Identificazione dei Bella Addormentata Inserimenti trasposone nei tumori solidi utilizzando Linker-mediata PCR
1 febbraio 2013
Un metodo di identificazione conducenti sconosciuti di carcinogenesi utilizzando un approccio imparziale è descritto. Il metodo utilizza l' Bella Addormentata Trasposone come mutageno casuale diretto a tessuti specifici. Mappatura genomica di inserzioni di trasposoni che guidano la formazione del tumore identifica nuovi oncogeni e geni oncosoppressori
Questa procedura mostra come identificare nuovi oncogeni e geni oncosoppressori mappando la trasposizione sulle inserzioni nel topo che guidano la formazione del tumore. Ciò si ottiene generando e raccogliendo prima i tumori dal modello murino transgenico. I passaggi successivi della procedura consistono nell'isolare il DNA tumorale, eseguire la PCR mediata dal linker, quindi sequenziare i campioni di DNA amplificato e analizzare la trasposizione sulle inserzioni.
In definitiva, la procedura identifica i geni candidati del tumore. Il vantaggio principale dell'utilizzo della PCR mediata da linker in combinazione con uno screening genetico imparziale utilizzando i trasposoni della bella addormentata, è che possiamo facilmente identificare nuovi driver genetici del cancro. Iniziare sempre la dissezione spruzzando l'esterno del topo sacrificato con etanolo al 70%.
I tessuti e i tumori raccolti devono essere divisi in quattro sezioni, di dimensioni comprese tra 50 e 100 milligrammi. Fissare una sezione in formina tamponata al 10% per 18 ore, seguita da etanolo al 70%. Questa sezione può essere utilizzata per la colorazione h ed e e/o l'immunoistochimica.
Congelare a scatto le sezioni rimanenti in azoto liquido. Questi possono essere conservati in un congelatore e utilizzati per il D-N-A-R-N-A e l'isolamento delle proteine per raccogliere il DNA da un campione tumorale congelato. Per prima cosa tritare finemente il fazzoletto con una lama di rasoio.
Successivamente, digerire il tessuto in una provetta da 1,5 millilitri con un millilitro di tampone di lisi cellulare e cinque microlitri da 20 milligrammi per millilitro. La soluzione di proteasi K agita accuratamente la miscela e procede con un'estrazione standard del DNA a base di isopropanolo. Inizia questo protocollo ricuocendo i linker in un tubo da 1,5 millilitri.
Mescolare 50 microlitri di ciascuna soluzione di linker con due microlitri di cloruro di sodio concentrato. Quindi posizionare il tubo in un blocco termico a 95 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, spegni il fuoco e lascialo raffreddare lentamente a temperatura ambiente, che può richiedere un'ora o più dopo il raffreddamento.
I linker anali possono essere conservati nel congelatore fino al momento del bisogno. Preparare 2 piastre da 96 pozzetti di Ali citando un microgrammo di DNA da ciascun campione nei pozzetti corrispondenti in entrambe le piastre da 96 pozzetti. Ad esempio, posizionare un microgrammo di DNA dal campione uno nel pozzetto A una delle piastre di entrambi i pozzetti.
Il DNA in una delle piastre a 96 pozzetti sarà digerito utilizzando l'enzima NLA tre sul lato destro e digerirà i campioni di DNA nell'altra piastra a 96 pozzetti utilizzando l'enzima BFA uno sul lato sinistro. Lascia che il DNA venga digerito durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, terminare la digestione a caldo, inattivando gli enzimi per 20 minuti.
Ora pulisci le reazioni di digestione usando una mini piastra da 96 pozzetti. Utilizzando la pipetta multicanale, trasferire ogni campione nel mini bottino. Piastra a 96 pozzetti.
Posizionare la piastra mini loot 96 pozzetti in un collettore a vuoto. Applicare un vuoto sulla piastra fino a quando i pozzetti non sembrano asciutti. In genere, 15 minuti durante questo protocollo.
È necessario prestare molta attenzione a non contaminare i campioni. Quando si lavora con 96, le piastre a pozzetti mantengono i pozzetti coperti il più possibile con tappi ed evitano di passare la pipetta sopra i pozzetti aperti perché qualsiasi goccia di liquido indesiderato può rovinare il campione. Rimuovere la mini piastra di bottino dal collettore del vuoto e bloccare il fondo della piastra con carta assorbente fino a quando non è completamente asciutto.
Risospendere il DNA nel mini bottino. Piastra a 96 pozzetti aggiungendo 30 microlitri di acqua distillata doppia a ciascuno. Posiziona bene il mini piatto del bottino su uno shaker orbitale impostato al massimo per due minuti.
Quindi, trasferisci il contenuto della mini piastra di bottino su una piastra pulita da 96 pozzetti. Per eseguire le reazioni di legatura del linker. Preparare la reazione di legatura mescolando una quantità sufficiente di tampone di legatura, un linker inginocchiato dal passaggio 3.2 T quattro DNA ligasi e acqua in un serbatoio di reagente.
Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 10 microlitri di DNA digerito dal passaggio precedente in una nuova piastra da 96 pozzetti. Quindi utilizzare una pipetta multicanale per Eloqua 10 microlitri della reazione di legatura a tutti i pozzetti della piastra a 96 pozzetti. Dopotutto, i pozzetti sono stati caricati con DNA e reagenti di legatura.
Incubare la piastra per quattro ore o tutta la notte a 16 gradi Celsius. La mattina dopo. Terminare la legatura inattivando la T quattro ligasi a 65 gradi Celsius per 10 minuti.
Come prima, pulisci la reazione di legatura usando mini piastre di bottino e un collettore sottovuoto per asciugare la piastra e poi tampona il fondo della piastra fino a quando non è completamente asciutto. Risospendere il DNA in 30 microlitri di acqua doppia distillata. Posizionare su uno shaker orbitale per due minuti, quindi trasferire il contenuto del mini loot plate su un piatto pulito.
Successivamente, eseguire una seconda digestione del DNA con bam H one per distruggere i restanti trasposoni di concat. Digerire il DNA a 37 gradi Celsius per tre-sei ore o durante la notte, quindi la digestione viene ripulita utilizzando mini piastre di bottino seguendo la stessa procedura di prima. Eseguire una PCR a 30 cicli utilizzando un primer specifico per la trasposizione e un primer specifico per il linker.
La reazione dovrebbe contenere tre microlitri di DNA digerito con linker. Quindi, ripulisci la reazione PCR usando il mini bottino. Piastre a 96 pozzetti e un collettore a vuoto come eseguito in precedenza.
Risospendere il DNA in 30 microlitri di acqua e trasferire le sospensioni a 96 pulite. Bene giocato procedere diluendo due microlitri dei prodotti di reazione PCR in 148 microlitri di acqua doppia distillata utilizzando solo due microlitri di prodotti diluiti. Eseguire 30 cicli di PCR utilizzando versioni nidificate dei primer in volumi da 100 microlitri.
Questi primer sono per la macchina Illumina GA two X. Ogni campione avrà un codice a barre univoco di 12 coppie di basi dell'esecuzione PCR, 45 microlitri di ciascun prodotto su un gel all'1% con bromuro AUM. Dovrebbe esserci uno striscio di prodotti PCR che rappresentino gli ampliconi delle diverse inserzioni di trasposoni nel tumore.
Utilizzare il metodo di lavaggio sottovuoto descritto in precedenza per pulire i restanti 50 microlitri di PCR, quindi risospendere il DNA in 50 microlitri di acqua ed eseguire nuovamente il lavaggio con aspirapolvere. Ora Resus, sospendi il DNA in 30 microlitri di TE e trasferiscilo in una piastra pulita a 96 pozzetti. Determinare la concentrazione di DNA in ciascun campione.
Quindi combina quantità uguali di DNA da ciascun campione in un'unica provetta. È possibile sequenziare diverse centinaia di campioni di DNA in una singola corsia di una corsa Illumina, purché ogni campione sia stato generato utilizzando un primer con codice a barre distinto utilizzando il protocollo. Un L-M-P-C-R di successo dovrebbe amplificare centinaia di trasposizioni sulle inserzioni in un singolo tumore dopo aver eseguito metà del prodotto secondario della PCR su un gel all'1%, uno striscio di DNA rappresenta questa amplificazione.
Se la LM PCR non ha successo, ci sarà un'assenza dello striscio di DNA. Invece, vedrai bande definitive di sequenziamento del DNA da uno a 200 tumori in una singola corsia della piattaforma Illumina GA due X dovrebbero produrre oltre 30 milioni di sequenze di 100 coppie di basi ciascuna durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordarsi di lavorare lentamente e con attenzione per assicurarsi che non si verifichino contaminazioni dopo questa procedura.
L'analisi dei driver genetici del cancro appena scoperti può essere eseguita per rispondere a ulteriori domande come, quale di questi driver potrebbe essere preso di mira per la terapia?
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per identificare nuovi oncogeni e geni soppressori dei tumori attraverso la mappatura delle inserzioni di trasposoni in un modello murino. L'approccio utilizza il trasposone Sleeping Beauty come mutageno casuale, permettendo la scoperta di driver genetici del cancro.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Carcinogenesi
- Mappatura genomica
- Biologia dei trasposoni
Sfondo
- La carcinogenesi coinvolge alterazioni genetiche complesse.
- I trasposoni possono servire come strumenti per la mutagenesi.
- L'identificazione dei geni driver è cruciale per comprendere il cancro.
- La PCR mediata da linker migliora il rilevamento delle inserzioni di trasposoni.
Obiettivo dello studio
- Identificare driver sconosciuti della formazione dei tumori.
- Utilizzare un approccio di screening genetico non di parte.
- Mappare le inserzioni di trasposoni nel DNA tumorale.
Metodi utilizzati
- Generazione di tumori in un modello murino transgenico.
- Isolamento del DNA tumorale dai tumori raccolti.
- PCR mediata da linker per amplificare campioni di DNA.
- Sequenziamento e analisi delle inserzioni di trasposoni.
Principali risultati
- Identificazione di candidati geni driver del tumore.
- Sono stati scoperti nuovi oncogeni e geni soppressori dei tumori.
- Il metodo si è dimostrato efficace nella mappatura delle alterazioni genetiche.
Conclusioni
- Il trasposone Sleeping Beauty è uno strumento prezioso per la ricerca sul cancro.
- Questo metodo permette l'identificazione non di parte dei driver genetici.
- Studi futuri possono basarsi su questi risultati per esplorare i meccanismi del cancro.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Identifying genetic drivers of cancer remains a critical challenge in early discovery due to high background noise from passenger mutations. The Sleeping Beauty transposon system combined with linker-mediated PCR enables unbiased forward genetic screens in mice to pinpoint candidate oncogenes and tumor suppressor genes. This approach supports target validation by reducing mechanistic ambiguity and improving predictive confidence in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through functional mutagenesis in vivo.
- Operational Value: Directs transposition to specific cell types using Cre-lox systems for tissue-specific target validation.
- Predictive Value: Identifies genes within common insertion sites as high-confidence cancer drivers for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates hundreds of distinct amplicons per tumor representing transposon insertion sites for downstream analysis.
- Reproducibility: Uses standardized linker-mediated PCR and nested PCR steps to ensure consistent detection across samples.
- Scalability: Supports multiplexed sequencing of hundreds of tumor samples in a single Illumina lane via barcoded primers.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models genetic heterogeneity observed in human tumors by capturing diverse insertion profiles across multiple tumors.
- Translational Continuity: Links discovery-phase mutagenesis to preclinical validation by identifying genes amenable to therapeutic targeting.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes driver from passenger mutations through statistical analysis of common insertion sites.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification by providing genetically validated targets from in vivo screens.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via unbiased forward genetic screens that reduce background noise from passenger mutations.
- Screening: Delivers assay-ready DNA samples with quantitative outputs suitable for insertion site mapping and sequencing.
- Analytics: Enables statistical identification of common insertion sites to prioritize candidate cancer genes.
- Translational Research: Connects in vivo mutagenesis to target validation by revealing genes with potential therapeutic relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for genetic screening across multiple cancer models and tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by linking transposon insertions to tumorigenic potential.
- Operational Value: Standardizes detection of transposon insertions through optimized linker-mediated PCR workflows.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions by providing in vivo functional evidence for target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by distinguishing driver genes from genomic background.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse genetics, transposon biology, and molecular biology techniques.
- Dependent on access to PCR instrumentation, gel electrophoresis, and sequencing platforms.
- Necessitates standardized protocols for DNA isolation, linker annealing, and enzymatic digestion across sample sets.
- Involves adaptation considerations when applying the system to different Cre driver lines or tumor models.
- Includes practical limitations such as the need for sufficient tumor yield and careful avoidance of cross-contamination during multi-step processing.
