Name: Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Impara a etichettare singoli neuroni nel sistema nervoso centrale di Drosophila melanogaster. Questa tecnica consente l'analisi della morfologia neuronale tramite microscopia confocale e luce trasmessa.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della DFG a GMT

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<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
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<li>Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+axon+pathfinding+in+the+Drosophilia+CNS%3A+a+time-lapse+study+of+an+identified+motorneuron%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron.</a> J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).</li>
<li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).</li>
<li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).</li>
<li>Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+grasshopper+to+Drosophila%3A+a+common+plan+for+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development.</a> Nature. 310, 203-207 (1984).</li>
<li>Whitington, P., Harris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+axonogenesis+in+the+embryo+of+a+primitive+insect%2C+the+silverfish+Ctenolepisma+longicaudata%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata.</a> Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).</li>
<li>Whitington, P., Meier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation%2C+neurogenesis+and+formation+of+early+axonal+pathways+in+the+centipede%2C+Ethmostigmus+rubripes+%28Brandt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt).</a> Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).</li>
<li>Whitington, P. M., Seifert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth+from+limb+motorneurons+in+the+locust+embryo%3A+the+effect+of+target+limb+removal+on+the+pattern+of+axon+branching+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery.</a> Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).</li>
<li>Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+change+in+neural+development+within+the+arthropods%3A+axonogenesis+in+the+embryos+of+two+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans.</a> Development. 118, 449-461 (1993).</li>
<li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Uno dei principali vantaggi di Drosophila come sistema modello è che permette l&#39;analisi di sviluppo e funzione del livello di singole cellule. Questo è particolarmente utile per quanto riguarda il sistema nervoso, in cui la diversità di tipi di cellule è eccezionalmente elevata e la funzione e la morfologia delle cellule vicine può essere totalmente differente. Il metodo qui presentiamo permette l&#39;etichettatura dei singoli neuroni con un colorante che può essere trasformato ...

La conoscenza della morfologia neuronale a livello delle singole celle è un presupposto fondamentale per la comprensione connettività neuronale e la funzione del SNC. Così, fin dai primi giorni di neuroscienze, i ricercatori hanno cercato di sviluppare singole tecniche di marcatura delle cellule (vedi 7 per una trattazione storica di questo numero). Metodi classici come colorazione di Golgi forniscono eccellente risoluzione di morfologia neuronale ma non sono adatti se si cerca di etichettare un particolare tipo di neurone in modo diretto, come colorazione avviene in modo casuale. Lo sviluppo di metodi per la colorazione di cellule singole mediante iniezione intracellulare o juxtacellular di coloranti da un microelettrodo affrontato l&#39;obbligo di etichettatura specifica. L&#39;applicazione di una singola iniezione di Drosophila neurone colorante rappresentato una sfida importante, a causa delle piccole dimensioni sia dell&#39;organismo e suoi neuroni. Tuttavia, la colorazione singolo neurone di embrionale Drosophila </em&gt; Neuroni è stato raggiunto a metà degli anni 1980 nel laboratorio di Corey Goodman 15. Mentre il metodo è stato eminentemente utile e ha fornito alcuni spunti importanti sui meccanismi per lo sviluppo neuronale in Drosophila nel corso degli ultimi 20-30 anni (ad esempio, 2, 10), molti lavoratori hanno evitato che, in gran parte a causa delle sue esigenze tecniche. La disponibilità in anni più recenti di tecniche genetiche per l&#39;etichettatura neuronale in Drosophila ha anche contribuito l&#39;impopolarità di singola iniezione colorante neurone. Espressione GAL4-diretto di membrana mirati costrutti GFP in grado di fornire un&#39;eccellente risoluzione della morfologia neurale 1, 20. Tuttavia, questo metodo ha alcune limitazioni: la spesso inevitabile espressione di GFP in cellule multiple possono oscurare la struttura dei singoli neuroni e una linea pilota GAL4 possono non essere disponibili per guidare l&#39;espressione in un neurone specifico di interesse. Il marcm (Analisi Mosaico con un addettoMarker ressible Cell) Metodo 8 può fornire etichettatura di ogni neurone essenzialmente a livello di cella singola, ma non può essere usato con successo nell&#39;embrione e larva presto a causa della lenta rotazione della proteina GAL80. Date queste limitazioni di etichettatura genetica, noi crediamo che una singola iniezione colorante neurone nell&#39;embrione Drosophila rimane una tecnica preziosa e merita una più ampia applicazione. Per promuovere questo obiettivo, forniamo qui una descrizione dettagliata del metodo. Un&#39;illustrazione della sua potenza è fornito dal nostro conto recente della morfologia del set completo di interneuroni in neuromeres addominali dell&#39;embrione ritardo Drosophila 14. Questo studio, che ha rivelato sia la variabilità morfologica dei singoli tipi di cellule neuronali e dei principi di organizzazione neuromere nel SNC dell&#39;embrione, non sarebbe stato possibile con qualsiasi altro metodo di etichettatura attualmente disponibile.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENTI </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 2-3 mg / ml in 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Probes Invitrogen / Molecular </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td> 1 mg / ml in etanolo </td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">Formaldeide</a> </td><td> Merck Millipore </td><td></td><td> 7,4% in PBS </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Glicerina </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 3783 </td><td> 70% in PBS </td></tr><tr><td> Eptano Colla </td><td> Beiersdorf AG </td><td> Cello 31-39-30 * </td><td> diluire ca. 1 a 1 con n-eptano </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1x </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ATTREZZATURE </td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Leica </td><td> TCS SP2 </td><td> per visualizzare e documentare labelings in fluorescenza </td></tr><tr><td> DC - unmplifier </td><td> Dragan Corporation </td><td> Cornerstone ION-100 </td><td> effettuare le labelings </td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 x 18 mm </td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24 x 60 mm </td></tr><tr><td> Dissezione Microscopio </td><td> Leica </td><td> MZ8 </td><td> per preparare e disect embrioni </td></tr><tr><td> Appartamento Capillari </td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td> diametro esterno 1 mm, spessore vetro 0,1 millimetri </td></tr><tr><td> Iniezione Capillari </td><td> Scienza Prodotti </td><td> GB 100 TF 8P </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipolatore R </td><td> Leica </td><td></td><td> effettuare le labelings </td></tr><tr><td> Modello P-97 </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td> per tirare capillari </td></tr><tr><td> Oggetto Slides </td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeld Superior</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio scientifico </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 2 mot </td><td> per visualizzare labelings dopo fotoconversione </td></tr><tr><td> Microscopio scientifico </td><td> Olimpo </td><td> BX50 </td><td> effettuare le labelings </td></tr><tr><td> Sony MC3255 Videocamera </td><td> Sony / AVT Horn </td><td> Sony MC3255 </td><td> registrare labelings dopo fotoconversione </td></tr></tbody></table> Tabella 1.

etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; drosophila melanogaster</em

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In questo articolo viene descritto come etichettare singolarmente i neuroni del sistema nervoso centrale dell&#39;embrione di Drosophila melanogaster mediante iniezione juxtacellular del DiI lipofilo fluorescente marker di membrana. Questo metodo permette la visualizzazione della morfologia delle cellule neuronali nei minimi dettagli. È possibile etichettare qualsiasi cella nel CNS: corpi cellulari dei neuroni bersaglio sono visualizzati sotto DIC ottiche o mediante espressione di un marcatore fluorescente genetico come GFP. Dopo etichettatura, la DiI può essere trasformato in un permanente macchia marrone da fotoconversione per permettere la visualizzazione della morfologia cellulare con luce trasmessa e ottica DIC. In alternativa, le cellule DiI-etichetta possono essere osservati direttamente con microscopia confocale, permettendo geneticamente introdotte proteine ​​reporter fluorescenti da colocalised. La tecnica può essere utilizzata in qualsiasi animale, indipendentemente dal genotipo, rendendo possibile analizzare fenotipi mutanti a risoluzione singola cella.

La figura 4 illustra i risultati tipici della tecnica, si descrive qui. Figura 4A illustra un esempio di una piena interneurone DiI singolo che è stato pulito photoconverted. Si dimostra in modo esauriente la quantità di dettagli questi offrono preparazioni. Se visto sotto ottiche DIC contesto spaziale della cella etichettata all&#39;interno del tessuto non marcato circostante diventa visibile, ad esempio, la posizione del corpo cellulare all&#39;interno della corteccia e della...

Presentiamo una tecnica per l&#39;etichettatura singoli neuroni nel sistema nervoso centrale (SNC)<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni, che consente l&#39;analisi della morfologia neuronale da una luce trasmessa o microscopia confocale.

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di marcare singoli neuroni nel sistema nervoso centrale di embrioni di drosofila allo stadio iniziale 17. Ciò si ottiene raccogliendo le uova e consentendo loro di svilupparsi al giusto stadio. Il secondo passo della procedura consiste nel clorare e allineare manualmente le uova.Seguendo questa diva, la colonizzazione e la limatura degli embrioni rende accessibile il midollo nervoso. Il passaggio finale consiste nell'etichettare le singole cellule mediante applicazione iono-retica dell'occhio del moncone lipofilo. In definitiva, i risultati consentono la visualizzazione della morfologia di un singolo neurone, se lo si desidera, nel contesto di modelli di espressione noti di GFP e/o in background mutante.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi di marcatura di singole cellule esistenti come il markum è che funziona nell'embrione e consente di visualizzare intenzionalmente le cellule identificate. La dimostrazione visiva di questo metodo è estremamente utile in quanto molti passaggi sono delicati e quindi difficili da imparare. Consentire ai moscerini sani di deporre gli embrioni su piastre di agar.Sostituire la pi

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Colorazione in immunofluorescenza del cervello di Drosophila per l'imaging di cellule gliali a singola cellula

Fonte: Inal, M. A. et. al., Tracciamento retrogrado di  Drosophila motoneuroni embrionali utilizzando coloranti fluorescenti lipofili. J. Vis. Exp. (2020)Questo video dimostra il metodo di marcatura retrograda dei motoneuroni  Drosophila utilizzando coloranti lipofili. Il colorante entra nell'assone, viaggia retrogradamente ed etichetta i neuroni in verde, consentendo una visualizzazione dettagliata della loro morfologia e delle proiezioni al microscopio confocale.

Marcatura retrograda dei motoneuroni di Drosophila utilizzando coloranti lipofili fluorescenti

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