Name: Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Impara a etichettare singoli neuroni nel sistema nervoso centrale di Drosophila melanogaster. Questa tecnica consente l'analisi della morfologia neuronale tramite microscopia confocale e luce trasmessa.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della DFG a GMT

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Uno dei principali vantaggi di Drosophila come sistema modello è che permette l&#39;analisi di sviluppo e funzione del livello di singole cellule. Questo è particolarmente utile per quanto riguarda il sistema nervoso, in cui la diversità di tipi di cellule è eccezionalmente elevata e la funzione e la morfologia delle cellule vicine può essere totalmente differente. Il metodo qui presentiamo permette l&#39;etichettatura dei singoli neuroni con un colorante che può essere trasformato ...

La conoscenza della morfologia neuronale a livello delle singole celle è un presupposto fondamentale per la comprensione connettività neuronale e la funzione del SNC. Così, fin dai primi giorni di neuroscienze, i ricercatori hanno cercato di sviluppare singole tecniche di marcatura delle cellule (vedi 7 per una trattazione storica di questo numero). Metodi classici come colorazione di Golgi forniscono eccellente risoluzione di morfologia neuronale ma non sono adatti se si cerca di etichettare un particolare tipo di neurone in modo diretto, come colorazione avviene in modo casuale. Lo sviluppo di metodi per la colorazione di cellule singole mediante iniezione intracellulare o juxtacellular di coloranti da un microelettrodo affrontato l&#39;obbligo di etichettatura specifica. L&#39;applicazione di una singola iniezione di Drosophila neurone colorante rappresentato una sfida importante, a causa delle piccole dimensioni sia dell&#39;organismo e suoi neuroni. Tuttavia, la colorazione singolo neurone di embrionale Drosophila </em&gt; Neuroni è stato raggiunto a metà degli anni 1980 nel laboratorio di Corey Goodman 15. Mentre il metodo è stato eminentemente utile e ha fornito alcuni spunti importanti sui meccanismi per lo sviluppo neuronale in Drosophila nel corso degli ultimi 20-30 anni (ad esempio, 2, 10), molti lavoratori hanno evitato che, in gran parte a causa delle sue esigenze tecniche. La disponibilità in anni più recenti di tecniche genetiche per l&#39;etichettatura neuronale in Drosophila ha anche contribuito l&#39;impopolarità di singola iniezione colorante neurone. Espressione GAL4-diretto di membrana mirati costrutti GFP in grado di fornire un&#39;eccellente risoluzione della morfologia neurale 1, 20. Tuttavia, questo metodo ha alcune limitazioni: la spesso inevitabile espressione di GFP in cellule multiple possono oscurare la struttura dei singoli neuroni e una linea pilota GAL4 possono non essere disponibili per guidare l&#39;espressione in un neurone specifico di interesse. Il marcm (Analisi Mosaico con un addettoMarker ressible Cell) Metodo 8 può fornire etichettatura di ogni neurone essenzialmente a livello di cella singola, ma non può essere usato con successo nell&#39;embrione e larva presto a causa della lenta rotazione della proteina GAL80. Date queste limitazioni di etichettatura genetica, noi crediamo che una singola iniezione colorante neurone nell&#39;embrione Drosophila rimane una tecnica preziosa e merita una più ampia applicazione. Per promuovere questo obiettivo, forniamo qui una descrizione dettagliata del metodo. Un&#39;illustrazione della sua potenza è fornito dal nostro conto recente della morfologia del set completo di interneuroni in neuromeres addominali dell&#39;embrione ritardo Drosophila 14. Questo studio, che ha rivelato sia la variabilità morfologica dei singoli tipi di cellule neuronali e dei principi di organizzazione neuromere nel SNC dell&#39;embrione, non sarebbe stato possibile con qualsiasi altro metodo di etichettatura attualmente disponibile.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENTI </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 2-3 mg / ml in 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Probes Invitrogen / Molecular </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td> 1 mg / ml in etanolo </td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">Formaldeide</a> </td><td> Merck Millipore </td><td></td><td> 7,4% in PBS </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Glicerina </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 3783 </td><td> 70% in PBS </td></tr><tr><td> Eptano Colla </td><td> Beiersdorf AG </td><td> Cello 31-39-30 * </td><td> diluire ca. 1 a 1 con n-eptano </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1x </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ATTREZZATURE </td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Leica </td><td> TCS SP2 </td><td> per visualizzare e documentare labelings in fluorescenza </td></tr><tr><td> DC - unmplifier </td><td> Dragan Corporation </td><td> Cornerstone ION-100 </td><td> effettuare le labelings </td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 x 18 mm </td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24 x 60 mm </td></tr><tr><td> Dissezione Microscopio </td><td> Leica </td><td> MZ8 </td><td> per preparare e disect embrioni </td></tr><tr><td> Appartamento Capillari </td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td> diametro esterno 1 mm, spessore vetro 0,1 millimetri </td></tr><tr><td> Iniezione Capillari </td><td> Scienza Prodotti </td><td> GB 100 TF 8P </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipolatore R </td><td> Leica </td><td></td><td> effettuare le labelings </td></tr><tr><td> Modello P-97 </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td> per tirare capillari </td></tr><tr><td> Oggetto Slides </td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeld Superior</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio scientifico </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 2 mot </td><td> per visualizzare labelings dopo fotoconversione </td></tr><tr><td> Microscopio scientifico </td><td> Olimpo </td><td> BX50 </td><td> effettuare le labelings </td></tr><tr><td> Sony MC3255 Videocamera </td><td> Sony / AVT Horn </td><td> Sony MC3255 </td><td> registrare labelings dopo fotoconversione </td></tr></tbody></table> Tabella 1.

etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; drosophila melanogaster</em

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In questo articolo viene descritto come etichettare singolarmente i neuroni del sistema nervoso centrale dell&#39;embrione di Drosophila melanogaster mediante iniezione juxtacellular del DiI lipofilo fluorescente marker di membrana. Questo metodo permette la visualizzazione della morfologia delle cellule neuronali nei minimi dettagli. È possibile etichettare qualsiasi cella nel CNS: corpi cellulari dei neuroni bersaglio sono visualizzati sotto DIC ottiche o mediante espressione di un marcatore fluorescente genetico come GFP. Dopo etichettatura, la DiI può essere trasformato in un permanente macchia marrone da fotoconversione per permettere la visualizzazione della morfologia cellulare con luce trasmessa e ottica DIC. In alternativa, le cellule DiI-etichetta possono essere osservati direttamente con microscopia confocale, permettendo geneticamente introdotte proteine ​​reporter fluorescenti da colocalised. La tecnica può essere utilizzata in qualsiasi animale, indipendentemente dal genotipo, rendendo possibile analizzare fenotipi mutanti a risoluzione singola cella.

La figura 4 illustra i risultati tipici della tecnica, si descrive qui. Figura 4A illustra un esempio di una piena interneurone DiI singolo che è stato pulito photoconverted. Si dimostra in modo esauriente la quantità di dettagli questi offrono preparazioni. Se visto sotto ottiche DIC contesto spaziale della cella etichettata all&#39;interno del tessuto non marcato circostante diventa visibile, ad esempio, la posizione del corpo cellulare all&#39;interno della corteccia e della...

Presentiamo una tecnica per l&#39;etichettatura singoli neuroni nel sistema nervoso centrale (SNC)<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni, che consente l&#39;analisi della morfologia neuronale da una luce trasmessa o microscopia confocale.

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di marcare singoli neuroni nel sistema nervoso centrale di embrioni di drosofila allo stadio iniziale 17. Ciò si ottiene raccogliendo le uova e consentendo loro di svilupparsi al giusto stadio. Il secondo passo della procedura consiste nel clorare e allineare manualmente le uova.Seguendo questa diva, la colonizzazione e la limatura degli embrioni rende accessibile il midollo nervoso. Il passaggio finale consiste nell'etichettare le singole cellule mediante applicazione iono-retica dell'occhio del moncone lipofilo. In definitiva, i risultati consentono la visualizzazione della morfologia di un singolo neurone, se lo si desidera, nel contesto di modelli di espressione noti di GFP e/o in background mutante.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi di marcatura di singole cellule esistenti come il markum è che funziona nell'embrione e consente di visualizzare intenzionalmente le cellule identificate. La dimostrazione visiva di questo metodo è estremamente utile in quanto molti passaggi sono delicati e quindi difficili da imparare. Consentire ai moscerini sani di deporre gli embrioni su piastre di agar.Sostituire la piastra ogni un'ora e mezza a 25 gradi Celsius e conservare gli embrioni. Incubare gli embrioni sulle loro piastre a 25 o 18 gradi Celsius fino a raggiungere lo stadio di sviluppo richiesto. Quando sono pronti, trasferisci gli embrioni su un vetrino coperto con nastro biadesivo.Evitare di trasferire qualsiasi agar con gli embrioni in quanto interferirebbe con la loro adesione al nastro. Sul nastro. Lascia asciugare gli embrioni per 5-10 minuti durante l'attesa.Rivestire un vetrino coprioggetti da 24 millimetri per 60 millimetri con colla eptanica. Posizionare una piccola goccia di colla al centro del vetrino e stenderla in una pellicola molto sottile utilizzando un vetrino coprioggetti quadrato da 18 millimetri. Una volta che gli embrioni si sono asciugati, toccali delicatamente con un ago.Il corion si aprirà e l'embrione si attaccherà all'ago. Trasferire immediatamente gli embrioni declorati in un blocco di agar per evitare che si secchino. Allineali lì 10 di fila, con i lati ventrali rivolti verso l'alto.Tagliare l'agar in eccesso dal blocco con un bisturi. Quindi toccare delicatamente gli embrioni con il vetrino coprioggetti rivestito di colla eptanica. Dovrebbero aderire al vetrino coprioggetti con il lato ventrale rivolto verso il basso.Applicare una cornice di nastro adesivo attorno al vetrino coprioggetto e fissarlo a un vetrino da microscopio. Mantenere gli embrioni sopra il vetrino coprioggetti. Copri gli embrioni con generose quantità di PBS sul lato dorsale di ogni embrione vicino alla sua estremità posteriore.Penetrare la membrana del vitel con un ago di vetro, aprire la membrana lungo la linea mediana dorsale e trascinare l'embrione fuori dalla membrana. Ora riorienta l'embrione con il lato ventrale rivolto verso il basso altrove sul substrato di colla di eptano. Lima l'embrione con un ago di vetro perforando delicatamente la parete del corpo e strappandolo lungo la linea mediana dorsale.Usando l'ago, spingere verso il basso la parete del corpo in modo che aderisca al vetrino. Strappa l'intestino alle sue estremità anteriore e posteriore e solleva l'intestino via. Poiché diversi embrioni verranno archiviati sullo stesso vetrino, è utile essere molto precisi con il loro orientamento o fare un disegno del loro orientamento.Successivamente, gli embrioni possono essere leggermente fissati per 10-15 minuti in formaldeide al 7,4% in PBS seguiti da quattro lavaggi in PBS con estrema attenzione per evitare di toccare gli embrioni con la superficie della soluzione. Le forze di tensione superficiale li distruggeranno sotto un obiettivo 10x. Centrare il campo visivo su un embrione preparato, aumentare l'ingrandimento e localizzare la cellula di interesse sotto ottica DIC o sotto fluorescenza.Se la cellula bersaglio esprime GFP, assicurarsi che il diaframma di campo del microscopio sia aperto appena fino al bordo del campo visivo, non oltre un'illuminazione stretta. Il fascio aiuterà il posizionamento della micropipetta, il ritorno all'obiettivo 10 x e il posizionamento dell'elettrodo da bagno per l'amplificatore CC nella soluzione lontana dall'embrione e dal percorso della micropipetta. Montare la micropipetta di iniezione riempita con soluzione di cloruro di litio sul supporto e fissarla al micromanipolatore.Utilizzando i controlli di percorso, posizionare la micropipetta sotto l'obiettivo e ben al di sopra dell'embrione. Se l'angolo del micro peppe è troppo ripido, la punta non verrà messa a fuoco. Se è troppo poco profondo, l'asta si sporcherà contro la parete del bagno al centro della punta nel campo visivo.Ora abbassate la micropipetta e mettete a fuoco alternativamente fino a quando la pipetta non si trova nel PBS e non troppo al di sopra dell'embrione. Ora passa all'obiettivo ad alta potenza e centra la pipetta all'interno del campo visivo. Quando lo stelo è a fuoco, spostare la micropipetta sull'asse X fino a quando la punta non si trova al centro del campo visivo.La punta della micropipetta deve essere ben al di sopra del livello dell'embrione. Passa all'illuminazione a fluorescenza ed esamina la punta. Verificare la presenza di perdite dall'occhio del colorante.Regolare la corrente CC in modo che il cristallo dell'occhio di tintura non si accumuli sulla punta. Ora abbassa la micropipetta sull'asse Z verso l'embrione. Regolare progressivamente la messa a fuoco man mano che l'embrione viene messo a fuoco.Passare all'utilizzo del controllo fine. Focalizzare la cellula da iniettare al centro del campo e poi rifocalizzare il puntale della micropipetta. Da questo punto in poi, potrebbe essere più conveniente utilizzare il controllo tavolino del microscopio per spostare l'embrione rispetto alla micropipetta.Portare la punta della micropipetta a contatto con la cellula e praticare una depressione sulla sua superficie. Passa diversi nano ampere di corrente depolarizzante per alcuni secondi. Un piccolo cristallo di occhio colorante si formerà sulla cellula per confermare che la cellula è stata etichettata.Aprire brevemente l'otturatore per illuminare il campo con luce fluorescente. Se il corpo della cella mostra segni di etichettatura, applicare corrente per diversi secondi. Quindi spegnere la corrente ed estrarre rapidamente l'embrione dalla micropipetta utilizzando i comandi del tavolino.Se non era evidente l'etichettatura D eye, la micropipetta potrebbe essere stata bloccata e deve essere sostituita. Se la punta della pipetta si impiglia in altri tessuti dalla radice alla cellula e macchia quel tessuto, provare a ritirare leggermente la micropipetta e riavvicinarsi alla cellula prima di ricorrere alla sostituzione della micropipetta secondo necessità. Continuare a marcare altre cellule nello stesso embrione o in altri embrioni sullo stesso vetrino.Spostare la punta sul bordo del campo visivo e ripetere la procedura. Rimuovere la maggior parte della soluzione nella camera di iniezione. Quindi fissare gli embrioni aggiungendo il 7,4% di formaldeide PBS per 10 minuti, seguito da quattro lavaggi con PBS.La preparazione può ora essere fotoconvertita o montata per la microscopia confocale utilizzando il protocollo delineato. Un interneurone riempito di dai è stato fotoconvertito in modo impeccabile sotto ottica DIC. Il contesto spaziale della cellula marcata all'interno del tessuto circostante non marcato è stato ben risolto.Ad esempio, le posizioni del corpo cellulare all'interno della corteccia e della proiezione delle fibre all'interno della pillola neurologica potrebbero essere entrambe viste in questa preparazione. La goccia di colorante era un po' troppo grande. Diverse cellule vicine sono state marcate contemporaneamente, il che rende difficile mettere in relazione le singole proiezioni con corpi cellulari distinti.Si noti inoltre che al microscopio a fluorescenza, la risoluzione dello sfondo è molto più bassa senza conversione delle foto. In questo preparato possono essere iniettate anche più cellule nei segmenti vicini, un anticorpo contro due macchie veloci di fales nella pillola neuro. Nonostante i corpi cellulari chiari, la preparazione mostra un possibile effetto collaterale di periodi prolungati di fotoconversione.Le cellule marcate più intensamente tendono a macchiarsi eccessivamente e iniziano a gonfiarsi rispetto all'etichettatura di una singola cellula con ottica confocale. La marcatura oculare del colorante negli embrioni che trasportano costrutti reporter GFP può fornire il contesto spaziale e l'identità della cellula riempita di D all'interno di specifiche popolazioni di tipi di cellule neuronali o gliali GFP positive. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare ed eseguire l'etichettatura di singoli neuroni nel SNC embrionale dopo l'oph.Ma mentre tenti questa procedura, tieni presente che ogni singolo passaggio è impegnativo, quindi aspettati un paio di ripetizioni fino a quando l'intera procedura non si svolge senza intoppi.

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Questo video mostra la colorazione in immunofluorescenza di un cervello di Drosophila transgenico per l'imaging di cellule gliali su singola cellula. Il cervello esprime proteine mirate alla membrana fuse con diverse combinazioni di epitopi antigenici sotto il controllo di un sistema ricombinasi gliale-specifico. I cervelli isolati e fissati vengono colorati con anticorpi primari specifici per gli epitopi antigenici, seguiti da anticorpi secondari coniugati con fluorofori. Questa etichettatura...

Colorazione in immunofluorescenza del cervello di Drosophila per l'imaging di cellule gliali a singola cellula

Fonte: Inal, M. A. et. al., Tracciamento retrogrado di  Drosophila motoneuroni embrionali utilizzando coloranti fluorescenti lipofili. J. Vis. Exp. (2020)Questo video dimostra il metodo di marcatura retrograda dei motoneuroni  Drosophila utilizzando coloranti lipofili. Il colorante entra nell'assone, viaggia retrogradamente ed etichetta i neuroni in verde, consentendo una visualizzazione dettagliata della loro morfologia e delle proiezioni al microscopio confocale.

Marcatura retrograda dei motoneuroni di Drosophila utilizzando coloranti lipofili fluorescenti

Dettagli Questo protocollo un metodo semplificato utilizzato per condurre cellule vive nel contesto di un cervello larvale intatto. Approcci di imaging cellulare dal vivo hanno un valore inestimabile per lo studio delle divisioni asimmetriche di cellule staminali neurali così come altri processi neurogena e di sviluppo, in coerenza scoprendo i meccanismi che sono stati precedentemente trascurato.

Immagini dal vivo di<em&gt; Drosophila</em&gt; larvali neuroblasti

Questo protocollo descrive la dissezione e immunostaining del adulto Drosophila melanogaster tessuti del cervello. In particolare, questo protocollo evidenzia l'uso di Drosophila fungo del fotoricettore e corpo neuroni come sottoinsiemi di un neurone di esempio che possono essere utilizzati con precisione per scoprire i principi generali alla base di molti aspetti dello sviluppo neuronale.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Le cellule visualizzare diverse morfologie e stabilire una serie di interazioni con i loro vicini. Questo protocollo descrive come per rivelare la morfologia delle singole cellule e per indagare l'interazione cellula-cellula utilizzando il sistema di espressione Gal4/UAS ben consolidato.

Applicazione di MultiColor FlpOut tecnica per studiare ad alta risoluzione singola cella morfologie e interazioni delle cellule della Glia in Drosophila

Questo protocollo descrive un metodo per registrare l'attività elettrica discendente del sistema nervoso centrale Drosophila melanogaster per abilitare il costo-efficiente e conveniente test degli agenti farmacologici, mutazioni genetiche delle proteine neuronali, e/o il ruolo di inesplorate vie fisiologiche.

Registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster

L'analisi del ciclo cellulare con etichettatura 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) e fosfo-istone H3 (pH3) è una procedura in più fasi che può richiedere un'ampia ottimizzazione. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che descrive tutti i passaggi per questa procedura, compresa l'analisi e la quantificazione delle immagini per distinguere le cellule in diverse fasi del ciclo cellulare.

Protocollo a doppia marcatura 5-etinil-2'-deossiuridina/fosfo-istone H3 per l'analisi della progressione del ciclo cellulare nelle cellule staminali neurali della drosofila

Questo articolo descrive un protocollo efficiente di dissezione immaginale del disco e colorazione degli anticorpi, economico con i reagenti e facilita la gestione di dischi immaginari in piccole quantità.

Dissezione su piccola scala e colorazione di anticorpi dei dischi immaginari occhio-antenna e alare da Drosophila melanogaster

Impara a etichettare singoli neuroni nel sistema nervoso centrale di Drosophila melanogaster. Questa tecnica consente l'analisi della morfologia neuronale tramite microscopia confocale e luce trasmessa.

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di

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