Isolamento e registrazioni dei canali Kv in cardiomiociti murini atriale e ventricolare

L'obiettivo generale di questa procedura è estrarre cardiomiociti atriali e ventricolari vitali da topi geneticamente modificati per l'utilizzo in registrazioni mediante tecnica del patch clamp su cellula intera e altri esperimenti. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo con attenzione ma rapidamente il cuore di un animale anestetizzato. Il secondo passaggio consiste nel collegare il cuore asportato e cannullato all'apparato LOR.

Successivamente, il cuore viene perfuso retrogradamente con una soluzione di collagenasi per allentare il tessuto connettivo; l'ultimo passaggio consiste nel dissociare il tessuto tirandolo delicatamente con pinzette fini e sospenderne le cellule mediante una pipetta di plastica con estremità arrotondata e allargata. Dopodiché, le cellule vengono risospese in modo graduale con una soluzione ricca di calcio. Infine, viene impiegata la tecnica del patch clamp su cellula intera per evidenziare le differenze nelle correnti dei canali del potassio attivati dal voltaggio.

Il vantaggio principale di questo metodo è che si otterrà una buona quantità di cardiomiociti atriali e ventricolari con ottime caratteristiche per ulteriori esperimenti. In generale, i ricercatori alle prime armi con questa tecnica potrebbero incontrare difficoltà, poiché è necessaria molta pratica per eseguire con precisione questa procedura e ottenere risultati davvero soddisfacenti. Dopo aver iniettato gli anestetici e 250 IU di eparina, verifico che il topo sia profondamente anestetizzato pizzicandone la coda per controllare il riflesso di fuga.

Successivamente, trasferire il topo sul tavolo operatorio in posizione supina. Quindi praticare un'incisione sulla cute e sulla parete addominale al di sotto dello xifoide. Per eseguire una toracotomia a bivalve.

Estendere l'incisione lateralmente lungo l'arco costale. Successivamente, tagliare le costole lungo la linea ascellare mediale e sollevare la gabbia toracica verso l'alto. Dopodiché, aprire il pericardio e individuare i grossi vasi.

Premere delicatamente il cuore per visualizzare meglio l'aorta. Quindi clampare l'aorta utilizzando una pinza. Sollevare con attenzione il cuore, quindi posizionare un paio di forbici al di sotto del cuore e dissezionare tutti i vasi collegati con un unico taglio.

Assicurarsi di preservare una porzione sufficientemente ampia dell'aorta ascendente per la cannulazione con il dispositivo di Lor. Successivamente, trasferire immediatamente il cuore asportato in una piastra di Petri riempita di soluzione pre fredda e ghiaccio. In questa procedura, cannulare l'aorta con una cannula di acciaio da 1,8 French e prestare attenzione a evitare l'embolia aerea.

Successivamente, fissare l'aorta alla cannula con un punto di sutura chirurgico. Dopodiché, lavare le coronarie con un millilitro di Soluzione Uno. Collegare la cannula a un apparato langor per evitare un'estesa lesione da ischemia-riperfusione del miocardio.

Assicurarsi di eseguire le procedure dalla toracotomia alla cannullatura L endorf entro 120 secondi. Successivamente, dopo aver riempito in anticipo la bobina riscaldata del sistema L endorf con soluzione priva di calcio, due. Perfondere il cuore con 10 millilitri di questa soluzione a quattro millilitri al minuto.

Successivamente, perfondere il cuore con soluzione di collagenasi. Tre volte per otto minuti a quattro millilitri al minuto. Ora trasferire il cuore in una piastra Petri da 100 millimetri preriscaldata contenente soluzione a basso contenuto di calcio. Quattro.

Rimuovere con cura il tessuto aortico e gli altri tessuti non cardiaci utilizzando le forbici. Successivamente, separare atrii e ventricoli e mantenere i tessuti atriali e ventricolari immersi in una piccola quantità di soluzione. Quattro. Per isolare i cardiomiociti atriali, trasferire gli atrii in una piastra da coltura separata da 100 millimetri, precedentemente riscaldata.

Dissociare il tessuto separandolo delicatamente con pinzette fini e assicurarsi che il tessuto sia quasi completamente dissociato. Successivamente, utilizzare una pipetta da un millilitro con una punta di plastica ingrandita e levigata a fuoco per sospendere le cellule in un millilitro di soluzione. Quattro per cellule atriali e cinque millilitri di soluzione.

Quattro per le cellule ventricolari per cinque minuti. Successivamente, separare le cellule dai detriti utilizzando un filtro cellulare con dimensione della maglia di 200 micron. Centrifugare le cellule in soluzione quattro per un minuto per le cellule atriali e per due minuti per le cellule ventricolari a temperatura ambiente a 16 volte G in una cappa a flusso laminare, scartare il soprannatante e risospendere il pellet in cinque millilitri di soluzione.

Cinque per le cellule atriali e circa da 20 a 25 millilitri. Per le cellule ventricolari, agitare delicatamente il tubo per risospendere il pellet cellulare e centrifugare nuovamente per un minuto a temperatura ambiente a 16 × g; dopo la seconda centrifugazione, scartare il soprannatante e risospendere il pellet in cinque millilitri di soluzione. Sei per le cellule atriali e circa da 20 a 25 millilitri per le cellule ventricolari.

Quindi lasciare sedimentare le cellule per 10 minuti. In una cappa a flusso laminare, rimuovere il soprannatante, quindi procedere al conteggio delle cellule. Per studi di elettrofisiologia, aggiungere dalle 25 alle 50 millilitri di soluzione sei alle cellule per studi di elettrofisiologia.

Mantenere i miociti in soluzione sei in un tubo da 50 millilitri e inibire la sedimentazione. Per la colorazione immunofluorescente. Preparare una piastra per colture cellulari con coprislip di vetro rivestiti con soluzione di laminina a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro.

Incubare la piastra per colture cellulari con laminina in PBS per due ore a 37 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere la soluzione di laminina. Prima di seminare i miociti sotto microscopio, piastrare le cellule e controllare la densità cellulare.

Lasciare aderire i miociti al vetrino per un'ora a 37 gradi Celsius in un'atmosfera al 2% di CO2. Dopo un'ora, rimuovere la soluzione e iniziare immediatamente con il protocollo standard di colorazione. Quindi incubare i miociti con il fissativo.

Ad esempio, 4%PFA in PBS a pH 7,5 per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, eseguire tre lavaggi con PBS di cinque minuti ciascuno per permeabilizzare le cellule e inibire il legame aspecifico degli anticorpi. Incubare i miociti con 10% siero, 0,3% Triton, 0,2% BSA in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.

In seguito, incubarli con l'anticorpo primario per un'ora a 37 gradi Celsius e lavarli come descritto in precedenza. Successivamente, incubare con l'anticorpo secondario per un'ora a temperatura ambiente per controcolorare i nuclei e l'alfa-actinina. Incubare l'anticorpo secondario con DPI e phin coniugato con fluorocromo per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo il trasferimento del lavaggio, trasferire con attenzione le lamelle di vetro su vetrini microscopici trattati con soluzione salina. Quindi incorporare le cellule in un mezzo di montaggio fluorescente per registrazioni di whole cell patch clamp. Trasferire i cardiomiociti che appaiono sani nella camera di perfusione riempita con un volume definito di soluzione extracellulare da bagno.

Utilizzare l'apparecchiatura appropriata per la tecnica del patch clamp e pipette con resistenze comprese tra tre e cinque megaohm quando vengono riempite con soluzione intracellulare. Per le registrazioni standard con patch clamp, dopo aver effettuato il contatto con una cellula e aver stabilito un sigillo gigaohmico, utilizzare un protocollo standard per misurare le correnti del potassio, attivando le correnti esterne di potassio mediante un gradino di tensione di 4,5 secondi. Incrementare la tensione da meno 60 millivolt a 50 millivolt a passi di 10 millivolt. Assicurarsi che le correnti di perdita siano sempre inferiori a 100 picoampere.

Per differenziare le diverse correnti di potassio, utilizzare inibitori specifici come la 4-aminopiridina, l'hetereopodato, la toina o il tetraetilammonio. Le soluzioni madri devono essere preparate nella soluzione da bagno extracellulare e applicate direttamente nella zona più vicina possibile alla cellula tramite una micropunta. Dopo le registrazioni di baseline.

Si consiglia un'equilibratura di due o tre minuti prima di iniziare le registrazioni dopo l'applicazione del farmaco. Alla fine, analizzare i dati offline utilizzando il software P clamp 10.3 o un software comparabile. Questa figura mostra un cardiomiocita ventricolare esemplificativo colorato con DPI e LOR 4 88 Phin. Ecco di seguito i tracciati esemplificativi della registrazione con tecnica del patch clamp su cellula intera.

Questa figura mostra un esemplare di cardiomiocita atriale colorato con DPI e ficoeritrina coniugata con fluorocromo. Ecco di seguito i tracciati esemplificativi della registrazione mediante tecnica del patch clamp su cellula intera. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora e mezza, se effettuata correttamente. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione del metodo per isolare cardiomiociti atriali e ventricolari da topi geneticamente modificati.