Name: Misurazione della tattile Allodinia in un modello murino di prostatite batterica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Scopri come misurare l'allodinia tattile in un modello murino di prostatite batterica con UPEC. Questo metodo utilizza cateterismo intrauretrale e filamenti von Frey per quantificare il dolore pelvico cronico.

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1. Preparazione per l&#39;inoculo batteri mouse Devono essere effettuata in condizioni asettiche. <ol><li> Prendere una 17 x 100 provette di polipropilene mm con tappi e aggiungere 3 ml di brodo fresco Luria (LB) media. Con punte autoclave, prendere un po &#39;congelato stock in glicerolo batteri del ceppo CP1 2 e trasferire una piccola quantità della cultura nella provetta contenente il supporto LB. Sostituire il tappo del tubo in modo che l&#39;ossigeno è ancora in grado di entrare nel tubo - la cultura ha bisogno di crescere in condizioni aerobiche. Tubo a 37 ° C in un incubatore agitazione a 220 rpm overnight. </li><li> Il giorno successivo, trasferire 5 ml di coltura durante la notte in una nuova provetta con supporti ml 3 LB e crescere in condizioni statiche in un incubatore notte a 37 ° C. </li><li> Il giorno 3 di trasferimento 40 microlitri della cultura in aa tubo da 50 ml contenente 40 ml ciascuno dei media LB. Mettere in una notte a 37 ° C statico incubatore. </li><li> Accendere e impostare centrifuga a 4 ° C.Una volta che ha raggiunto la temperatura centrifuga finale, trasferire ogni 40 ml di coltura in una provetta da centrifuga 40 ml Nalgene. </li><li> Pesare tubi per bilanciare centrifuga - regolare il volume con i media LB, se necessario. Spin tubi a 6.000 rpm per 20 min. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante e delicatamente sospendere pellet batterico in 40 ml di PBS sterile. </li><li> Ripetere il punto 1.5 con PBS. </li><li> Aspirare il surnatante e sospendere off batteri in 500 microlitri di PBS sterile. Trasferire la soluzione in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml. Prelevare 10 ml di sospensione e diluire in 990 ml di ghiacciata PBS. Usare uno spettrofotometro per leggere le OD 420 nm per determinare il volume necessario per inoculazione. Per determinare il volume appropriato di ghiacciata PBS di sospendere pellet in: Prendere l&#39;OD 420 nm numero (in ml) e sottrarre il volume stimato del pellet batterico [es. OD 420 nm = 0,545, pellet di circa 0,075 ml. 0,545-0,075 = 0,470]. </li><li> Rimuovere 10 pl di sospensione di batteri e diliuto nel 990 microlitri ghiacciata PBS. Leggi le nm 420 OD. L&#39;obiettivo è quello di raggiungere un valore di nm OD 420 per la sospensione diluita di 1.000 ± 0,010. Se il numero della diluizione è al di sopra di tale obiettivo, aggiungere più volume alla sospensione e prendere un&#39;altra lettura. Se il numero è inferiore al 0,990 poi centrifugare la sospensione e ripetere la lettura OD 420 nm fino ad ottenere lettura desiderata. </li></ol> 2. L&#39;infezione degli animali Mice (5-7 settimane di vita, dieci per gruppo) sono stati acquistati dalla Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). <ol><li> I topi vengono anestetizzati per inalazione del 1-4% isoflurano in una camera di plexiglas e sono controllati fino a quando reclinata. </li><li> Un mouse alla volta viene preso per instillazione di batteri tramite cateterismo con polietilene (PE10) catetere attaccato ad un ago 30 G modificata di una siringa Hamilton vetro (lunghezza di 1,5-2,0 cm). Il catetere viene inserito al mozzo dell&#39;ago. Il mouse è placed sulla sua superficie dorsale in anestesia mantenute usando un cono. </li><li> Il pene del mouse viene estrusa con una leggera pressione e la quantità di lubrificante liberali su tamponi di cotone viene utilizzato per la lubrificazione di l&#39;ingresso dell&#39;uretra peniena. </li><li> 10 pl di PBS contenente 1 x 10 8 batteri viene introdotto nell&#39;uretra di topi anestetizzati dopo cateterizzazione. </li><li> I topi vengono mantenuti in uno stato anestetizzato per 15 min nella camera plexiglas dopo introduzione batterica per consentire attacco batterico e di prevenire la minzione immediata. </li><li> I topi vengono rimesse nelle loro gabbie e monitorato per le successive 24 ore. </li></ol> 3. Comportamento Test I topi sono stati testati prima dell&#39;infezione (basale) e nei giorni 3, 7, 14, 21 e 28 dopo l&#39;infezione. Cui iperalgesia e allodinia tattile è stato testato utilizzando von Frey filamenti applicato sull&#39;addome 11,12 e il r plantareEgion della zampa posteriore 13. Il test è stato perfomed in un determinato momento della giornata, metodologia standard e test sperimentatore unico di tutti gli animali sono stati impiegati. Accecato test dei gruppi è stato utilizzato per combattere le limitazioni di comportamento basato su test del dolore in modelli animali. Cinque filamenti singoli von Frey con forze di 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 e 4,0 g (Stoelting, USA) sono stati applicati al ventre e frequenza delle risposte ritiro è stato calcolato. <ol><li> Dopo un periodo di 30 minuti di acclimatazione, i topi sono posti in camere singole plexiglas (6 x 10 x 12 cm) realizzati in casa con un pavimento in acciaio griglia di filo di acciaio. </li><li> Riferito iperalgesia e allodinia tattile sono stati testati utilizzando i cinque filamenti di von Frey. Ogni filamento è stato applicato per 1-2 sec con un inter-stimolo intervallo di 5 secondi per un totale di 10 volte, ed i peli sono stati testati in ordine crescente di forza. </li><li> Ogni filamento è applicato alla zona addominale inferiore in prossimità generale della prostata ecura è stata presa per stimolare diverse aree all&#39;interno di questa regione per evitare di desensibilizzazione o &quot;liquidazione&quot; effetti. Filamenti sono stati applicati in ordine crescente di forza per 1-2 secondi con intervalli di almeno 5 secondi tra stimoli per un totale di 10 volte. </li><li> Tre tipi di comportamento sono considerati una risposta positiva alla stimolazione filamento: 1) retrazione acuto dell&#39;addome; 2) leccare immediata o graffiare dell&#39;area di stimolazione filamento; 3) salto. </li><li> Risposta in frequenza è stata calcolata come percentuale di risposta positiva (di 10, ad esempio 5 risposte di 10 = 50%) e di dati è stata riportata come percentuale media di risposta in frequenza ± SE </li><li> Animali con più di 25 risposte positive totale basale sono esclusi dallo studio. </li><li> Allodinia tattile è stato testato sulla regione plantare della zampa posteriore con filamenti di von Frey con le forze di 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 e 4,0 g. La soglia media di ritiro al 50% (5) è stata valutata utilizzando il up-downmetodo in cui è stato avviato il test con 0,04 g filamento applicata perpendicolarmente alla superficie plantare della zampa posteriore finché il filamento leggermente piegate. Filamenti sono stati testati in ordine ascendente fino una risposta positiva è stata osservata. Una risposta positiva al filamento è stata definita come un brusco ritiro della zampa o leccare della zampa test. Quando una risposta positiva è stata registrata successivo filamento più debole è stato applicato, e se una risposta negativa è stata osservata, quindi il successivo filamento forte è stato applicato. </li><li> Gli esperimenti e le metodologie descritte sono stati esaminati e approvati dalla cura degli animali Northwestern University e utilizzare comitato. </li></ol>

<ol><li>Yamamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiology+of+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+infection+and+chemotherapy+official+journal+of+the+Japan+Society+of+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiology of uropathogenic Escherichia coli.</a> Journal of infection and chemotherapy official journal of the Japan Society of Chemotherapy. 13, 68-73 (2007).</li>
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<li>Taguchi, O., Kojima, A., Nishizuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+prostatitis+after+neonatal+thymectomy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+experimental+immunology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune prostatitis after neonatal thymectomy in the mouse.</a> Clinical and experimental immunology. 60, 123-129 (1985).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Infezione della prostata mouse con UPEC consente la modellazione in vivo di eventi che possono essere coinvolte nella patogenesi della prostatite batterica, CP / CPPS o come un evento predisponente infiammazione cronica. I metodi descritti per la preparazione di batteri e instillazione pareggio su un vasto corpo di letteratura sui modelli UPEC nelle infezioni del tratto urinario femminile 7,14. Il modello dispone di ampia applicabilità per studiare la patogenesi, la sperimentazione vaccini candidati ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Cultura tubi </td><td> BD Falcon </td><td> 352059 </td></tr><tr><td> LB Broth Miller </td><td> EMD </td><td> EM1.10285.0500 </td></tr><tr><td> Tubi per centrifuga Nalgene </td><td> Thermo </td><td> 3118-0050 </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Butler Schein </td><td> NDC 11695-6776-1 </td></tr><tr><td> Catetere ago 30G </td><td> Hamilton </td><td> 91030 </td></tr><tr><td> PE10 tubi </td><td> BD intramedic </td><td> 427400 </td></tr><tr><td> Von Frey filamenti </td><td> Stoelting </td><td> 58025-31 </td></tr></tbody></table>

misurazione della tattile allodinia in un modello murino di prostatite batterica

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Uropatogeni Escherichia coli (UPEC) sono agenti patogeni che svolgono un ruolo importante nelle infezioni delle vie urinarie e prostatite batterica 1. Abbiamo recentemente dimostrato che UPEC hanno un ruolo importante nell&#39;avvio di dolore pelvico cronico 2, una caratteristica di prostatite cronica / sindrome dolorosa pelvica cronica (CP / CPPS) 3,4. L&#39;infezione della prostata da parte UPEC clinicamente rilevante in grado di avviare e definire il dolore cronico attraverso meccanismi che possono comportare danni ai tessuti e l&#39;avvio di meccanismi di autoimmunità 5. Una sfida per comprendere la patogenesi della UPEC nella prostata è relativa inaccessibilità della prostata alla manipolazione. Abbiamo utilizzato un metodo precedentemente descritto infezione intrauretrale 6 per fornire un ceppo clinico di UPEC in topi maschi stabilendo, quindi un&#39;infezione ascendente della prostata. Qui, descriviamo i nostri protocolli per uniformare le bacterial inoculo 7 nonché la procedura per la cateterizzazione anestetizzati topi maschi per instillazione di batteri. CP / CPPS è principalmente caratterizzata dalla presenza di allodinia tattile 4. Test comportamento era basato sul concetto di iperalgesia cutanea risultante da cui 8-10 dolore viscerale. Un focus irritabile nei tessuti viscerali riduce la soglia del dolore cutaneo che consentano una risposta esagerata al normalmente non dolorosi stimoli (allodinia). Applicazione della forza normale al risultato pelle in risposte anomale che tendono ad aumentare con l&#39;intensità del dolore viscerale sottostante. Descriviamo metodologia in NOD / ShiLtJ topi che utilizzano fibre di von Frey quantificare allodinia tattile nel tempo in risposta ad una singola infezione con batteri dell&#39;UPEC.

<html> Abbiamo esaminato topi NOD / ShiLtj e maschi C57BL/6J per la presenza di dolore cronico dopo infezione batterica. Topi maschi (5 a 7 settimane di età) sono stati instillati con soluzione salina o batteri nell&#39;uretra (Figura 1). Stimolazione meccanica della zona pelvica con von Frey filamenti di soluzione salina-instillato topi C57BL/6J e UPEC topi infettati C57BL/6J portato ad una risposta in frequenza che non è cambiato durante i 28 giorni di corso dell&#39;esperimento (Figura 1).</st...

L&#39;infezione della prostata può essere un fattore che contribuisce a mediare dolore pelvico in prostatite cronica. Descriviamo la procedura per la preparazione di standard inoculo batterico, l&#39;instillazione di batteri nell&#39;uretra di topi maschi e la metodologia per la misurazione allodinia tattile nei topi nel corso del tempo.

Misurazione della tattile Allodinia in un modello murino di prostatite batterica

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'allodinia tattile in un topo derivante da un'infezione batterica della prostata. Ciò si ottiene preparando prima una sospensione batterica per l'installazione in un topo maschio che viene posto sotto anestesia. Il secondo passo consiste nell'estrudere delicatamente il pene del topo, seguito dal cateterismo intrauretrale.Successivamente, i batteri vengono instillati e avviano un'infezione ascendente della prostata del topo. La fase finale è la misurazione dell'allodinia tattile dopo l'infezione. In definitiva, l'aumento della frequenza di risposta alle fibre vray applicate all'area pelvica viene utilizzato per mostrare un aumento dell'elo DIA tattile della regione pelvica in risposta alla prostatite batterica.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la prostatite del percorso ormonale o la prostatite autoimmune, se utilizza batteri clinicamente irrilevanti e una metodologia di infezione ascendente naturale che sono davvero importanti per la patogenesi della malattia della prostata, in generale, gli individui che sono nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa dell'incapacità di registrare costantemente risposte positive alla stimolazione delle fibre vray. Tutte le procedure di questo protocollo devono essere eseguite secondo le linee guida dell'istituzione e del governo. I test per l'iperalgesia riferita e l'allodinia tattile vengono eseguiti a un'ora fissa del giorno utilizzando la metodologia standard con un singolo sperimentatore che testa tutti gli animali.I test alla cieca dei gruppi dovrebbero essere utilizzati per combattere i limiti dei test del dolore basati sul comportamento nei modelli animali. Per ottenere una misurazione di base per tutti gli animali dell'esperimento, prima acclimatare topi maschi di 5-7 settimane nella sala di prova per 30 minuti, quindi posizionare ogni topo in una camera di plexiglass individuale con un pavimento a griglia in filo di acciaio inossidabile per testare l'allodinia tattile. Applicare singoli filamenti von Fray con forze di 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 e 4,0 grammi sulla zona addominale inferiore in prossimità della prostata.Applicare ciascun filamento in ordine crescente di forza per uno o due secondi con intervalli di almeno cinque secondi tra le stimolazioni per un totale di 10 volte. Fare attenzione a stimolare diverse aree all'interno di questa regione per evitare la desensibilizzazione o gli effetti di chiusura. Tre tipi di comportamento sono considerati una risposta positiva alla stimolazione dei filamenti.Una forte retrazione dell'addome, due, leccata o graffio immediato dell'area di stimolazione del filamento. Tre. I salti calcolano la frequenza di risposta come percentuale di risposta positiva e riportano i dati come percentuale media di risposta. Frequenza più meno errore standard.Gli animali con più di 25 risposte positive al basale sono esclusi dallo studio per esaminare la specificità della risposta allodinia. La risposta tattile allodinia della regione dei pori viene testata immediatamente dopo il test dell'area pelvica applicando i filamenti di von Frey alla regione della fioriera del poro posteriore fino a quando il filamento non si piega leggermente. Testare i filamenti in ordine crescente fino a quando non si osserva una risposta positiva definita come un brusco ritiro o leccamento del poro di prova.Dopo aver osservato una risposta positiva, applicare il filamento più debole per identificare la fibra con la massima quantità di forza che non evoca alcuna risposta. Innanzitutto, preparare il catetere inserendo un catetere in polietilene nel mozzo di un ago calibro 30 collegato a una siringa Hamilton di vetro da 1,5 a due centimetri caricata con la sospensione batterica dopo l'anestesia con uno o 4% di fluoro in una camera di plexiglass. Trasferire le quantità su un cono del naso lato dorsale verso il basso per il mantenimento dell'anestesia, estrudere il pene applicando una leggera pressione.Quindi, utilizzando un batuffolo di cotone, applicare una quantità generosa di lacrime artificiali come lubrificante all'ingresso dell'uretra del pene. Inserire con cautela il catetere nell'uretra. Quindi introdurre nell'uretra 10 microlitri di PBS contenente uno volte 10 agli otto batteri CP one decomprimendo lentamente lo stantuffo della siringa.Una volta somministrata la sospensione batterica, rimuovere con cautela il catetere. Rimetti il topo nella camera di anestesia per 15 minuti per consentire l'adesione dei batteri e prevenire la minzione immediata. Trascorsi i 15 minuti, riposizionare il mouse nella gabbia di casa e monitorare per le successive 24 ore.Ripetere il test per l'iperalgesia riferita e le risposte tattili allodiniche a intervalli adeguati. Si raccomanda di eseguire il test nei giorni 3, 7, 14, 21 e 28 dopo l'infezione. Gli EAL tattili hanno misurato le sue risposte alla stimolazione meccanica della regione pelvica utilizzando filamenti di Von Fray di cinque forze calibrate.I dati sono riportati come percentuali medie di risposte positive. Inoltre, l'errore standard prima dell'installazione dei batteri e nei giorni 7, 14, 21 e 28 e oltre post-infezione ha indicato un aumento significativo della frequenza di risposta nei giorni da sette a 28 dopo l'infezione rispetto a quella basale per tutti i filamenti testati nei topi infetti da UPEC. La percentuale di risposta a ciascun PID è stata calcolata come risposte totali a tutte le fibre rispetto alle risposte basali.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come avviare la prostatite batterica nei topi maschi, seguita da test comportamentali per misurare la nia tattile pelvica in questi topi.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Le misurazioni elettroniche di von Frey sono un'alternativa efficace e migliorata ai classici filamenti di von Frey, in quanto consentono una misurazione rapida e precisa dei cambiamenti nelle soglie di prelievo meccanico dei roditori agli stimoli di pressione applicati continuamente prima e dopo un evento infiammatorio.

Misurazione dei cambiamenti nella sensibilità tattile nella zampa posteriore dei topi utilizzando un apparecchio elettronico di von Frey

Descriviamo un protocollo di esaminare lo sviluppo di iperalgesia indotta da oppioidi e tolleranza nei topi. Sulla base della misurazione di risposte nocicettive termica e meccanica di capre e morfina-trattata, consente di quantificare l'aumento della sensibilità al dolore (iperalgesia) e diminuire in analgesia (tolleranza) associati alla somministrazione cronica di oppiacei.

Valutazione della morfina-indotta iperalgesia e analgesico tolleranza nei topi mediante nocicettive termica e meccanica Modalità

Il dolore neuropatico è una conseguenza di una lesione o malattia che colpisce il sistema somatosensoriale. Il "modello bracciale" del dolore neuropatico nei topi consiste nella impiantazione di un bracciale polietilene attorno al ramo principale del nervo sciatico. Allodinia meccanica è testato con filamenti di von Frey.

Il nervo sciatico ammanettare modello di dolore neuropatico nei topi

Stiamo misurando la sensibilità e l'albero di attivazione perigenitale cella meccanico nella prostata maschile C57BL / 6 topi che ha subito un paradigma di stress primi anni di vita - la separazione materna neonatale, al fine di indurre un modello preclinico di sindrome da dolore pelvico / cronico prostatite cronica.

Valutazione della perigenitale Sensibilità e prostatica Mast attivazione delle cellule in un modello murino di Neonatale separazione materna

Fornito qui è un protocollo che dettaglia i passi per stabilire un modello animale di dolore cronico post-ischemia (CPIP). Questo è un modello ben riconosciuto che imita la sindrome del dolore regionale complesso umano di tipo I. Vengono ulteriormente valutate le ipersensibilità meccaniche e termiche, così come i comportamenti nocifensivi indotti dalla capsaicina osservati nel modello di ratto CPIP.

Modello di dolore cronico post-ischemia per la sindrome del dolore regionale complessa Tipo-I nei ratti

Per sviluppare nuovi interventi terapeutici per la prevenzione e la gestione del mal di schiena, sono necessari modelli animali per esaminare i meccanismi e l'efficacia di queste terapie da una prospettiva traslazionale. Il presente protocollo descrive il test BMS, un metodo standardizzato per valutare la sensibilità meccanica posteriore nel ratto.

Valutazione della sensibilità meccanica nel ratto per l'indagine meccanicistica del mal di schiena cronico

I metodi per l'induzione semplice e rapida di un modello di mal di schiena nei topi sono forniti qui utilizzando un'iniezione intralegamentosa di attivatore del plasminogeno urinario.

Modello di mal di schiena di topo indotto dall'attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi

La legatura parziale del nervo sciatico induce dolore neuropatico cronico di lunga durata, caratterizzato da risposte esagerate agli stimoli termici e meccanici. Questo modello murino di dolore neuropatico è comunemente usato per studiare terapie innovative per la gestione del dolore. Questo articolo descrive in dettaglio la procedura chirurgica per migliorare la standardizzazione e la riproducibilità.

Legatura parziale del nervo sciatico: un modello murino di dolore neuropatico cronico per studiare l'effetto antinocicettivo di nuove terapie

Qui, presentiamo un protocollo per valutare la nocicezione in topi infettati da Trypanosoma evansi, utilizzando l'apparato elettronico di von Frey come strumento, misurando le soglie meccaniche della zampa posteriore e dei visceri.

Elettronico von Frey associato alla scala della smorfia del topo per valutare l'allodinia e il dolore nei topi infetti da Trypanosoma evansi

Il protocollo descrive come misurare l'iperalgesia del ginocchio nei topi. Mostriamo esempi in modelli murini di dolore acuto al ginocchio e in modelli di osteoartrite (OA).

Valutazione dell'iperalgesia del ginocchio nei topi utilizzando la misurazione dell'applicazione della pressione

Scopri come misurare l'allodinia tattile in un modello murino di prostatite batterica con UPEC. Questo metodo utilizza cateterismo intrauretrale e filamenti von Frey per quantificare il dolore pelvico cronico.

Misurazione della tattile Allodinia in un modello murino di prostatite batterica

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