Quantificare le proprietà meccaniche del glicocalice endoteliale con microscopia a forza atomica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare le proprietà meccaniche del glicocalice endoteliale utilizzando un microscopio a forza atomica o un FM. Ciò si ottiene mediante la prima coltura, un monostrato di cellule endoteliali sotto un flusso fisiologico in un bioreattore, al fine di costruire lo strato di glicocalice come seconda fase. Le perle di dimensioni micron sono fissate a un cantilever FM e utilizzate come sonda per misurare la forza resistiva del corpo cellulare e del glicocalice durante l'indentazione. Successivamente, le curve di indentazione vengono adattate con un modello a due strati per determinare il modulo del glicocalice e si ottengono risultati di spessore che mostrano che il glicocalice endoteliale ha un modulo di 0,7 kilo pascal e uno spessore di 380 nanometri in base all'analisi dei due strati.

Ciao, sono Rick Wa.Sono titolare della cattedra di ingegneria biomedica presso l'Università di Rochester. Negli ultimi anni si è discusso molto sul possibile ruolo del glicocalice endoteliale nell'infiammazione, in particolare sul fatto che possa fungere da barriera protettiva per prevenire l'adesione cellulare indesiderata durante l'infiammazione. Una delle chiavi per risolvere le questioni che circondano questo problema è la capacità di misurare le proprietà fisiche, vale a dire lo spessore e la rigidità di questo strato, sia in condizioni normali che durante la risposta infiammatoria.

Sono Graham Marsh. Sono uno studente laureato presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università di Rochester. Il grosso problema nella caratterizzazione del glicocalice endoteliale è che è incredibilmente morbido.

L'approccio che abbiamo trovato è quello di fissare una grande perlina alla punta del cantilever A e A FM in modo che le forze misurate siano risolvibili con la A FM.To iniziare questa procedura, costruire una camera di flusso come quella mostrata qui, in grado di far crescere cellule sotto uno sforzo di taglio di 1,0 Pascal. Preparare la camera di flusso per l'esperimento pulendo prima i vetrini in soluzione piranha per 15 minuti. Sciacquatele tre volte con acqua distillata e asciugatele a 70 gradi Celsius per 30 minuti.

Quindi, rivestire i vetrini con amminopropil trixi, cy lane o apte per deposizione di vapore. Aggiungere un millilitro di apte a un pallone che è attaccato alla camera a vuoto con il campione. Quindi tappare il pallone e tirare un vuoto di 0,7 bar per un'ora.

Durante questo periodo, rinfrescare l'aspirapolvere tre volte. Quindi, tagliare una nuova guarnizione della camera di flusso da un foglio di silicone spesso 0,4 millimetri utilizzando uno strumento da taglio Silhouette SD. Il canale misura 6,4 millimetri di larghezza per 19 millimetri di lunghezza e il diametro esterno è tagliato a 35 millimetri in modo che possa entrare nel piatto di coltura dell'asilo.

Utilizzando queste dimensioni, calcolare la portata necessaria per generare una sollecitazione pura di un pascal con l'equazione mostrata qui. Q rappresenta la portata. La tau è lo stress puro.

Mu è la viscosità del mezzo. H è l'altezza del canale e W è la larghezza della camera di flusso. Il passo successivo consiste nell'allineare la parte superiore della camera di flusso con la guarnizione nel piatto di coltura cellulare e fissarla con un anello magnetico.

Collegare le porte di flusso nel piatto di coltura cellulare a tre valvole a onda con linee alle siringhe da 30 millilitri. Quindi sterilizzare l'intero gruppo sciacquando con alcol isopropilico per cinque minuti. Quindi rimuovere l'alcol e lasciarlo asciugare all'aria nel fazzoletto.

Cappuccio di coltura Preriscaldare il siero fetale di vitello al 4% nel mezzo di McCoy a 37 gradi Celsius. Dopo essere stato lasciato asciugare per cinque-10 minuti, sciacquare l'alcol rimasto con 30 millilitri di siero fetale di vitello preriscaldato. Quindi riempire le siringhe con 20 millilitri di terreno di crescita veek MCDB 1 31.

Quindi, tappare le siringhe per evitare contaminazioni. Quando si estrae il sistema dalla cappa sterile, montare il tappo del serbatoio di raccolta con l'ago che raggiunge il fluido per aspirare il fluido verso il serbatoio a monte. Infine, collegare filtri sterili da 0,2 micron alle prese d'aria sui tappi per raccogliere successivamente la vena ombelicale umana.

Cellule endoteliali cresciute fino alla confluenza in un pallone T 25. Risospendere le cellule pellettate a 100.000 cellule per millilitro in terreno e aspirare la soluzione in una siringa. Quindi iniettare la sospensione nella camera di flusso attraverso la valvola a tre vie.

Lasciare che le celle si depositino e aderiscano al substrato di vetro per due ore. Prima di iniziare il flusso, spostare il bioreattore e le cellule in un incubatore dove le cellule possono depositarsi e aderire per due ore. Il tubo che collega i serbatoi a una pompa peristaltica passa attraverso la parte posteriore dell'incubatore Una volta che le celle hanno aderito, impostare la pompa peristaltica sulla portata desiderata.

Il fluido si muove tra i serbatoi, creando un carico di pressione e un flusso attraverso il bioreattore che produce uno sforzo di taglio della parete di un pascal. Lasciare incubare le cellule con flusso continuo a 37 gradi Celsius per uno o cinque giorni fino a quando la camera non è confluente. Per iniziare la preparazione del cantilever, pulire una punta più un cantilever FM in acido nitrico per cinque minuti, seguito da un risciacquo con acqua distillata.

Una volta asciutto, funzionalizzare il cantilever con apdi in una camera di deposizione di vapore come precedentemente mostrato per i vetrini. Quindi preparare una soluzione di cinque milligrammi per millilitro in peso NHS Sulf O lc, biotina nella soluzione salina tamponata di Hank. Immergere i cantilever nella soluzione per 15 minuti.

Questa reazione coniuga il CY e l'ossido idrossilato finale e presenta molecole di biotina sulla superficie dei cantilever. Il giorno prima, iniziare a preparare una soluzione di terreno privo di biotina combinando 20 millilitri di terreno di coltura vexcel contenente il 20% di siero con 200 microlitri di perle rivestite di ENC strept e incubare per 12 ore ruotando. Il giorno dell'esperimento.

Tirare le perle magnetiche sul fondo della provetta con un magnete per due minuti e trasferire il surnatante contenente terreno privo di biotina in una nuova provetta. Sterilizzare il terreno facendolo passare attraverso un filtro da 0,22 micrometri e inserirlo in una nuova provetta. Il passo successivo consiste nel rimuovere la camera di flusso dalla piastra di coltura cellulare e quindi lavare le cellule tre volte con due millilitri di terreno privo di biotina a 37 gradi Celsius.

Quindi aggiungere un microgrammo di perline rivestite di Aden di 2,4 micrometri di diametro. Aggiungere una concentrazione di 10 microgrammi per millilitro nella piastra di coltura cellulare e mescolare delicatamente. Quindi, calibrare l'A FM tib attaccandolo a una perlina strippin e premendolo su una superficie di vetro liscia.

Per fare ciò, atterrare la punta sulla superficie di vetro accanto a una perlina, ritrarre la punta, quindi posizionare l'apice del cantilever sopra la perlina e premere per alcuni secondi. Infine, utilizzare il cantilever calibrato per far rientrare i campioni. Le perle da 2,4 micrometri offrono un'area di contatto più ampia con la superficie cellulare in modo che le proprietà meccaniche dello strato di glicocalice morbido possano essere rilevate più facilmente.

Per realizzare questa posizione, il cantilever su una cella vicino al nucleo della cella, utilizzare un approccio morbido della punta sulla cella per impostare l'altezza del cantilever a circa tre micrometri sopra la superficie della cella. Quindi indentare la superficie 20 volte a una velocità di un micrometro al secondo fino a una forza massima di sette. I nano newton consentono di trascorrere sei secondi di tempo tra i contatti successivi.

Calcola lo spessore dello strato di glicocalice utilizzando equazioni relative alla teoria di hertz. La forza di indentazione F è descritta da questa equazione dove delta è la profondità di indentazione. R è il raggio della sfera ed estar è il modulo combinato dei materiali sotto sforzo.

Al fine di separare il modulo elastico combinato estar in componenti cellulari e glicocalice, trattare lo strato di glicocalice come un film morbido uniforme e sottile sulla superficie del corpo cellulare e utilizzare il modello a due strati di Clifford e C.In questa equazione, PQ e N sono costanti determinate empiricamente dagli adattamenti del polimero. M è una costante del modello polimerico e Z è correlato allo spessore del film sottile o dello strato di glicocalice dall'equazione mostrata qui. La forza misurata dall'A FM misurata in nano Newton inizia ad aumentare dopo il contatto con la superficie ed è inizialmente dominata dalla componente dello strato di glicocalice.

Una volta che lo strato di glicocalice viene compresso, il corpo cellulare diventa il componente principale della deformazione. La linea di adattamento blu a due strati è stata calcolata adattando quattro parametri liberi per farla corrispondere ai dati di indentazione mostrati in rosso dall'equazione utilizzata: è possibile determinare il modulo cellulare, il glicocalice, il modulo di strato e lo spessore dello strato di glicocalice. Le proprietà di 25 cellule sono state compilate nell'istogramma mostrato qui.

Il modulo medio dello strato di glicocalice è stato determinato in 0,7 più o meno 0,5 kipa cal e lo spessore dello strato di glicocalice è stato determinato in 380 più o meno 50 nanometri. Questo approccio ci fornisce lo strumento di cui avevamo bisogno per rispondere a domande fondamentali sul ruolo del glicocalice nella regolazione dell'adesione cellulare durante l'infiammazione. Ora siamo in grado di rispondere alle domande su come le proprietà del glicocalice vengono alterate durante l'infiammazione.

Con quali mezzi vengono realizzati questi cambiamenti. Questo approccio può essere esteso in diversi modi. Ad esempio, si potrebbe usarlo per testare nuove e più sofisticate descrizioni teoriche delle proprietà del glicocalice.

Oppure, a un livello più pratico, si potrebbe essere in grado di utilizzarlo per testare rivestimenti superficiali bio-ispirati, progettati per proteggere i dispositivi impiantabili dalla risposta immunitaria nell'ospite. Grazie mille per il vostro interesse per il nostro lavoro.