Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre complessi proteici utilizzando il sistema di cellule di insetto del virus del baula multiplo. Ciò si ottiene generando prima il costrutto multi-gene, codificando il complesso proteico di scelta. Il secondo passo consiste nel creare un virus composito della baula che contenga il costrutto multigenico trasformando le cellule batteriche e lo screening per i corretti medi posteriori.

Successivamente, isolare il genoma virale della baula e utilizzarlo per infettare le cellule degli insetti su piccola scala in una piastra a sei pozzetti dopo aver testato la produzione di proteine. Il complesso proteico scelto viene espresso su scala più ampia e purificato. In definitiva, il complesso proteico purificato viene utilizzato per scoprire la sua struttura e funzione e potenzialmente per la scoperta di farmaci.

I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai sistemi echovirus esistenti sono duplici. I complessi MultiPro possono essere prodotti con un prodotto senza precedenti. Inoltre, il materiale prodotto è di qualità molto superiore perché progettiamo l'echovirus per una produzione ottimale di proteine.

Le implicazioni di questa tecnica vanno ben oltre le questioni biologiche di base. La nostra piattaforma multi-bag è stata utilizzata con successo per produrre proteine che sono promettenti nuovi candidati vaccini per una varietà di malattie e catalizzare la ricerca sul cancro producendo assemblaggi di proteine chiave che causano la crescita del tumore. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno un po' di difficoltà con i processi e la necessità di sterilità.

Per questo motivo abbiamo lavorato molto duramente per stabilire procedure operative standard per rendere l'applicazione del multi-bank il più semplice possibile per gli utenti non specializzati. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi robotici sono molto più facilmente comprensibili quando il processo viene mostrato in movimento. Questo non può essere estratto semplicemente guardando i protocolli che sono scritti, non importa quanto dettagliati.

Prima di iniziare questa procedura, è importante pianificare attentamente la strategia di co-espressione. Si consiglia di simulare prima l'esperimento. In silico.

I geni devono essere distribuiti sui plasmidi accettori e donatori. Ciò che funziona meglio è raggruppare le subunità che possono formare sottomoduli fisiologici. Poiché i grandi complessi hanno molte subunità proteiche, molti geni devono essere espressi contemporaneamente.

Il sistema multi back semplifica notevolmente la clonazione dei geni utilizzando routine automatizzate per posizionare i geni in piccole molecole progenitrici del DNA che contengono una breve sequenza di DNA chiamata blocchi P che viene riconosciuta dall'enzima ricombinasi Cree. Questi progenitori vengono poi combinati in una reazione in un unico passaggio aggiungendo la pre ricombinasi, che concatena tutto ciò che ha un sito lox P in un grande plasmide di DNA. Questo costrutto multi-gene viene successivamente inserito nel genoma del virus multi back bula.

Se si deve generare un gran numero di costrutti, si consiglia l'uso di script robotici e di una workstation per la manipolazione dei liquidi. La workstation è dotata di un vuoto per la mini preparazione e la pulizia della PCR, un'EEL per il caricamento automatico dei campioni PCR. Un termociclatore per PCR e fasi di incubazione, uno shaker per la sospensione di cellule e blocchi freddi in ripresa.

Per gli enzimi, i geni di interesse vengono inseriti in donatori e accettori selezionati utilizzando enzimi di restrizione e ligasi o, in alternativa, utilizzando metodi indipendenti dalla legatura convalidano tutti i costrutti di donatori e accettori, clonati mediante mappatura e sequenziamento delle restrizioni. Procedere con le combinazioni diffuse di donatori accettori mediante ricombinazione CRE LAX P per generare i costrutti di espressione multigenica di scelta. I costrutti multigenici assemblati sono convalidati mediante reazioni analitiche di PCR con set di primer appositamente progettati.

Qui sono mostrate le istantanee del processo TR assistito da robot. Esse comprendono la preparazione di reazioni PCR in piastre multipozzetto, la fornitura di DNA stampo e primer, l'amplificazione PCR di DNA e la preparazione di costrutti multigenici cresciuti in coltura batterica mediante lisi alcalina in piastre multipozzetto. Per iniziare questa procedura, integrare vettori di trasferimento multi-genico nel genoma virale multi-bula trasformandosi in cellule DH 10, ospitando il genoma virale e le funzionalità necessarie per la trasposizione di TN sette.

Dopo che TN sette cellule di trasposizione con virus composito baula contenenti i geni di interesse vengono selezionate mediante screening blu bianco La trasposizione riuscita di TN sette provoca una perdita di complementazione alfa del beta galatto. Pertanto, le colonie con corretta trasposizione TN sette rimangono bianche su APL selettive contenenti xal. Preparare colture batteriche dalle colonie bianche e isolare il dorso mediante lisi alcalina e precipitazione con etanolo isopropanolo.

Successivamente, trasfettare le cellule di insetto con il genoma virale bao purificato che lavora in una cappa sterile, semina aliquote di cellule di insetto SF 21 in fase logaritmica in una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti. A ciascuno, aggiungere il genoma virale bao purificato e un reagente di trasfezione mescolato in terreni di coltura. Incubare le cellule trasfettate a 27 gradi Celsius senza movimento per 48-60 ore.

Dopo 48-60 ore, raccogliere il virus iniziale o V zero rimuovendo il terreno, rabboccare con terreno fresco e rimettere la piastra nell'incubatore due o tre giorni dopo, testare la produzione di proteine. E se è presente un marcatore YFP, testare la fluorescenza per l'amplificazione del virus. Utilizzare V zero, il virus iniziale, per infettare da 25 a 50 millilitri di cellule in fase logaritmica in piccoli flaconi di agitazione di Erlenmeyer agitati su una piattaforma orbitale.

L'agitatore conta le cellule e le divide ogni 24 ore fino a quando non smettono di raddoppiare. Seguire un regime a bassa molteplicità di infezioni o MOI, le cellule devono raddoppiare almeno una volta, altrimenti ripetere l'esperimento con un volume minore di V zero aggiunto. L'immagine a sinistra mostra cellule di insetto non infette in seguito all'infezione con il virus multi back baula.

Le cellule degli insetti infetti hanno smesso di proliferare e sono aumentate di dimensioni, come illustrato dall'immagine a destra. Dopo 48-60 ore, raccogliere il virus V one pellettando le cellule. Rimuovere e conservare il supporto contenente il virus.

Resus sospendere le cellule con terreno fresco e trasferirle nuovamente nel pallone di Erlenmeyer. Rimuovere una volta da 10 a sei cellule ogni 12 o 24 ore mediante pellettatura e testare la produzione di proteine e il segnale proteico marcatore se si desiderano volumi di espressione maggiori. Amplifica ulteriormente il virus infettando fino a 400 millilitri di cellule in fiasche shaker da due litri con il virus V one.

Seguendo il regime MOI basso, raccomandiamo vivamente che il virus V one sia conservato come virus di produzione utilizzando le cellule di insetto infettate dal virus ulare o i metodi VIC per prevenire le modifiche del virus ricombinante e per preservare alti livelli di espressione. 24 ore dopo l'arresto della proliferazione si osservano cellule infettate da pellet. In questa fase, le cellule contengono particelle virali complete appena prima che vengano rilasciate nel terreno.

Rimuovere il terreno, risospendere il pellet cellulare in soluzione di congelamento ed eseguire il congelamento di BIIC in provette criogeniche per cicli di produzione di proteine. Utilizzare aliquote V uno, due o BIC congelate per infettare colture cellulari più grandi. In genere 400 millilitri in flaconi da due litri aderiscono al regime a basso MOI.

Regolare il volume del virus utilizzato per l'infezione in modo che la coltura infetta raddoppi almeno una volta. Se è presente una proteina marcatrice YFP, prelevare una volta 10 nelle sei cellule a intervalli definiti, sonicare e centrifugare le cellule e trasferirle in una piastra a 96 pozzetti misurare i livelli di YFP in un lettore di piastre standard a 96 pozzetti in grado di registrare segnali fluorescenti, monitorare l'evoluzione del segnale YFP fino al raggiungimento di un plateau, che indica la massima produzione di proteine ricombinanti. Raccogliere le cellule in questa fase, conservare i pellet cellulari a meno 20 gradi Celsius per il breve termine o meno 80 gradi Celsius per il lungo termine, le cellule devono essere liete con un metodo su misura per le esigenze della proteina e quindi del citosol e dei nuclei.

Le proteine nucleari frazionate si trovano tipicamente nel pellet nucleare. Mentre le proteine citosoliche rimangono nel citosol. La purificazione delle proteine è notevolmente semplificata dal frazionamento.

Poiché è possibile rimuovere molti contaminanti in un'unica fase di centrifugazione. I complessi proteici possono essere convenientemente purificati da colture cellulari iniziali su piccola scala utilizzando metodi di purificazione miniaturizzati come la purificazione multi-pozzetto o basata su micro punte. In combinazione con sistemi di cromatografia di piccolo volume come l'ACTA micro, un passo futuro sarà quello di miniaturizzare e integrare l'intera configurazione sperimentale in una piccola applicazione da tavolo interfacciata con la workstation di clonazione.

Qui è mostrato il robot batch su microscala attualmente in fase di sviluppo, che verrà utilizzato a questo scopo. Una forte co-espressione di proteine eterologhe è ottenuta dal sistema multi back, come mostrato qui. I divieti proteici sovraespressi sono chiaramente distinguibili nell'estratto di cellule intere, nel WCE e nel lisato chiarificato.

La qualità e la quantità del materiale proteico prodotto è spesso sufficiente. Consentire la determinazione strutturata di complessi proteici come il complesso del checkpoint mitotico MCC mostrato in questo diagramma. Spesso la resa di questi cicli di purificazione analitica è sufficiente per analizzare la struttura e la funzione del complesso purificato con una varietà di mezzi, tra cui la microscopia elettronica.

Le procedure operative standard che abbiamo sviluppato consentono agli utenti non specialisti di applicare il nostro approccio con facilità e la nostra tecnologia può essere utilizzata in molti laboratori interessati a complessi proteici di grandi dimensioni, proprio come avviene oggi per le piccole proteine di Nikola. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la multi bag per produrre i tuoi complessi proteici di interesse in quantità e qualità ineguagliabili per i tuoi ambiziosi obiettivi di ricerca. Lavorare con i nostri sistemi non richiede particolari condizioni di sicurezza.

Tuttavia, tieni presente che il virus ti infetterà se sei sciatto, anche se non si replicherà nelle tue cellule. Pertanto, un'attenta gestione delle condizioni di steroidi è un must durante l'esecuzione di questa procedura. Il nostro metodo è diventato molto popolare già in più di 600 laboratori in tutto il mondo.

Usa la nostra tecnica. Crediamo che in futuro il nostro metodo diventerà parte integrante degli sforzi di genomica strutturale su larga scala che affrontano la zona complessa umana. Questo può aiutare a rivelare le basi delle malattie e, a lungo termine, a portare a nuovi e migliori farmaci e terapie.