consiste nel collegare il cuore asportato e cannullato all'apparato LOR.Successivamente, il cuore viene perfuso retrogradamente con una soluzione di collagenasi per allentare il tessuto connettivo; l'ultimo passaggio consiste nel dissociare il tessuto tirandolo delicatamente con pinzette fini e sospenderne le cellule mediante una pipetta di plastica con estremit&agrave; arrotondata e allargata. Dopodich&eacute;, le cellule vengono risospese in modo graduale con una soluzione ricca di calcio. Infine, viene impiegata la tecnica del patch clamp su cellula intera per evidenziare le differenze nelle correnti dei canali del potassio attivati dal voltaggio.Il vantaggio principale di questo metodo è che si otterrà una buona quantità di cardiomiociti atriali e ventricolari con ottime caratteristiche per ulteriori esperimenti. In generale, i ri

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Descriviamo l'isolamento di miociti atriali umani, che possono essere utilizzati per Ca...

Isolamento dei miociti atriali umane per misure simultanee di Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitori e correnti di membrana

Qui si descrive l'isolamento di cardiomyoctyes adulte di topo mediante un sistema di perfusione Langendorff. Le cellule risultanti sono Ca2 +-tolerant, elettricamente quiescente e può essere colta e trasfettate con-adeno o lentivirus per manipolare l'espressione genica. La loro funzionalità può anche essere analizzato con il sistema MMSYS e tecniche di patch clamp.

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

Singoli cardiomiociti di topi wild type e mutanti possono essere isolati dal cuore per studiare la loro contrattilità e i transitori del calcio. Ciò consente di caratterizzare il contributo della disfunzione cellulare alla disfunzione cardiaca da qualsiasi causa.

Isolamento e fisiologica Analisi di mouse Cardiomyocytes

Le attuali conoscenze sulla base cellulare di malattie cardiache si basa principalmente su studi su modelli animali. Qui descriviamo e validare un nuovo metodo per ottenere singoli cardiomiociti vitali da piccoli campioni chirurgici di miocardio ventricolare umana. Miociti ventricolari umani possono essere utilizzati per studi elettrofisiologici e test della droga.

Isolamento e caratterizzazione funzionale di Human ventricolare Cardiomyocytes da campioni freschi chirurgici

Qui, descriviamo una procedura basata su Langendorff, ottimizzata per l'isolamento di singole cellule cardiomiociti atriali da un modello del ratto di metabolico sindrome-relativo infarto con la frazione conservata di espulsione. Una regolazione manuale della pressione intraluminale delle cavità cardiache è implementata per rendere funzionalmente intatto miociti adatto per studi di accoppiamento eccitazione-contrazione.

Isolamento dei cardiomiociti atriali da un modello del ratto di metabolico sindrome-relativo infarto con la frazione conservata di espulsione

Questo protocollo viene utilizzato per isolare i cardiomiociti atriale singoli dal cuore adulto del topo utilizzando un approccio di digestione a blocchi. Questo approccio viene utilizzato per isolare i miociti atriale destro o sinistro che possono essere utilizzati per caratterizzare l'elettrofisiologia dei miociti atriale negli studi patch-clamp.

Isolamento dei miociti atriale dai topi adulti

Presentato è un protocollo per l'isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani e animali da fette miocardici tagliate con vibratome. È possibile ottenere rese elevate di cellule tolleranti al calcio (fino a 200 cellule/mg) da piccole quantità di tessuto (&lt;50 mg). Il protocollo è applicabile al miocardio esposto all'ischemia fredda fino a 36 h.

Isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani dalle fette miocardici Vibratome-Cut

Un metodo è descritto per l'isolamento simultaneo di miociti e non miociti sia dagli atri che dai ventricoli di un singolo cuore adulto di topo. Questo protocollo si traduce in rese costanti di miociti cardiaci altamente vitali e non miociti e descrive in dettaglio le condizioni ottimali di coltura specifica delle cellule per la fenotipizzazione e l'analisi in vitro.

Isolamento simultaneo e cultura di miociti atriali, miociti ventricolari e non miociti da un cuore di topo adulto

I modelli murini consentono di studiare i meccanismi chiave dell'aritmogenesi. A tale scopo, sono necessari cardiomiociti di alta qualità per eseguire misurazioni patch-clamp. Qui viene descritto un metodo per isolare i miociti atriali e ventricolari murini tramite perfusione Langendorff a base di enzimi retrogradi, che consente misurazioni simultanee di transitori di calcio e corrente di calcio di tipo L.

Isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità per misurazioni simultanee di transitori Ca2+ e corrente di calcio di tipo L

Questo protocollo descrive le modifiche del metodo Langendorff, compresa la profondità della cannulazione dell'aorta per l'isolamento simultaneo di miociti atriali e ventricolari da topi adulti.

Modifiche del metodo Langendorff per l'isolamento simultaneo di miociti atriali e ventricolari da topi adulti

Impara a isolare cardiomiociti atriali e ventricolari da topi geneticamente modificati per studi elettrofisiologici. Questo protocollo utilizza la tecnica patch clamp per analizzare i canali del potassio e comprendere le aritmie cardiache.

Isolamento e registrazioni dei canali Kv in cardiomiociti murini atriale e ventricolare

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