Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di Drosophila melanogaster

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di marcare singoli neuroni nel sistema nervoso centrale di embrioni di drosofila allo stadio iniziale 17. Ciò si ottiene raccogliendo le uova e consentendo loro di svilupparsi al giusto stadio. Il secondo passo della procedura consiste nel clorare e allineare manualmente le uova.

Seguendo questa diva, la colonizzazione e la limatura degli embrioni rende accessibile il midollo nervoso. Il passaggio finale consiste nell'etichettare le singole cellule mediante applicazione iono-retica dell'occhio del moncone lipofilo. In definitiva, i risultati consentono la visualizzazione della morfologia di un singolo neurone, se lo si desidera, nel contesto di modelli di espressione noti di GFP e/o in background mutante.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi di marcatura di singole cellule esistenti come il markum è che funziona nell'embrione e consente di visualizzare intenzionalmente le cellule identificate. La dimostrazione visiva di questo metodo è estremamente utile in quanto molti passaggi sono delicati e quindi difficili da imparare. Consentire ai moscerini sani di deporre gli embrioni su piastre di agar.

Sostituire la piastra ogni un'ora e mezza a 25 gradi Celsius e conservare gli embrioni. Incubare gli embrioni sulle loro piastre a 25 o 18 gradi Celsius fino a raggiungere lo stadio di sviluppo richiesto. Quando sono pronti, trasferisci gli embrioni su un vetrino coperto con nastro biadesivo.

Evitare di trasferire qualsiasi agar con gli embrioni in quanto interferirebbe con la loro adesione al nastro. Sul nastro. Lascia asciugare gli embrioni per 5-10 minuti durante l'attesa.

Rivestire un vetrino coprioggetti da 24 millimetri per 60 millimetri con colla eptanica. Posizionare una piccola goccia di colla al centro del vetrino e stenderla in una pellicola molto sottile utilizzando un vetrino coprioggetti quadrato da 18 millimetri. Una volta che gli embrioni si sono asciugati, toccali delicatamente con un ago.

Il corion si aprirà e l'embrione si attaccherà all'ago. Trasferire immediatamente gli embrioni declorati in un blocco di agar per evitare che si secchino. Allineali lì 10 di fila, con i lati ventrali rivolti verso l'alto.

Tagliare l'agar in eccesso dal blocco con un bisturi. Quindi toccare delicatamente gli embrioni con il vetrino coprioggetti rivestito di colla eptanica. Dovrebbero aderire al vetrino coprioggetti con il lato ventrale rivolto verso il basso.

Applicare una cornice di nastro adesivo attorno al vetrino coprioggetto e fissarlo a un vetrino da microscopio. Mantenere gli embrioni sopra il vetrino coprioggetti. Copri gli embrioni con generose quantità di PBS sul lato dorsale di ogni embrione vicino alla sua estremità posteriore.

Penetrare la membrana del vitel con un ago di vetro, aprire la membrana lungo la linea mediana dorsale e trascinare l'embrione fuori dalla membrana. Ora riorienta l'embrione con il lato ventrale rivolto verso il basso altrove sul substrato di colla di eptano. Lima l'embrione con un ago di vetro perforando delicatamente la parete del corpo e strappandolo lungo la linea mediana dorsale.

Usando l'ago, spingere verso il basso la parete del corpo in modo che aderisca al vetrino. Strappa l'intestino alle sue estremità anteriore e posteriore e solleva l'intestino via. Poiché diversi embrioni verranno archiviati sullo stesso vetrino, è utile essere molto precisi con il loro orientamento o fare un disegno del loro orientamento.

Successivamente, gli embrioni possono essere leggermente fissati per 10-15 minuti in formaldeide al 7,4% in PBS seguiti da quattro lavaggi in PBS con estrema attenzione per evitare di toccare gli embrioni con la superficie della soluzione. Le forze di tensione superficiale li distruggeranno sotto un obiettivo 10x. Centrare il campo visivo su un embrione preparato, aumentare l'ingrandimento e localizzare la cellula di interesse sotto ottica DIC o sotto fluorescenza.

Se la cellula bersaglio esprime GFP, assicurarsi che il diaframma di campo del microscopio sia aperto appena fino al bordo del campo visivo, non oltre un'illuminazione stretta. Il fascio aiuterà il posizionamento della micropipetta, il ritorno all'obiettivo 10 x e il posizionamento dell'elettrodo da bagno per l'amplificatore CC nella soluzione lontana dall'embrione e dal percorso della micropipetta. Montare la micropipetta di iniezione riempita con soluzione di cloruro di litio sul supporto e fissarla al micromanipolatore.

Utilizzando i controlli di percorso, posizionare la micropipetta sotto l'obiettivo e ben al di sopra dell'embrione. Se l'angolo del micro peppe è troppo ripido, la punta non verrà messa a fuoco. Se è troppo poco profondo, l'asta si sporcherà contro la parete del bagno al centro della punta nel campo visivo.

Ora abbassate la micropipetta e mettete a fuoco alternativamente fino a quando la pipetta non si trova nel PBS e non troppo al di sopra dell'embrione. Ora passa all'obiettivo ad alta potenza e centra la pipetta all'interno del campo visivo. Quando lo stelo è a fuoco, spostare la micropipetta sull'asse X fino a quando la punta non si trova al centro del campo visivo.

La punta della micropipetta deve essere ben al di sopra del livello dell'embrione. Passa all'illuminazione a fluorescenza ed esamina la punta. Verificare la presenza di perdite dall'occhio del colorante.

Regolare la corrente CC in modo che il cristallo dell'occhio di tintura non si accumuli sulla punta. Ora abbassa la micropipetta sull'asse Z verso l'embrione. Regolare progressivamente la messa a fuoco man mano che l'embrione viene messo a fuoco.

Passare all'utilizzo del controllo fine. Focalizzare la cellula da iniettare al centro del campo e poi rifocalizzare il puntale della micropipetta. Da questo punto in poi, potrebbe essere più conveniente utilizzare il controllo tavolino del microscopio per spostare l'embrione rispetto alla micropipetta.

Portare la punta della micropipetta a contatto con la cellula e praticare una depressione sulla sua superficie. Passa diversi nano ampere di corrente depolarizzante per alcuni secondi. Un piccolo cristallo di occhio colorante si formerà sulla cellula per confermare che la cellula è stata etichettata.

Aprire brevemente l'otturatore per illuminare il campo con luce fluorescente. Se il corpo della cella mostra segni di etichettatura, applicare corrente per diversi secondi. Quindi spegnere la corrente ed estrarre rapidamente l'embrione dalla micropipetta utilizzando i comandi del tavolino.

Se non era evidente l'etichettatura D eye, la micropipetta potrebbe essere stata bloccata e deve essere sostituita. Se la punta della pipetta si impiglia in altri tessuti dalla radice alla cellula e macchia quel tessuto, provare a ritirare leggermente la micropipetta e riavvicinarsi alla cellula prima di ricorrere alla sostituzione della micropipetta secondo necessità. Continuare a marcare altre cellule nello stesso embrione o in altri embrioni sullo stesso vetrino.

Spostare la punta sul bordo del campo visivo e ripetere la procedura. Rimuovere la maggior parte della soluzione nella camera di iniezione. Quindi fissare gli embrioni aggiungendo il 7,4% di formaldeide PBS per 10 minuti, seguito da quattro lavaggi con PBS.

La preparazione può ora essere fotoconvertita o montata per la microscopia confocale utilizzando il protocollo delineato. Un interneurone riempito di dai è stato fotoconvertito in modo impeccabile sotto ottica DIC. Il contesto spaziale della cellula marcata all'interno del tessuto circostante non marcato è stato ben risolto.

Ad esempio, le posizioni del corpo cellulare all'interno della corteccia e della proiezione delle fibre all'interno della pillola neurologica potrebbero essere entrambe viste in questa preparazione. La goccia di colorante era un po' troppo grande. Diverse cellule vicine sono state marcate contemporaneamente, il che rende difficile mettere in relazione le singole proiezioni con corpi cellulari distinti.

Si noti inoltre che al microscopio a fluorescenza, la risoluzione dello sfondo è molto più bassa senza conversione delle foto. In questo preparato possono essere iniettate anche più cellule nei segmenti vicini, un anticorpo contro due macchie veloci di fales nella pillola neuro. Nonostante i corpi cellulari chiari, la preparazione mostra un possibile effetto collaterale di periodi prolungati di fotoconversione.

Le cellule marcate più intensamente tendono a macchiarsi eccessivamente e iniziano a gonfiarsi rispetto all'etichettatura di una singola cellula con ottica confocale. La marcatura oculare del colorante negli embrioni che trasportano costrutti reporter GFP può fornire il contesto spaziale e l'identità della cellula riempita di D all'interno di specifiche popolazioni di tipi di cellule neuronali o gliali GFP positive. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare ed eseguire l'etichettatura di singoli neuroni nel SNC embrionale dopo l'oph.

Ma mentre tenti questa procedura, tieni presente che ogni singolo passaggio è impegnativo, quindi aspettati un paio di ripetizioni fino a quando l'intera procedura non si svolge senza intoppi.