Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso
18 agosto 2013
Qui si descrive un metodo efficace per lo studio delle dinamiche di gioco cellulare per apoptosi In vivo. Questo metodo impiega vivere Drosophila Embrioni come un potente modello per il monitoraggio fagocitosi delle cellule apoptotiche mediante etichettatura specifica delle cellule apoptotiche e fagociti.
L'obiettivo generale di questa procedura è seguire la dinamica della rimozione delle cellule apoptotiche nell'embrione di drosophila. Questo viene ottenuto utilizzando moscerini transgenici contenenti un marcatore GFP citoplasmatico, che etichetta le popolazioni di cellule fagocitiche. Gli embrioni con il marcatore GFP Simio vengono raccolti, lavati e ricoperti. Successivamente, gli embrioni vengono posizionati per l'iniezione, seguita dal monitoraggio del sistema nervoso centrale.
Il terzo passaggio consiste nell'etichettatura delle cellule apoptotiche mediante iniezione negli embrioni di marcatori specifici per la fagocitosi dell'apoptosi, come un X su cinque; l'ultimo passaggio prevede la registrazione in time-lapse del sistema nervoso centrale embrionale mediante microscopia confocale. In definitiva, i risultati possono mostrare la localizzazione e il comportamento delle cellule apoptotiche e dei fagociti durante le diverse fasi della rimozione delle cellule apoptotiche attraverso la microscopia confocale a fluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'immunohistochimica su embrioni fissati, è la possibilità di seguire la dinamica della rimozione delle cellule apoptotiche.
La rimozione delle cellule apoptotiche è un processo altamente dinamico che comprende diverse fasi. Questa tecnica consente di seguire le diverse fasi utilizzando marcatori specifici per le cellule apoptotiche e per i fagociti. Il protocollo inizia con la preparazione di una colla a partire da reagenti comuni: srotolare un nastro adesivo doppia faccia, quindi arrotolarlo nuovamente per adattarlo a un vial per scintillazione.
Riempire il vial con eptano e sigillarlo con parafilm. Quindi fissare il vial a un agitatore meccanico e agitarlo delicatamente per 24 ore. A temperatura ambiente, il giorno successivo la colla preparata viene trasferita in un nuovo vial.
Utilizzare una pipetta in vetro PE per trasferire la colla preparata in un nuovo contenitore. Una volta pronta, utilizzare la punta della pipetta per applicare la colla sui vetrini. Disperdere una goccia di colla a base di eptano lungo una linea al centro del vetrino.
Lasciare asciugare la colla per alcuni secondi. I vetrini coprioggetto possono quindi essere conservati a temperatura ambiente in una scatola chiusa per un massimo di un mese dopo aver anestetizzato le mosche con anidride carbonica. Raccogliere circa 400 mosche in un contenitore con una piastra riscaldata di succo d'uva, sostituita a 25 gradi Celsius per due ore. Prelevare la piastra di deposizione del succo d'uva e coprire il contenitore con una nuova piastra per mantenere le mosche in buone condizioni.
La piastra raccolta contiene embrioni di età compresa tra zero e due ore. Riposizionare la piastra con il succo d'uva e gli embrioni in un incubatore a 25 gradi Celsius fino al raggiungimento del punto temporale di sviluppo desiderato. In questo esempio, gli embrioni vengono incubati tra 10 e 12 ore, in modo che si sviluppino fino allo stadio 15 o 16 dopo aver completato lo sviluppo.
Utilizzare acqua del rubinetto e un pennello pulito per trasferire gli embrioni dalla piastra a un colino per cellule. Mantenere il colino sopra un contenitore in modo da poter recuperare eventuali embrioni fuoriusciti. Risciacquare gli embrioni raccolti fino a quando tutta la pasta di lievito non viene rimossa.
Quindi asciugare l'acqua in eccesso pulendo l'esterno del setaccio. Posizionare il setaccio cellulare in una piastra di Petri pulita per rimuovere completamente il corione. Aggiungere candeggina al 50% per coprire gli embrioni nel setaccio cellulare e attendere due minuti, mescolandoli due o tre volte.
Successivamente, risciacquare gli embrioni fino a quando non avranno più odore di candeggina. Posizionare gli embrioni nel contenitore cellulare in una piastra di Petri pulita e coprirli con acqua per evitare che si secchino. Per l'iniezione degli embrioni.
Preparare in anticipo gli aghi per iniezione utilizzando un estrattore di aghi e filamenti di vetro sottili. Caricare un microlitro del reagente desiderato in due aghi, utilizzandone uno come riserva. Un marcatore stabile che non si decolora facilmente, come una X in cinque, rappresenta un buon reagente.
Ora posizionare un pezzo rettangolare di agar al succo d'uva su un vetrino. Trasferire gli embrioni dal setaccio all'agar. Utilizzando un pennello pulito sotto un microscopio stereoscopico a fluorescenza, selezionare gli embrioni allo stadio corretto per l'iniezione mediante il marcatore GFP.
Utilizzando un pennello umido, spostare gli embrioni selezionati in una fila di 10 con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Posizionare la fila sul bordo del blocco di agarosio. La GFP può essere osservata nel sistema nervoso centrale dell'embrione.
Ora attacca gli embrioni a un coprioggetto utilizzando una striscia di colla a base di eptano. La posizione corretta degli embrioni è molto importante per il successo dell'iniezione. Prenditi il tempo necessario e assicurati che gli embrioni siano allineati con precisione nell'orientamento appropriato.
Successivamente, posizionare il vetrino coprioggetto nella camera di disidratazione per circa cinque minuti. Dopo aver asciugato gli embrioni, coprirli con olio al carbonio Hello 700 per evitare ulteriore disidratazione. Infine, posizionare una goccia d'acqua su un vetrino da microscopio.
Quindi posizionare il lembo del coperchio con gli embrioni rivolto verso l'alto su un vetrino umido. Gli embrioni sono ora pronti per l'iniezione. Iniziare collegando un ago a un micromanipolatore e alla pompa pico.
La pompa controlla la quantità di liquido iniettato spingendo azoto nell'ago. Un pedale controlla l'emissione regolata dell'azoto sotto il microscopio. Concentrarsi sulla punta dell'ago e posizionarla vicino al bordo del vetrino coprioggetto, con la punta dell'ago e il vetrino coprioggetto messi a fuoco con grande attenzione.
Spostare il coprioggetto finché non tocca la punta dell'ago e lo spezza. Il diametro dell'apertura dovrebbe essere compreso tra mezzo e due micrometri. Ora mettere a fuoco gli embrioni.
Portare l'ago nell'olio. Se la punta dell'ago è stata rotta correttamente, dovrebbe esserci una goccia di liquido che fuoriesce nell'olio. Quando si preme il pedale senza toccare il portaago, spostare la piastra in modo che il bordo laterale dell'embrione venga perforato dall'ago.
Iniettare rapidamente una goccia di soluzione nell'embrione. Spostare l'embrione e passare al successivo fino a quando non sono stati iniettati tutti e 10 gli embrioni. Acquisire le immagini degli embrioni mediante microscopio confocale invertito con un obiettivo da 40 x o 100 x.
Cercare un embrione ben posizionato con il sistema nervoso centrale al centro, che mostri una forte espressione di GFP e una marcatura delle cellule apoptotiche. Per effettuare registrazioni in time-lapse, selezionare cinque o sei sezioni confocali da fissare micronicamente in queste posizioni. Eseguire una scansione ogni 60 secondi, un intervallo a cui lo sbiancamento del GFP non dovrebbe rappresentare un problema.
Successivamente, effettuare una proiezione di tre sezioni con uno spessore di sei micron per osservare completamente le cellule. In alcuni casi, un embrione potrebbe iniziare a ruotare durante la registrazione video. Pertanto, monitorare attentamente la registrazione per evitare spreco di tempo con embrioni in movimento.
Un embrione allo stadio 15 correttamente posizionato mostra il sistema nervoso centrale embrionale al centro, con cellule gliali ben evidenziate marcate da una M, che rappresenta i macrofagi g, localizzati principalmente al di fuori del SNC. Espressione marcata di GFP nel citoplasma. Anche le cellule ectodermiche E sono etichettate con GFP citoplasmatico.
Questi fotogrammi mostrano cellule apoptotiche marcate con un ex in five ed ectoderma e macrofagi marcati con GFP citoplasmatico. Ogni fotogramma è una proiezione di tre sezioni, ciascuna spessa due micron. Molte cellule positive per ex in five si trovano all'interno e all'esterno del SNC.
L'evento evidenziato mostra una cellula gliale che ingloba una particella apoptotica. Si noti il comportamento esplorativo della cellula gliale. Essa tocca la particella apoptotica alcune volte prima di impegnarsi nell'inglobamento della cellula apoptotica dopo il suo sviluppo.
La tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della rimozione delle cellule apoptotiche per esplorare la fagocitosi delle cellule apoptotiche durante lo sviluppo. Utilizzando questa tecnica, possiamo esplorare il comportamento altamente dinamico della rimozione delle cellule apoptotiche.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per lo studio della dinamica della rimozione delle cellule apoptotiche in vivo mediante l'uso di embrioni di Drosophila. La tecnica consente il monitoraggio in tempo reale della fagocitosi delle cellule apoptotiche attraverso un'etichettatura specifica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- La rimozione delle cellule apoptotiche è fondamentale per l'omeostasi dei tessuti.
- Gli embrioni di Drosophila costituiscono un modello efficace per lo studio di questo processo.
- Metodi tradizionali come l'immunohistochimica non permettono un'osservazione dinamica.
- Le tecniche di imaging in tempo reale possono fornire informazioni sulle interazioni cellulari durante il processo di rimozione.
Scopo dello studio
- Seguire la dinamica della rimozione delle cellule apoptotiche negli embrioni di Drosophila.
- Visualizzare il comportamento dei fagociti e delle cellule apoptotiche.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi coinvolti nella fagocitosi.
Metodi Utilizzati
- Si utilizzano Drosophila transgeniche con marcatori GFP citoplasmatici.
- Gli embrioni vengono raccolti, lavati e preparati per l'iniezione.
- Specifici marcatori per le cellule apoptotiche vengono iniettati negli embrioni.
- Vengono effettuate registrazioni a intervalli di tempo del sistema nervoso centrale embrionale mediante microscopia confocale.
Risultati principali
- L'imaging in tempo reale rivela il posizionamento delle cellule apoptotiche.
- Il comportamento dei fagociti può essere monitorato durante le diverse fasi di eliminazione.
- Il metodo mostra vantaggi rispetto all'analisi dei tessuti fissati.
- I risultati contribuiscono a una migliore comprensione dei processi apoptotici.
Conclusioni
- Il metodo descritto consente l'osservazione dinamica della rimozione delle cellule apoptotiche.
- L'analisi in tempo reale fornisce informazioni che i metodi su campioni fissati non possono offrire.
- Questo approccio può migliorare la ricerca in biologia cellulare e nei processi dello sviluppo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
L'analisi in tempo reale dell'eliminazione delle cellule apoptotiche negli embrioni di Drosophila fornisce un modello dinamico per lo studio dei meccanismi di fagocitosi rilevanti per la validazione degli bersagli in immunologia e oncologia. Il metodo consente una riduzione del rischio meccanicistica attraverso la visualizzazione in tempo reale delle interazioni tra cellule apoptotiche e fagociti, sostenendo una maggiore affidabilità predittiva nella fase iniziale della scoperta. Questo approccio facilita l'identificazione e la priorizzazione di bersagli coinvolti nei percorsi di morte cellulare ed eliminazione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative ai percorsi di segnalazione fagocitica e di morte cellulare.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale del bersaglio mediante la visualizzazione dell'interazione tra fagociti e cellule apoptotiche in un sistema vivente.
- Valore predittivo: Migliora la riduzione del rischio meccanicistica attraverso l'osservazione diretta della dinamica di eliminazione, fornendo indicazioni per la selezione del bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce un'uscita quantitativa basata sull'immagine per l'inglobamento delle particelle apoptotiche, consentendo la standardizzazione del saggio.
- Valore operativo: Facilita la preparazione di sistemi biologici validati (embrioni di Drosophila) per lo screening riproducibile di composti.
- Scalabilità: Permette il riutilizzo della piattaforma mediante acquisizione temporale con microscopia confocale dell'attività fagocitica nel sistema nervoso centrale e nei tessuti periferici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega gli approfondimenti meccanicistici della fase di scoperta a modelli preclinici di infiammazione e neurodegenerazione.
- Allineamento dei biomarcatori: Permette di correlare l'attività fagocitica con potenziali biomarcatori traslazionali dell'efficienza di clearance.
- Avanzamento con valutazione del rischio: Guida le decisioni di proseguimento o interruzione dello sviluppo rivelando difetti nella clearance delle cellule apoptotiche che potrebbero prevedere esiti patologici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto attivo, in particolare per la modulazione delle vie fagocitiche in contesti patologici.
- Biologia della Scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici mediante la visualizzazione in tempo reale della fagocitosi mediata da cellule gliali e macrofagi di cellule apoptotiche.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso protocolli standardizzati di preparazione e iniezione dell'embrione per l'esposizione a composti.
- Analisi: Genera dati quantitativi di imaging confocale sulla localizzazione delle particelle apoptotiche e sul comportamento dei fagociti nel tempo.
- Ricerca Translazionale: Collega le osservazioni di imaging in vivo alla continuità preclinica in modelli in cui difetti di eliminazione contribuiscono alla malattia.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile per lo studio di meccanismi conservati di morte cellulare ed eliminazione in diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità nell'interpretazione del meccanismo fagocitico.
- Valore operativo: Promuove standardizzazione e riproducibilità attraverso parametri definiti di stadio embrionale, iniezione e acquisizione di immagini.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo la rilevazione precoce di modulatori inefficaci della rimozione cellulare.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio dei bersagli basandosi sulla validazione funzionale dell'attività fagocitica in vivo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio di Drosophila, nell'iniezione di embrioni e nella microscopia confocale.
- È dipendente da linee di moscerini transgenici che esprimono GFP nei fagociti e dall'accesso a reagenti per l'etichettatura delle cellule apoptotiche.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro per lo stadio degli embrioni, la coerenza delle iniezioni e le impostazioni di acquisizione delle immagini.
- Le considerazioni per l'adattamento includono marcatori specifici del modello per fagociti e cellule apoptotiche in altri sistemi.
- I limiti pratici includono la vitalità degli embrioni dopo l'iniezione e lo sbiancamento fluorescente durante l'acquisizione prolungata di immagini in time-lapse.
